Name: 细胞表面和内蛋白质的现场培养神经细胞的抗体后喂养差异化标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 学习利用差异化抗体标记技术区分培养神经元表面蛋白与内吞蛋白的方法。该技术通过荧光二抗标记和封闭步骤，结合免疫荧光显微镜成像，为研究神经元蛋白质转运机制提供可靠工具。

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作者感谢Teele Palumaa在图表方面提供的帮助。本研究由澳大利亚国家卫生与医学研究委员会项目资助（资助号：1008046）。

1. 分离的海马神经元培养
<ol>
	<li>准备盖玻片（硼硅酸盐玻璃）：
	<ol>
		<li>用100%乙醇洗涤。</li>
		<li>在紫外照射下风干。</li>
		<li>用多聚-D-赖氨酸（0.5 mg/ml 溶于 0.15 M 硼酸盐缓冲液，4 °C 过夜）包被。</li>
		<li>次日（培养当天），用 PBS 洗涤 3 次，然后在 37 °C 下用含 2.5 μg/ml 天然小鼠层粘连蛋白和 5% v/v 热灭活胎牛血清（FCS）的 PBS 溶液包被 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖胚胎第18天（E18）大鼠海马，收集至含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）中，冰上冷藏。注：所有涉及动物的实验方案均经墨尔本大学动物伦理委员会批准。</li>
	<li>根据Papase解离试剂盒的说明书配制木瓜蛋白酶和脱氧核糖核酸酶I溶液。
	<ol>
		<li>向1 ml木瓜蛋白酶溶液中加入50 μl DNase I溶液。</li>
		<li>注意：初次配制后，木瓜蛋白酶溶液和DNase I溶液可分别分装成等份（木瓜蛋白酶为0.5 ml，DNase I为25 μl），于-20 °C保存，待用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尽可能吸除 PBS，将一个胎鼠窝的胚胎海马组织置于 1 ml 木瓜蛋白酶/脱氧核糖核酸酶 I 溶液中，于 37 °C 孵育 15–20 分钟。孵育期间轻弹管壁两次，以混匀内容物。</li>
	<li>用火焰抛光的硅化巴斯德移液管轻轻吹打海马组织10-15次（避免产生气泡），直至细胞充分分散，仅残留少量或无未解离的组织块。</li>
	<li>将解离后的细胞悬液小心地铺在3 ml含添加剂的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中4% w/v牛血清白蛋白（BSA）的上层+；参见第1.6.1节。
	<ol>
		<li>在含有 2 mM CaCl 的 HBSS 中，于室温下不搅拌溶解 BSA，制备此步骤梯度溶液2，1 mM MgSO₄4，4 mM NaHCO₃3 和 40 mM 葡萄糖（HBSS+）然后经无菌过滤，4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离心，100 × g，7 分钟，使用带有摆动转子的台式离心机。</li>
	<li>移除上清液时需小心，避免吸出细胞沉淀。</li>
	<li>用火焰抛光（硅化）的巴斯德移液管（或1 ml蓝色移液器吸头）在1 ml完全Neurobasal培养基（含2% B27、0.5 mM L-谷氨酰胺并补充1% FCS）中轻柔重悬细胞沉淀。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数两份10 μl样品（注意：仅将相位明亮的细胞计为“活细胞”）。</li>
	<li>将原代神经元接种于预先制备的包被玻璃盖玻片上（0.75–1 × 105/18 mm 盖玻片置于12孔板中)。铺板前立即吸去盖玻片上多余的层粘连蛋白/血清溶液，并更换为初级神经元培养基（见下文）。注意：所需盖玻片数量需提前确定，因为盖玻片的准备工作需在培养前一天开始（见步骤1.1）。</li>
	<li>培养大鼠原代E18海马神经元长达21天 体外 在含有2% B27、0.5 mM L-谷氨酰胺和1% FCS（热灭活）的Neurobasal培养基中培养至7天体外培养（DIV），之后每周进行半量换液。在7 DIV时加入抗有丝分裂剂氟脱氧尿苷/尿苷（每种核苷的10 mM母液按1/1,000稀释），以抑制胶质细胞过度生长。</li>
</ol>
2. 抗体与活神经元的孵育
<ol>
	<li>在培养的第一周内，神经元正在发育树突分支，到第2-3周时，神经元已充分成熟，能够进行突触形成6,7。
	<ol>
		<li>在选定的实验时间点，将一抗加入含有原代胚胎神经元的盖玻片培养孔中（每组设三个重复孔）。将一抗分装液直接加入原代神经元的培养基中，达到所需的最终稀释比例。注：在本示例中，使用针对重组分泌型蛋白制备的兔多克隆抗血清，按1/500稀释比例，取2 μl加入1 ml培养基中；在取抗体分装液前，可先以13,000 × g、室温离心10分钟，以去除任何颗粒物，有助于降低背景信号。</li>
		<li>对于免疫前血清对照组，加入等量的免疫前血清（达到相同的最终稀释比例）。若无免疫前血清，可加入等体积的Neurobasal培养基或PBS（无一抗对照）。或者，若存在可识别该蛋白胞内区域的合适一抗，可将其加入对照孔，以验证表面染色的特异性。</li>
		<li>将细胞放回培养箱孵育1-4小时（该孵育时间可根据实验经验确定）。在我们的实验中，抗体在整个孵育期间持续存在，但实验设计也可采用脉冲式加入抗体，随后洗去抗体并继续孵育（即脉冲-追踪实验），以评估内吞过程的时间进程。 
		可选步骤：如有需要，可在室温或冰上进行此孵育，以减缓基础蛋白内吞速率。若在无CO2控制的环境中操作，应在加入抗体/抗血清前更换为非碳酸氢盐缓冲体系的培养基。注意：成熟神经元培养物（&#62;14天，尤其是培养的小鼠胚胎神经元）对完全换液耐受性较差。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>我们曾尝试将该一抗内吞步骤的孵育时间设为1小时、2小时和4小时，均获得良好结果，但最佳时间取决于目标蛋白的丰度以及研究细胞中蛋白转运的动力学特征。 
	注：代表性结果中的双色图像是在37 °C组织培养箱中孵育1小时后获得的。</li>
	<li>在所需孵育时间结束后，吸除含抗体的培养基，用室温PBS轻柔且迅速地洗涤各孔一次。</li>
</ol>
3. 对固定但未通透的细胞进行二抗孵育
<ol>
	<li>在 pH 7.2 的磷酸盐缓冲液中用 4% 多聚甲醛固定神经元，室温下作用 5 分钟。注意：为获得最佳效果，应使用新鲜配制的固定液； alternatively 可使用储存于 -20 °C 并已完全解冻、无可见多聚甲醛沉淀的固定液。注意：多聚甲醛固定液应在通风橱中配制和操作。</li>
	<li>从孔中移除固定液（转移至通风橱中的液体废液容器），并用 PBS 洗涤 3 次。
	<ol>
		<li>可选步骤：如需节省抗体试剂，可用镊子小心地将盖玻片从12孔板中取出，细胞面朝上，放置于一次性培养皿底部预先铺好的Parafilm膜上。</li>
		<li>然后可将溶液轻轻移液至盖玻片上，使其完全覆盖盖玻片，但溶液不得溢出盖玻片边缘至Parafilm上。</li>
		<li>该技术适用于短期孵育（1-2 小时），但更长时间的孵育（例如 应在加湿孵育盒中进行过夜孵育。或者，可将盖玻片放回12孔板的孔中进行过夜孵育，并加入足够体积的液体以确保盖玻片不会干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭30分钟&#160;在室温下用含5% BSA的PBS处理（注意：&#160;此阶段切勿向封闭液中添加去污剂，因为必须确保细胞不被通透化。</li>
