活体培养神经元抗体孵育后细胞表面与内化蛋白的差异标记

本实验的总体目标是对活神经元表面的蛋白质进行标记，并通过差异化的二抗标记来区分表面蛋白与内化蛋白。为此，将培养在盖玻片上的原代神经元与针对表面表位的抗体共同孵育，并进一步孵育以允许抗体-蛋白复合物发生内化。孵育结束后，加入荧光标记的二抗以识别暴露在细胞表面的蛋白质。

然后加入过量的未标记二抗，以阻断任何残留的表面蛋白与一抗形成的复合物。接着对培养的神经元进行透化处理，并加入另一种不同荧光颜色的二抗，以检测内化蛋白。最终可通过免疫荧光显微镜获得结果，显示内化蛋白与表面蛋白的相对水平。

通过该实验流程，可获得源细胞表面蛋白内吞的时间过程数据，从而获取蛋白质在基础状态和刺激条件下转运速率的相关信息。开始该实验前，需准备用于细胞培养的盖玻片：将前一天用多聚赖氨酸包被的18毫米圆形玻璃盖玻片依次浸入三个盛有PBS的漂洗容器中进行清洗。向12孔板的每个孔中加入500 µL 层粘连蛋白溶液，然后用镊子将盖玻片放入各孔中。轻轻按压每张盖玻片，确保其平整地贴附于孔底，随后在37°C下孵育2小时。本方案可使用E15小鼠大脑皮层或E18大鼠海马组织进行。

在此实验中，使用小鼠大脑皮层组织。将半窝或一窝胚胎的大脑皮层组织置于含有钙和镁的 PBS 中，并放置于冰上。随后，使用 1 毫升微量移液器将皮层组织中的 PBS 液体移除。

然后向半窝胚胎的皮质组织中加入 500 µL 的 Pappa DNA 溶液。在 37 °C 下孵育 15 至 20 分钟。孵育期间每隔一段时间轻轻弹动离心管两次，以混匀内容物。孵育结束后，使用经火焰抛光的硅化巴斯德移液管轻轻吹打组织 10 至 15 次，直至获得单细胞悬液。

应尽量避免有未解离的组织块残留，同时避免产生气泡。将解离后的细胞悬液小心地铺在含有添加剂的 Hank's BSS 溶液中 4% BS A 配制的 3 毫升垫层之上。随后，在台式离心机中使用摆出式转子，以 100 × g 离心 7 分钟。

离心后，小心移除上清液，注意不要吸出细胞沉淀。然后加入1 mL完全神经基础培养基，轻轻吹打混匀以重悬沉淀的细胞。接下来，使用血细胞计数板测定活细胞浓度。

铺板前应仅将相位明亮的细胞视为活细胞。吸去孔中盖玻片上的多余层粘连血清溶液，并替换为原代神经元培养基。然后向每孔加入 75,000 至 100,000 个原代神经元。

将神经元在神经基础培养基中培养至多21天，培养条件为37摄氏度、5%二氧化碳。从第7天开始，此后每周添加抗有丝分裂剂氟代脱氧尿苷和尿苷，以防止胶质细胞过度生长，并进行半量换液。在培养的第一周内，神经元会发育出树突分支，如这幅两天龄培养物图像所示。到第二至第三周，神经元逐渐成熟并开始进行突触形成。

本图展示了体外培养14天后投射网络的广泛分布。为标记目标表面暴露蛋白，可将一抗以适当浓度直接加入条件培养基中。每种条件应设三个重复。可使用四种对照：免疫前血清或识别蛋白胞内区域（在胞吐过程中不暴露）的抗体，其稀释度应与待测一抗相同。将细胞放回培养箱孵育1小时、2小时或4小时后，吸除含抗体的培养基，用PBS轻轻且迅速地洗涤孔板一次。

加入室温溶液至孔板中，然后吸除。接着加入新配制的4%多聚甲醛，孵育五分钟。固定细胞后，加入室温溶液以完成固定步骤。

从孔中移除多聚甲醛溶液，并在通风橱内将其弃入液体废液容器中。随后，用 PBS 快速冲洗细胞三次，操作同前。保留第三次洗涤液，以便于轻松取出盖玻片。

接下来，使用镊子小心地将盖玻片从培养板上取下，并将细胞面朝上放置在一次性培养皿底面或盖子上的帕拉膜（parafilm）片上。染色方案的后续步骤将在该表面上进行：轻柔地将含5% BSA的PBS封闭液用移液器滴加到细胞上，使液体在盖玻片上形成圆润的液滴状气泡，防止其干燥。室温孵育30分钟。

需要注意的是，封闭液中切勿添加去污剂。当仅需标记细胞表面蛋白时，此阶段不应使细胞通透化。封闭完成后，吸去封闭液，然后加入荧光标记的二抗以标记细胞表面暴露的蛋白，在室温下孵育两小时。孵育结束后，吸去二抗溶液，用 PBS 洗涤盖玻片两次，每次五分钟，以封闭未被标记二抗结合的细胞表面蛋白。

将非通透性神经元与高浓度未标记的二抗在室温下孵育过夜。该过夜孵育步骤至关重要。

较短的孵育时间无法完全阻断未与标记的二抗充分结合的一抗。第二天，用PBS如前所述将盖玻片洗涤两次，每次五分钟。然后在去除固定剂后，用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液在室温下对细胞进行后固定，持续五分钟。

用 PBS 快速冲洗细胞两次。接下来进行细胞内标记，使用含有 5% BSA 和 0.1% Triton X-100 的 PBS 在室温下对细胞进行通透和封闭处理，持续 30 分钟。通透结束后，移除封闭液。

注意防止盖玻片干燥。加入另一种标记的二抗，室温孵育两小时。去除第二种二抗后，用 PBS 洗涤盖玻片三次，每次五分钟。

然后用去离子水短暂清洗，将盖玻片用含抗淬灭剂的水性封片剂封固在玻璃载片上，室温避光干燥后，于4摄氏度避光保存，以最佳保留荧光信号。使用共聚焦显微镜，选择合适的激发和发射滤光片，对免疫染色细胞进行成像。

成像后，对所有重复样本和条件使用相同的成像采集参数。使用标准图像分析软件（如 Fiji ImageJ 或 MetaMorph），通过测定选定兴趣区域的总密度或 Punkta 属性（如数量和大小），来确定癫痫相关基因 six（seizure related gene six）或 says six 是否存在于神经元表面并被内化。培养的大鼠海马神经元双色标记实验按照本视频所述方法进行。

在此图中，标记的细胞表面蛋白显示为青色，而内化的蛋白显示为绿色。仅在形态上显示不健康的细胞中观察到由箭头所示的双重染色；为确定在抗体孵育摄取期间内化的蛋白是否定位于内体，对表达早期再循环内体标志物转铁蛋白 mCherry 的神经元在透化后进行免疫染色。如树突分支的这一区域所示，斑点状染色与转铁蛋白存在广泛重叠，证实内化的蛋白定位于内体。该技术相较于现有方法的主要优势在于，仅需使用一种抗体即可区分细胞表面蛋白与内化蛋白池。