细胞表面和内蛋白质的现场培养神经细胞的抗体后喂养差异化标记
February 12th, 2014
我们描述了一种方法，以使用特定的多克隆抗体对表位的细胞外活神经元的表面上的标记蛋白。蛋白结合的抗体在细胞表面上，并随后通过胞吞作用内在化可以从蛋白质上残留进行区分，或在培养过程中贩卖到，该表面。
该程序的总体目标是标记活神经元表面的蛋白质，并随后使用差异二抗标记区分表面蛋白和内化蛋白质。为此，将盖玻片上培养的原代神经元与针对表面表位的抗体一起孵育，并孵育以进行内化。孵育后，应用荧光标记的二抗以鉴定表面暴露的蛋白质。
然后应用过量的未标记二抗以阻断任何残留的表面蛋白一抗复合物。然后对培养的神经元进行渗透，并应用不同颜色的二抗来检测内化的蛋白质。最终，可以通过免疫荧光显微镜获得显示内化蛋白与表面蛋白的相对水平的结果。
按照此程序，可以获得源表面蛋白质内化的时间过程，从而产生有关罗勒和刺激条件下蛋白质运输速率的信息。通过准备用于细胞培养的盖玻片来开始此过程 洗涤聚赖氨酸包被的 18 毫米球状玻璃盖玻片 将它们浸入三个单独的含有 PBS 的冲洗皿中 向 12 孔板的孔中加入 500 微升层压溶液，然后使用镊子将盖玻片放入每个孔中。很好地按下每个盖玻片，以确保它平放在孔的底部，在 37 摄氏度下孵育两个小时，可以使用 E 15 小鼠皮层或 E 18 大鼠河马 Campi 执行该方案。
在本演示中，使用了鼠标皮层。将半窝或一窝胚胎的皮质放在冰上，放入含有钙和镁 PBS 的 1 毫升 einor 中，然后放在冰上。接下来，使用 1 毫升微量移液器从皮质组织中去除 PBS。
然后将 500 微升 Pappa DNA 的 One 溶液添加到半窝胚胎的皮质组织中。在 37 摄氏度下孵育 15 至 20 分钟。孵育期间两次，孵育后轻轻弹动试管以混合内容物，使用火焰抛光的硅化粘贴移液器轻轻重新填充组织 10 至 15 次，直到获得细胞分散。
很少（如果有）应保留任何未解离的组织块，以避免气泡的产生。小心地将解离的细胞悬液铺在 Hank's BSS 中含有添加剂的 3 毫升 4%BS， A 垫上。然后在台式离心机中，用水平转子以 100 倍 G 离心 7 分钟。
旋转后，小心去除上清液，注意不要吸出细胞沉淀。然后加入 1 毫升完全神经基础培养基，轻轻上下移液以重悬沉淀的细胞。接下来，使用血细胞仪确定活细胞浓度。
在铺板前，只有相亮细胞应被视为活细胞。从孔中的盖玻片中吸出多余的层压血清溶液，并用原代神经元培养基代替。然后向每个孔中加入 75， 000 至 100， 000 个原代神经元。
在第 7 天，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳的神经基础培养基中培养神经元长达 21 天，此后每周添加抗有丝分裂荧光、脱氧尿苷尿苷以防止神经胶质细胞过度生长并进行半培养基更换。在培养的第一周，神经元发育出树突状乔木，如这张两天前培养物的图像所示。到第 2 到第 3 周，它们已经成熟并将进行突触发生。
该图显示了在体外 14 天拍摄的广泛投影网络，用于标记目标表面暴露的蛋白质，将一抗以适当浓度直接添加到条件培养基中。每种情况应一式三份进行测试 四个对照、免疫前血清或识别蛋白质细胞内区域但在胞吐作用过程中未暴露的抗体可以以与测试一抗相同的稀释度使用。孵育后，将细胞放回培养箱中 1 小时、2 小时或 4 小时，吸出含有抗体的培养基，用 PBS 轻轻但快速地洗涤孔一次。
通过向孔中加入溶液，然后吸出来增加室温。然后加入新鲜制备的 4% 对位甲醛，孵育 5 分钟。添加室温以固定细胞。
从孔中取出对甲醛溶液，并将其丢弃在通风橱中的液体废物容器中。然后像以前一样用 PBS 快速冲洗细胞 3 次。将第三次洗涤留在原位，以便可以轻松取下盖玻片。
接下来，使用镊子小心地从板中取出盖玻片，并将它们细胞面朝上放在一次性培养板底部或盖子上的一张 param 上。染色方案的其余部分将在此表面上进行，轻轻地将 PBS 5%BSA 的封闭溶液移液到细胞上，在盖玻片上形成圆形气泡状滴，使其不会变干。孵育 30 分钟。
重要的是要记住不要在封闭溶液中添加清洁剂。在这个阶段，当只需要标记细胞表面蛋白时，不应渗透细胞。封闭后，吸出封闭液，然后标记表面暴露的蛋白质，涂上荧光标记的二抗，然后在室温下孵育 2 小时，孵育后吸出二抗并用 PBS 洗涤盖玻片两次，每次 5 分钟，以封闭细胞表面未被标记的二抗结合的任何蛋白质。
将不可渗透的神经元与高浓度的未标记二抗孵育过夜。在室温下。过夜孵化至关重要。
较短的孵育时间不会完全阻断任何未与标记的二抗完全结合的一抗。第二天，像以前一样，用 PBS 清洗盖玻片两次，每次 5 分钟。去除固定剂后，在室温下用 4% 对位甲醛的磷酸盐缓冲液固定细胞 5 分钟。
用 PBS 快速冲洗细胞两次。接下来进行细胞内标记，在室温下用含有 5% BSA 和 0.1% Triton X 100 的 PBS 渗透并封闭细胞 30 分钟。渗透后，去除封闭溶液。
注意盖玻片不要变干。添加不同标记的二抗，并在室温下孵育 2 小时。去除第二种二抗后，用 PBS 清洗盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
然后用去离子水支架短暂清洗它们。盖子用含有抗褪色剂的水性封固剂滑到载玻片上，并让它们在 4 摄氏度的黑暗中干燥储存载玻片，以最佳方式保存荧光信号。使用适当的激发和发射滤光片在共聚焦显微镜上对免疫染色细胞进行成像。
成像后的所有重复和条件使用相同的成像采集参数。使用标准图像分析软件（如 Fiji Image J 或）来确定标准感兴趣区域的积分密度或 Punta 属性（例如数量和大小）以确定癫痫发作相关基因 6 还是 6 存在于神经元表面并从神经元表面内化。如本视频所述，对培养的大鼠海马神经元进行双色标记。
在此图像中，标记的细胞表面蛋白以青色显示，内化蛋白以绿色显示。箭头指示的双重染色仅在似乎不健康的细胞中观察到，以确定在抗体喂养孵育期间内化的蛋白质是否内化，定位于表达早期回收内体标志物转铁蛋白 mCherry 的内体神经元在渗透后进行免疫染色，如树突状乔木的这个区域所示，点状染色与转铁蛋白有广泛的重叠，证实内化蛋白质定位于内体。 与现有方法相比，该技术的主要优点是可以使用单一抗体来区分细胞表面和内化蛋白库。
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概述
本文描述了一种使用特定的多克隆抗体在活体神经元表面标记蛋白质的方法。该技术允许区分表面蛋白质和通过内吞作用内化的蛋白质。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 了解神经元中的蛋白质定位对研究细胞功能至关重要。
- 标记技术可以帮助区分表面和内化的蛋白质。
- 抗体基方法常用于细胞成像。
- 免疫荧光显微镜提供了关于蛋白质动态的视觉洞察。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来标记活体神经元中的表面蛋白质。
- 区分留在表面的蛋白质和被内化的蛋白质。
- 增强对神经元细胞中蛋白质运输的理解。
使用的方法
- 原代神经元在盖玻片上培养。
- 神经元与靶向表面表位的一抗孵育。
- 使用荧光标记的二抗来识别表面蛋白质。
- 使用过量的未标记的二抗来阻断剩余的表面抗体复合物。
- 神经元被透化，并用不同颜色的二抗检测内化的蛋白质。
主要结果
- 该方法成功区分了表面和内化的蛋白质。
- 免疫荧光显微镜显示了蛋白质定位的相对水平。
- 结果证明了差异性抗体标记的有效性。
- 这种方法可以应用于涉及神经元蛋白质动态的各种研究。
结论