	<li>为了在检测内化蛋白之前标记表面蛋白，需加入选择的第一种荧光标记的二抗。 
	注意：在本示例中，一抗血清由兔（本实验室抗体）针对一种重组分泌型异构体产生4因此，为了检测未透化的神经元表面跨膜亚型的胞外区域，针对第一种二抗，我们使用了Dylight 649标记的驴抗兔抗体（用含5% BSA的PBS按1:200稀释）。建议在使用前将稀释后的二抗溶液离心（10分钟，13,000 × g，室温）。</li>
	<li>将盖玻片在室温下孵育2小时。</li>
	<li>用 PBS 清洗盖玻片（在孔中），每次 5 分钟，共洗 2 次。</li>
</ol>
4. 使用过量未标记的二抗进行封闭
<ol>
	<li>使用高浓度（&#62;0.1 mg/ml）的未标记二抗对未透化的神经元进行封闭。
	<ol>
		<li>该未标记二抗应针对一抗所来源的物种（本例中为兔）产生，于室温下孵育过夜。</li>
		<li>本实验方案中使用了浓度为 0.13 mg/ml 的 AffiniPure Fab 片段山羊抗兔 IgG（H+L）。 
		注意：过夜孵育至关重要，较短的孵育时间（2 小时）不足以完全封闭未被标记二抗充分结合的一抗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 PBS 洗涤盖玻片（在孔中），每次 5 分钟，共洗 2 次。</li>
	<li>此封闭步骤后，用含磷酸盐缓冲液（pH 7.2）的 4% 多聚甲醛在室温下固定细胞 5 分钟。去除固定剂后用 PBS 漂洗（2 次）（将固定剂转移至通风橱内的液体废弃物容器中）。</li>
</ol>
5. 透化及施加第二种荧光标记的二抗
<ol>
	<li>在室温下用含0.1% Triton-X-100的5% BSA PBS溶液对细胞进行通透和封闭，处理30分钟。</li>
	<li>移除封闭液（注意避免盖玻片干燥）。加入另一种带有不同荧光染料标记的荧光偶联二抗。
	<ol>
		<li>注意：所选荧光染料必须能够与先前使用的荧光染料相区分，具体取决于共聚焦显微镜可用的激发/发射滤光片（见下文）。</li>
		<li>本方案示例中使用了Alexa Fluor 488标记的驴抗兔二抗（1/200稀释于含5% BSA和0.1% Triton-X-100的PBS中），室温孵育2小时，然后移除二抗溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用PBS洗涤盖玻片3次，每次5分钟，最后用去离子水短暂洗涤。</li>
</ol>
6. 封片与成像
<ol>
	<li>使用含抗荧光淬灭剂的水性封片剂将盖玻片封固于玻璃载片上例如 VECTASHIELD）并使其自然干燥。为最佳保存荧光信号强度，需避光保存于4 °C。</li>
	<li>在共聚焦显微镜下观察免疫荧光染色的细胞。
	<ol>
		<li>必须具备用于检测两种荧光信号的合适激发滤光片和发射滤光片。</li>
		<li>若需比较不同实验条件（例如，去极化状态下内化速率的差异）8,9 或对照条件）下，确保来自不同条件的所有重复盖玻片均使用相同的图像采集参数进行成像。标准感兴趣区域的积分密度或斑点属性（例如 数量、大小）可使用标准图像分析软件从所得图像中进行测量（例如 Fiji/ImageJ，Metamorph</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lewis, T. L. Jr, Mao, T., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+myosin+VI+in+the+localization+of+axonal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for myosin VI in the localization of axonal proteins.</a> PLoS Biol. 9, (2010).</li>
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<li>Kennedy, M. J. &, Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelles+and+trafficking+machinery+for+postsynaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).</li>
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<li>Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArancibia-C%C3%A1rcamo%2C+IL+%22The+Dynamic+Synapse%3A+Molecular+Methods+in+Ionotropic+Receptor+Biology%22">The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology</a>. Kittler, J. T., Moss, S. J. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).</li>
<li>Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+trafficking+and+recycling+maintain+a+pool+of+mobile+surface+AMPA+receptors+required+for+synaptic+potentiation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation).</a> Neuron. 63, 92-105 (2009).</li>
<li>Reider, A., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+adaptors+%E2%80%93+social+networking+at+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane.</a> J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述技术可作为细胞表面生物素化方法（由 Arancibia-Càrcamo et al. 综述）12 的补充，是保存内化蛋白亚细胞定位信息的首选方法，前提是存在针对细胞外表位的合适一抗。此外，通过在活细胞与一抗孵育过程中的不同时间点固定盖玻片，可实现对蛋白转运/内化过程随时间变化的定量分析，而无需制备蛋白提取物。
可在共聚焦图像中测量并比较不同条件下（例如，刺激状态与基础水平8,9）感兴趣区域内的染色强度或点状结构的数量和大小（例如，锥体神经元胞体的顶端区域或距胞体一定距离的近端顶树突）。随后，可将内化受体的信号强度归一化至表面受体的信号强度。 Alternatively，该技术可通过增加一步抗体剥离步骤以去除细胞表面残留的抗体，再经孵育使先前已内化并结合抗体的蛋白重新返回细胞表面，从而适用于定量受体向细胞膜的再循环过程13。
利用该方法，我们得以证实Sez6（一种假定的膜受体）能够到达并定位于神经元的细胞表面。因此，该技术成功地实现了此前...

