利用荧光蛋白可视化和定量衣原体液泡生长动态的活细胞
2015年10月13日
描述了一种基于活细胞荧光蛋白的照明含有衣原体的细胞液泡（包涵体）的方法。该策略能够快速、自动地测定样品中的衣原体感染性，并可用于定量研究包涵体生长动力学。
该程序的总体目标是可视化和定量活细胞中的衣原体包涵体生长动力学。这是通过首先生成在其细胞质中稳定表达荧光蛋白（如 GFP）的荧光宿主细胞来实现的。接下来，宿主细胞被衣原体感染并允许孵育。
然后通过实时荧光显微镜观察感染的细胞。最后，通过显微镜分析软件对衣原体包涵体特征进行量化，最终使用实时荧光显微镜来可视化宿主细胞内的衣原体包涵体，并测量包涵体的生物学参数以获得定量结果。与基于抗体的计数等现有方法相比，该技术的主要优点是这种反向成像策略可用于活细胞，也可以与其他荧光标记物配合使用，以定量所有衣原体物种的包涵体动力学。
此外，与标记细胞中细菌的常规方法不同，这种方法照亮了活细胞中的包涵膜，因此可以揭示这种病原体包含隔室的重要动态特性。生成荧光 Hela 细胞后，根据文本方案板，GFP Hela 细胞在所需的培养容器上，例如用于高分辨率成像的玻璃底培养皿 用于 IFU 测定和多孔筛选的 4 个 24 孔板在冰上解冻含有 crich cotus 或任何其他所需衣原体菌株的冷冻管，并在 HBSS 中稀释至所需的感染复数。为了用 Crich Cotus 进行静态感染，LGV zero VL two 从孔中吸出培养基并使用 HBSS 洗涤 GFP hela 细胞。
将稀释的细菌加入孔中，在 25 摄氏度下孵育 2 小时，吸出细胞并用 HBSS 洗涤。然后在添加生长培养基后，将细胞在 37 摄氏度下在二氧化碳培养箱中孵育，以使用 crich 至 serovar D 或任何其他衣原体菌株进行离心辅助感染。使用 HBSS 洗涤 GFP hela 细胞并向细胞中加入稀释的细菌。
然后将感染细胞的培养皿放入台式离心机中水平吊篮转子的多孔板支架中。将细胞在 900 倍 G 和 25 摄氏度下离心 1 小时。然后将培养容器置于生物安全柜中 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中 1 小时，吸出细胞，用 HBSS 洗涤两次，并添加生长培养基。
在 37 摄氏度下孵育受感染细胞的培养皿。为了观察衣原体包涵体，从二氧化碳培养箱中取出衣原体感染的 GFP hela 细胞，并使用不含酚红和 5%FBS 的 RPMI 要更换培养基，请将培养皿或多孔板放在具有 20 倍或更高油物镜的倒置荧光显微镜上。使用成像软件，识别衣原体感染的 GFP hela 细胞，这些细胞表现为包含大黑洞的绿色细胞。
在采集设置对话框中，配置软件以采集绿色通道和样品中添加的任何其他通道。使用 capture slash record 按钮在所需时间获取图像。感染后。从培养箱中取出衣原体感染的 GFP hela 细胞，并将培养皿放在逆变器荧光显微镜上。
专注于细胞的中平原，其中包涵物处于最大直径和产量。Crisp Edge 每个孔至少采集 10 个视野的图像。孔通常表示重复或实验变量。
要在 measurements 选项卡下查找 GFP hela 细胞，请使用 find objects 命令并选择绿色通道。根据细胞的相对强度调整阈值强度。通过肉眼手动计数包涵体或黑色隔室和 GFP hela 细胞的数量，或使用成像软件算法自动识别和计数包涵体。
通过仅保留大于 5 平方微米的对象来过滤所选对象。将此称为 population 1。使用此群体，应用 fill holes in objects 命令作为输入，此步骤将生成群体 2。
从群体 2 中减去群体 1，得到被指定为群体 3 的阳性标记的衣原体内含物。使用 filter population 命令将大小过滤器应用于 population 3。例如，将大于 25 平方微米的物体保留在细胞中的夹杂物中，感染 24 小时或更长时间以获得早期感染时间，将大小过滤器设置为保持大于 4 平方微米的物体。
由于这些包含物要小得多，因此 size 过滤器会生成被指定为包含物的对象群。使用成像软件从图像中计算定量数据，例如包涵体编号、内含物、大小和内含物。衣原体包涵体感染后的周长很容易看作黑点和宿主细胞内表达衣原体的宿主细胞或荧光蛋白，并且可以利用它们的清晰度在多种视野和/或治疗中进行自动识别。
如图所示，一个主要应用是测定活感染细胞中的衣原体包涵体形成单位，这消除了对免疫荧光程序的需求，这些程序既耗时又昂贵。这种成像方法的另一个关键特征是它可以很容易地应用于任何衣原体物种或菌株。在这个例子中，对感染四种衣原体物种或菌株之一的 GFP hela 细胞进行了时间过程分析。
标记和分析内含物，以计算它们在指示时间的平均面积、周长和每个细胞的数量。这些属性提供了有关衣原体包涵体生物学的重要信息，包括它们如何与宿主细胞相互作用。此处显示的是感染 GFPC、Tracom L 2 的 m cherry hela 细胞的视频，该视频由感染后 48 小时开始，每隔 5 分钟拍摄 125 分钟的延时图像组成。
观看本视频后，您应该对如何使用这种反向成像技术不仅能可视化衣原体包涵体有很好的了解，而且能定量包涵体动力学，如包涵体面积周长和每个细胞的包涵体数量。与更传统的可视化技术相比，该技术具有成本效益，并且适用于所有衣原体物种和菌株。
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概述
本文介绍了一种使用荧光蛋白来可视化和量化活细胞中衣原体包涵体生长动态的方法。该技术可以快速确定衣原体的感染性，并且可以与其他荧光标记结合用于全面分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 细胞生物学
- 荧光显微镜
背景
- 衣原体感染在多种疾病中具有重要意义。
- 理解包涵体动态对于研究衣原体生物学至关重要。
- 传统方法通常依赖固定细胞和抗体。
- 活细胞成像为感染过程提供了实时的洞察。
研究目的
- 在活细胞中可视化衣原体包涵体。
- 量化这些包涵体的生长动态。
- 改进现有的研究衣原体感染性的方法。
使用的方法
- 生成表达GFP的荧光宿主细胞。
- 用衣原体感染宿主细胞。
- 活体荧光显微镜用于可视化。
- 使用分析软件量化包涵体特征。
主要结果
- 成功在活细胞中可视化衣原体包涵体。
- 获得包涵体生长动态的定量数据。
- 展示了比传统抗体方法的优势。
- 可以与各种荧光标记结合使用的潜力。
结论
- 该方法增强了对衣原体感染的理解。
- 它允许实时分析包涵体动态。
