人源化的小鼠模型来研究细菌感染瞄准微血管

该程序的总体目标是研究细菌 neer 脑膜炎在体内感染人体血管的机制。这是通过首先将人类皮肤移植到免疫缺陷小鼠身上，从而引入人类真皮血管来实现的。在第二步中，人源化小鼠感染细菌。

然后允许感染在预定的时间段内进行。在最后一步，获取血液和组织样本以评估感染的结果。最终，组织学、免疫荧光以及血液和组织分析的组合用于研究人体血管感染的进展。

与细胞培养模型或动物模型等现有技术相比，该技术的主要优点是，我们第一次可以观察到这些感染期间发生的典型临床病理。采集后尽快用 70% 乙醇清洁人体皮肤表面，然后将其平放在干净的表面上，最好在流动罩下。接下来，使用具有预设厚度的皮节从皮肤顶部切下 200 至 400 微米的切片。

检查切片的完整性，然后将它们进一步修剪成 2 x 2 厘米的正方形。将方块放入 PBS 中，然后用 70% 乙醇清洁手术制备的 6 至 8 周龄严重联合免疫缺陷米色小鼠的剃须区域。对移植部位进行局部麻醉后，使用弯曲的剪刀小心地去除比移植物块略小的区域的小鼠皮肤表层，注意不要干扰下面的脉管系统。

为避免移植物变干，将其中一块人体皮肤片放在移植床上，确保表皮面朝上。对齐组织的边缘并用组织胶固定。然后小心地将人体皮肤的其余部分安装到移植床上，在每个边缘周围放置少量组织胶。

始终将人体皮肤修剪成合适的尺寸，而不是使移植床更大。确认每个角落都固定后，用碘溶液清洁该区域，并在移植物上用垫子一面用力但不紧紧地贴上创可贴，注意动物的呼吸不受影响，然后用敷料胶带固定创可贴，让动物在温暖的表面上恢复。一旦醒来，将动物放回笼子中，直到细菌注射，将过夜平板培养物重新接种到液体培养物中。

感染当天早上，当细菌达到所需浓度时，将细胞稀释至每毫升 10 至第七个菌落形成单位的 1 倍。然后在麻醉后，确认脚趾对移植小鼠的镇静作用。捏住动物并将其放在加热垫上。

将眼药膏涂在动物的眼睛上，然后 ip。向每只小鼠注射 8 毫克盐水中的人转移液。然后，对于每只动物，切开尾巴的尖端，将一小滴血液从尾巴撒到琼脂平板上，以确认血液在感染前是无菌的。

然后通过眶后注射静脉注射 100 微升细菌培养物。几分钟后，再次剪掉尾巴的末端，并将该血样也涂抹在新鲜的琼脂平板上。为了在感染后立即建立血集落形成单位，请用组织胶密封尾部，然后稀释细菌接种物并用适当的抗生素将其涂抹在琼脂平板上。

为了在感染后 6 小时建立接种菌落形成单位，从每条小鼠尾巴中再抽取少量血液，然后稀释和接种血滴，如刚才所示，以在 6 小时建立菌落形成单位。然后将所有板在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育过夜，以进行器官集落形成。受感染动物的单位计数。

首先在每只安乐死的小鼠上做一个中线切口。然后，为每只动物切开肋骨并在心脏上切开一个切口。使用无菌注射器从心脏和胸腔抽取尽可能多的血液，并将其分配到每个样本的单独无菌管中。

接下来，去除感兴趣的器官，然后将皮肤移植物和小鼠皮肤的伴随部分转移到每只动物的一个无菌板上。让收集的血液凝结 15 分钟，然后将其旋转。然后从血液中取出血浆并将其储存在零下 80 摄氏度以备后用。

接下来，称量每个含有 500 微升 PBS 的均质管。然后使用无菌活检打孔器从每个解剖组织中采集 4 毫米的活检样本。将活检物单独放入均质管中，每根管中装有皮肤样本的一根 2 毫米的珠子。

将剩余组织储存在 4 摄氏度的 4% 对甲醛中用于显微镜检查，并称量均质管以确定活检重量。然后以 6， 000 RPM 的速度将样品匀浆 30 秒，重复皮肤匀浆，直到匀浆呈粪便状。最后，将每个试管中的细胞浆液铺在新鲜的琼脂平板上，并在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中培养培养物过夜。

在这些代表性结果中建立器官集落形成单位计数。N 脑膜炎的 GFP 阳性菌株。使用血清型 C。

血细胞计数显示，静脉注射 1 乘以 10 至六个菌落形成单位的细菌后 5 分钟，血液中循环的每毫升平均有 1.5 乘以 10 至第五个菌落形成单位。6 小时后，到 24 小时，计数平均为每毫升 4.8 乘以 10 至第 4 个菌落形成单位。平均计数为每毫升 2.4 乘以 10 至第 4 个菌落形成单位。

但在这组 10 只小鼠中，5 只没有可检测到的循环细菌，而其他 5 只小鼠的数量相对较高。这些图表上的这些条形显示了从皮肤中提取的每组 CFU 计数的中值。样品显示，大多数小鼠在人体皮肤中具有相当大的计数，6 小时时每毫克组织平均 2.1 乘以 10 至第 4 CFU，24 小时时每毫克组织第 2 CFU 的 4.4 乘以 10。

对侧小鼠皮肤样本在 24 小时时没有细菌计数，在 6 小时时仅表现出非常低的数量，表明终末脑膜炎比移植组织中的人体血管更受欢迎。一般来说，在另一个采样的器官中，细菌计数非常低甚至检测不到，尽管两只动物确实显示了计数，这可能与高循环细菌数量有关。该模型也可用于确定毒力因子在体内的作用。

例如，在本实验中，使用了缺乏功能性 4 型 pill I 的细菌菌株 感染这些突变菌株的小鼠在人体皮肤移植物中没有表现出细菌粘附，证实了 4 型 pill I 在体内粘附中起的关键作用。在这些皮肤移植物的共聚焦图像中，感染后 2 小时，可以观察到用凝集素 UEA 偶联的 romine 染色的人体血管。皮肤的表皮真皮边界清晰可辨，感染的 GFP 阳性和脑膜炎可以清楚地观察到整个血管。

这种 h 和 e 染色的人体皮肤移植物显示炎症和血管渗漏，以及血栓形成集中在靠近表皮真皮边界的血管。感染后 24 小时，约 30% 的感染，皮肤中的细菌粘连导致肉眼可检测到的紫癜的发展。因此，这项技术的发展为参与研究和宿主病原体相互作用的研究人员在人类血管的背景下研究疾病机制铺平了道路。