在确定新发现蛋白质的功能时，研究该蛋白质的亚细胞定位及其在细胞内的转运过程，可为推测其可能发挥的作用提供重要线索1,2。对发育中新皮质转录组的生物信息学分析3为我们提供了一份在小鼠大脑皮层发生过程中表达发生改变的基因列表。随后我们采用基因敲除方法证实，其中某个基因sez6所编码的蛋白质在神经元发育中具有关键作用。我们观察到，与惊厥相关的基因6（Seizure-related gene 6），即Sez6蛋白，定位于发育中的树突，并存在于树突棘中；树突棘是树突上接收和整合兴奋性信号的特化结构。此外，当该蛋白质缺失时，树突和兴奋性突触无法正常形成4。该蛋白质最可能的主要同工型具有跨膜受体的特征；然而，通过共聚焦显微镜或免疫电镜观察免疫标记蛋白的亚细胞分布时发现，大部分（即使不是全部）信号均与胞体-树突区室中的小囊泡相关，而在细胞表面的质膜上几乎检测不到或完全检测不到蛋白标记信号。
为了确证这种具有预测的大分子胞外结构域的假定受体是否被转运至细胞质膜，我们采用了一种活细胞方法，利用我们针对该蛋白胞外区域制备的抗血清来标记细胞表面的蛋白。通过将这种“抗体孵育”方法与两次使用不同荧光标记的二抗进行孵育相结合，并在两次孵育之间加入充分的封闭步骤和透化步骤，我们能够识别出两个不同的蛋白池，它们可通过结合携带不同荧光标签的荧光标记二抗加以区分。因此，我们能够区分在抗体孵育期间通过内吞作用被内化的蛋白，以及在此期间仍停留在细胞表面或被转运至细胞表面的蛋白。利用该方法，我们证实了目标蛋白在神经元中存在向细胞表面的转运以及从细胞表面的内化过程。因此，尽管所有这些技术均使用了相同的兔多克隆抗血清，但该相对快速且简便的技术所提供的信息量优于传统的免疫细胞化学方法或包埋前免疫胶体金电镜技术。只要存在针对胞外结构域表位的优质抗体，该技术可广泛适用于任何跨膜蛋白的研究。此前该技术已被用于研究谷氨酸受体GluR1亚基的受体转运过程5。