- 所描述的方法是神经科学研究的有价值工具。
- 它提供了对神经元中蛋白质运输机制的洞察。
- 未来的研究可以利用这种技术来深入理解神经元功能。
常见问题
Executive Industry Relevance
Differential antibody labeling of cell-surface and internalized proteins in live neurons enables precise quantification of receptor trafficking dynamics, a critical factor in early target validation and mechanistic de-risking. This approach supports predictive confidence in target engagement and trafficking, informing go/no-go decisions at key discovery inflection points. The method's adaptability to various cell types and surface proteins enhances its portfolio-wide relevance for biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of receptor localization and trafficking in live cells.
- Supports functional validation of putative transmembrane targets by distinguishing surface from internalized pools.
- Provides mechanistic de-risking by clarifying endocytic and recycling pathways.
- Facilitates predictive confidence in target biology for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated neuronal systems for downstream trafficking and localization assays.
- Delivers quantitative, reproducible immunofluorescence readouts for assay standardization.
- Enables dual-color detection for multiplexed screening of trafficking modulators.
- Supports reliable evaluation of compound effects on receptor dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns trafficking measurements with disease-relevant neuronal models when appropriate antibodies are available.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of trafficking-dependent targets.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on subcellular localization data.
- Offers predictive de-risking for targets with complex trafficking profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This differential labeling workflow integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research, supporting both mechanistic studies and quantitative screening.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on receptor trafficking and localization in live neurons.
- Screening: Provides reproducible, quantitative dual-color immunofluorescence outputs for assay development.
- Analytics: Supports image-based quantification of surface versus internalized protein pools for comparative analysis.
- Translational Research: Connects trafficking data to disease-relevant neuronal systems when appropriate.
- Enterprise Reuse: Adaptable to diverse cell types and surface proteins, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in trafficking studies.
- Operational Value: Standardizes dual-color immunofluorescence workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying trafficking-dependent risks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets with complex localization profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture, immunofluorescence, and confocal imaging.
- Demands access to dual-color fluorescence microscopy and quantitative image analysis software.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of antibody reagents and imaging parameters.
- Adaptation to other cell types depends on availability of extracellular epitope-specific antibodies.
- Blocking and incubation steps require precise timing to ensure differential labeling fidelity.