- 未来的应用可能包括对衣原体种类的更广泛研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative live-cell imaging of Chlamydia inclusion growth using fluorescent proteins addresses a critical need for dynamic, high-content infection models in early discovery. This approach enables real-time measurement of pathogen-host interactions, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The method's compatibility with multiple chlamydial species and fluorescent labels enhances its portfolio value for translational infectious disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantitation of pathogen-induced vacuole dynamics in living host cells.
- Supports mechanistic de-risking by revealing inclusion growth parameters across chlamydial strains.
- Facilitates functional target validation by linking effector protein activity to measurable inclusion phenotypes.
- Provides quantitative outputs for hypothesis-driven interrogation of host-pathogen interactions.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible live-cell assays for inclusion enumeration and size measurement.
- Reduces reliance on antibody-based methods, lowering cost and increasing throughput for screening campaigns.
- Enables multiplexing with additional fluorescent labels for multi-parametric readouts.
- Supports automated image analysis for scalable compound evaluation and phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant infection models by capturing real-time inclusion dynamics in human cell lines.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation through quantitative, translatable infection metrics.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on dynamic pathogen-host interaction data.
Pipeline & Workflow Integration
This live-cell imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target validation, phenotypic screening, and translational infection modeling.
- Discovery Biology: Quantitative imaging supports hypothesis testing and mechanistic clarification of chlamydial effectors.
- Screening: Assay reproducibility and quantitative outputs enable robust screening and comparative analysis.
- Analytics: Automated measurement of inclusion number, size, and perimeter provides actionable data for condition comparison.
- Translational Research: Real-time infection metrics facilitate alignment with disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: The platform is adaptable across chlamydial species and compatible with diverse fluorescent markers.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes live-cell infection assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing quantitative, real-time infection data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of infectious disease targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell fluorescence microscopy and image analysis software.
- Needs access to stably transfected fluorescent host cell lines and appropriate imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of imaging and quantitation protocols for reproducibility.
- Adaptable to various chlamydial strains and compatible with multiplexed fluorescent labeling.
- Practical limitations include the need for careful thresholding and size filtering during image analysis.