<table><tbody><tr><td>含钙和镁的 PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶解离系统</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>PDS</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁和酚红的 Hank&amp;#039;s 平衡盐溶液</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>天然小鼠层粘连蛋白</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>分装前需在冰上解冻</td></tr><tr><td>胎牛血清 HyClone</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氟脱氧尿苷</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>尿苷</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>18 mm 圆形玻璃盖玻片</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td>CB00180RA1</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 水性封片介质</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1400</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 Dylight 649&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-495-152</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure F&lt;sub&gt;ab&lt;/sub&gt; 片段山羊抗兔 IgG (H+L)&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-007-003</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>P6148</td><td>有毒 - 需在通风橱中操作</td></tr><tr><td>吐温-100</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的驴抗兔二&amp;deg; 抗体</td><td>Invitrogen - Molecular Probes</td><td>A21206</td><td></td></tr></tbody></table>

活体培养神经元抗体孵育后细胞表面与内化蛋白的差异标记

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

为了验证一种假定的跨膜受体在培养神经元中的细胞表面定位，我们使用针对该蛋白胞外区域产生的特异性一抗，对活神经元表面的蛋白进行了标记。由于受体蛋白会在细胞表面与内部之间转运，如果在固定后对细胞进行通透处理，则同一标记的二抗将同时检测到位于细胞表面和细胞内部的蛋白。在此，我们改进了一种用于研究蛋白转运的方法（“抗体饲喂”法），以区分在抗体孵育期间通过内吞作用被内化的蛋白，以及在此期间仍保留在细胞表面或被转运至细胞表面的蛋白。这种区分两种蛋白池的能力，依赖于在初始孵育步骤中使用荧光标记的二抗处理未通透的神经元后，加入一个过夜的封闭步骤——即用高浓度的未标记二抗进行封闭。封闭步骤完成后，对神经元进行通透处理，即可利用另一种带有不同荧光染料标记的荧光二抗检测被内化的蛋白池。通过该技术，我们获得了关于这种假定受体亚细胞定位的重要信息，证实其确实在神经元中被转运至细胞表面。该技术具有广泛的适用性，可应用于多种细胞类型和细胞表面蛋白，前提是存在针对胞外表位的合适抗体。

本文介绍的双色荧光免疫染色技术可用于标记活细胞中跨膜蛋白的胞外结构域（示意图见图1）。在孵育过程中，免疫球蛋白会结合可接近的表位，部分蛋白分子群体连同已结合的抗体被内吞进入细胞。此外，新合成的蛋白可通过正向运输到达细胞表面，而循环再利用的蛋白分子也可能被重新返回至质膜10。
该方法已针对同一靶蛋白的两种不同蛋白池——细胞表面蛋白和内化蛋白的检测进行了优化，使用针对目标蛋白的同一种一抗进行检测。通过在细胞固定后、透化前加入一种荧光标记的二抗，可检测固定时位于细胞表面的蛋白。通过充分的封闭步骤，阻止初始荧光二抗未结合的剩余蛋白-一抗表面复合物的非特异性结合，从而可在后续步骤中利用另一种不同荧光素标记的二抗检测在孵育期间被内吞的蛋白-抗体复合物（图 1）。
本方法获得的双色标记代表性图像见图2。加入长时间（过夜孵育）的阻断步骤，使用相应的未标记二抗，旨在饱和结合任何残留的表面蛋白/一抗复合物，该步骤被证明对本方...

我们描述了一种利用特异性多克隆抗体标记活神经元表面蛋白的方法，该抗体针对细胞外表位。通过内吞作用被抗体结合并在细胞表面内化的蛋白，可与在孵育期间仍停留在表面或转运至表面的蛋白区分开来。

为了证明培养神经元中一种假定的跨膜受体在细胞表面的定位，我们对细胞表面的蛋白质进行了标记……

本实验的总体目标是对活神经元表面的蛋白质进行标记，并通过差异化的二抗标记来区分表面蛋白与内化蛋白。为此，将培养在盖玻片上的原代神经元与针对表面表位的一抗共同孵育，并进行孵育以允许蛋白内化。孵育结束后，加入荧光标记的二抗以识别暴露在细胞表面的蛋白质。然后加入过量的未标记二抗，以封闭任何残留的表面蛋白与一抗形成的复合物。接着对培养的神经元进行透化处理，并加入另一种不同荧光颜色的二抗，以检测内化的蛋白。最终可通过免疫荧光显微镜获得结果，显示内化蛋白与表面蛋白的相对水平。通过该实验流程，可获得来源细胞表面蛋白内吞的时间过程数据，从而获取基础状态及刺激条件下蛋白转运速率的相关信息。开始该流程时，需预先准备用于细胞培养的盖玻片：将前一天用多聚赖氨酸包被的18毫米圆形玻璃盖玻片依次浸入三个分别盛有PBS的漂洗容器中进行清洗。向12孔板的每个孔中加入500 µL 层粘连蛋白溶液，然后用镊子将盖玻片放入各孔中。轻压每张盖玻片，确保其平整地贴附于孔底，随后在37°C条件下孵育2小时。本实验方案可使用E15小鼠大脑皮层或E18大鼠海马组织进行。本实验中使用小鼠大脑皮层组织。取自半窝或一窝胚胎的大脑皮层组织置于含有钙和镁的 PBS 中，放入一毫升离心管，冰上放置。随后，使用一毫升微量移液器将皮层组织中的 PBS 液体吸除。然后向来自半窝胚胎的皮层组织中加入 500 µL 的 Pappa DNA 溶液。在 37°C 下孵育 15 至 20 分钟。孵育期间每隔一段时间轻轻弹动管子两次以混匀内容物。孵育结束后，使用经火焰抛光的硅化巴斯德移液管轻轻吹打组织 10 至 15 次，直至获得单细胞悬液。应尽量避免有未解离的组织块残留，同时避免产生气泡。将解离后的细胞悬液小心地分层加在含有添加剂的 Hank's BSS 溶液中 3 毫升的 4% BS 离心垫上。然后在台式离心机中使用摆出式转子，以 100 × g 离心 7 分钟。离心后，小心移除上清液，注意不要吸出细胞沉淀。然后加入1 mL完全神经基础培养基，轻轻吹打混匀以重悬沉淀的细胞。接下来，使用血细胞计数板测定活细胞浓度。铺板前应仅将相位明亮的细胞视为活细胞。吸除孔中盖玻片上的过量层粘液血清溶液，并替换为原代神经元培养基。然后向每孔加入75,000至100,000个原代神经元。将神经元在神经基础培养基中培养至多21天，培养条件为37摄氏度、5%二氧化碳。从第7天开始，此后每周添加抗有丝分裂剂氟代脱氧尿苷和尿苷，以防止胶质细胞过度生长，并进行半量培养基更换。在培养的第一周内，神经元会发育出树突分支，如本图所示的两天培养龄的神经元图像所示。到第二至第三周，神经元将趋于成熟并开始突触形成。在体外培养第14天时，通过广泛的投射网络示意图标记目标表面暴露蛋白，将一抗按适当浓度直接加入条件培养基中。每种条件应设三个重复。可使用四种对照：前免疫血清或识别蛋白胞内区域（在胞吐过程中未暴露）的抗体，其稀释度应与待测一抗相同。孵育后，将细胞放回培养箱中继续培养1小时、2小时或4小时，随后吸除含抗体的培养基，用PBS轻轻且迅速地洗涤孔板一次。加入室温溶液至孔板中，然后吸除。接着加入新配制的4%多聚甲醛，在室温下固定细胞，孵育五分钟。固定完成后，再次加入室温溶液以维持细胞状态。从孔中移除多聚甲醛溶液，并在通风橱内将其弃入液体废液容器中。随后，用 PBS 快速冲洗细胞三次，操作同前。保留第三次洗涤液，以便于轻松取出盖玻片。接下来，使用镊子小心地从培养板上取下盖玻片，将细胞面朝上放置在一次性培养皿底部或盖子的Parafilm膜上。后续染色步骤将在该表面上进行。轻柔地用移液器将含5% BSA的PBS封闭液滴加到细胞上，在盖玻片上形成一个圆润的液滴，防止其干燥。孵育30分钟。需要注意的是，封闭液中切勿添加去污剂。当仅需标记细胞表面蛋白时，此阶段不应使细胞通透化。封闭完成后，吸除封闭液，随后加入荧光标记的二抗以标记暴露在细胞表面的蛋白，室温孵育两小时。孵育结束后，吸除二抗溶液，用 PBS 洗涤盖玻片两次，每次五分钟，以封闭未被标记二抗结合的细胞表面蛋白。将非通透性神经元与高浓度未标记的二抗在室温下孵育过夜。过夜孵育至关重要。较短的孵育时间无法完全阻断未与标记的二抗充分结合的一抗。第二天，用 PBS 如前所述将盖玻片洗涤两次，每次五分钟。然后在去除固定剂后，用含 4% 甲醛的磷酸盐缓冲液在室温下对细胞进行后固定，持续五分钟。用 PBS 快速冲洗细胞两次。接下来进行细胞内标记，使用含有 5% BSA 和 0.1% Triton X-100 的 PBS 在室温下对细胞进行通透和封闭，持续 30 分钟。通透结束后，移除封闭液。注意防止盖玻片干燥。加入另一种标记的二抗，在室温下孵育两小时。去除第二种二抗后，用 PBS 洗涤盖玻片三次，每次五分钟。然后用去离子水短暂清洗，将盖玻片用含有抗淬灭剂的水性封片剂封固在玻璃载片上，室温干燥后于4°C避光保存，以最佳保留荧光信号。使用共聚焦显微镜，配合适当的激发和发射滤光片，对免疫染色细胞进行成像。成像后，对所有重复样本和条件使用相同的成像采集参数。使用标准图像分析软件（如 Fiji ImageJ 或 MetaMorph），测定选定标准区域的积分密度，或分析 Punta 属性（如数量和大小），以确定癫痫相关基因 six（seizure related gene six）或 says six 是否存在于神经元表面并被内化。培养的大鼠海马神经元双色标记实验按照本视频所述方法进行。在此图像中，标记的细胞表面蛋白显示为青色，而内化蛋白显示为绿色。仅在看似不健康的细胞中观察到由箭头指示的双染信号。为了确定在抗体孵育摄取过程中内化的蛋白是否定位于内体，对表达早期再循环内体标志物转铁蛋白mCherry的神经元在透化后进行免疫染色。如树突分支区域所示，点状染色与转铁蛋白存在广泛重叠，证实内化的蛋白定位于内体。该技术相较于现有方法的主要优势在于，仅需使用一种抗体即可区分细胞表面与内化蛋白群体。

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