Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

以下实验的总体目标是研究蛋白质分子和蛋白质包被的珠子与解聚微管末端的运动。这是通过组装一个可重复使用的流通室和一个尺寸干净的盖玻片来实现的。接下来，制备微管种子，附着在盖玻片上，用于成核微管，然后用光可破坏帽暂时稳定微管。

然后将 GFP 标记的蛋白质或蛋白质包被的微珠引入流速室并与分段的微管结合。然后通过光消融去除瓶盖来触发微管解聚。用 CH 分析图像以确定标记的蛋白质是否表现出尖端跟踪行为，即随解聚微管末端的运动。

该技术的主要优点是它允许以高时间和特殊分辨率触发微管化。这种方法的视觉演示至关重要。该方案从流动室准备和组装开始 使用超声波研磨。

将常规显微镜载玻片修改为具有两个凹槽。使凹槽相距 14 毫米。或多或少 1 毫米，这对于使用 22 毫米方形盖玻片组装的腔室来说是最佳的。

接下来，在滑轨的每个凹槽中放置一根 100 毫米长的聚乙烯管，在凹槽的内端留出约 5 毫米的悬垂部分。用氰基丙烯酸酯胶将管子固定在凹槽内，将管子完全嵌入凹槽内。小心地用环氧树脂胶填充凹槽，不要溢出。

让它干燥一天。第二天。使用锋利的剃须刀片切割凝固的胶水，距离每个附着部位的远端 3 到 4 毫米。

移除滑轨中心附近的部件。管子应保持在凹槽中，切口应使表面具有管子开口。接下来，将注射器装满水并测试管子是否正常工作。

如果液体自由流动，请在凹槽的外端滴一滴直径约 5 毫米的环氧树脂胶，并使其干燥约一天。因此，完成的流通室经久耐用，可以重复使用数月。这个 3 小时的方案准备了 12 个盖玻片。

它需要一个通风橱、一个陶瓷盖玻片架、三个 15 毫升染色罐和 1250 毫升带盖玻璃罐。染色罐必须叠放四个常规编号为 1 22 毫米的盖玻片。首先在陶瓷支架中堆放 12 个预先清洁和干燥的盖玻片。

在罐子中加入加一排斥硅烯溶液，然后慢慢降低载玻片。盖上罐子，在室温下孵育 5 分钟。确保均匀的盖玻片文明最关键的步骤是避免在 Selene 溶液中孵育盖玻片期间出现任何水痕迹。

此步骤对于微输卵管种子的紧密附着至关重要。稍后在方案中，当盖玻片准备好后，从罐子中取出陶瓷支架。然后使用涂有特氟龙的镊子将盖玻片从陶瓷支架单独转移到装有甲醇的染色罐中。

现在将三个罐子装入带有金属或玻璃底座的声波浴的储水器中。水位应为罐子高度的三分之二，以 70 瓦的功率对罐子进行超声处理 20 分钟。在超声处理过程中，每 5 分钟更换一次甲醇溶液。

超声处理完成后，冲洗干净，用去离子水将盖子滑干净 10 次。如果筒仓工作正常，盖玻片会显得干燥 从水中取出时，无论外观如何，都要彻底清除任何残留的水。使用氮气转移，干燥的盖子滑入氮气干燥的可密封容器中。

Interlay Kim 擦拭盖玻片之间。它们可以在室温下以这种方式储存数周。该方案需要一到两个小时，一个流动室和准备好的 G-M-P-C-P-P 稳定的微管种子。

首先，组装流通室。沿着准备好的载玻片的中央 5 毫米宽区域贴上两块双面胶带，然后将盖玻片用力压在胶带上。使用 1 毫升注射器，通过试管向腔室中注入 100 微升 B rrb 80 溶液。

接下来，在一个小塑料培养皿上挤一小滴两种彩色的快速浇注密封剂。用牙签快速彻底混合。它将变为绿色。

立即沿着盖玻片的所有边缘涂抹密封剂。检查密封剂是否在盖玻片下渗透得太深。如果管子堵塞，请拔下注射器并提起管子以施加温和的压力，以防止密封剂泄漏 10 分钟后，确保溶液流动不受限制。

然后将腔室转移到 32 摄氏度的加热显微镜载物台上。将一根管子连接到泵上以去除溶液。将进样管的自由端浸入装有温热 BRB 80 缓冲液的 0.5 mm 样品瓶中。

将泵设置为每分钟 100 微升，并根据需要使用它来轻轻推出气泡。这也可以手动完成。现在使用泵加载 30 μL 温热抗原抗体。

关闭泵并等待 5 分钟。在所有孵育期间关闭泵。接下来，用大约 100 微升温热的 b rrb 80 清洗腔室。

然后在 BRB 80 中灌注 50 微升 1%onic F1 27。等待 10 分钟，让它堵塞筒仓盖玻片的疏水表面。现在用 100 微升的运动缓冲液清洗腔室。

接下来，将泵速降低至每分钟 15 微升，并在腔室中加入 30 至 40 微升微管种子，在运动缓冲液中稀释 1 至 200 至 1 至 600。将种子孵育 15 分钟，然后以每分钟 100 微升的速度用 400 微升运动缓冲液洗涤腔室，以去除任何未结合的材料。接下来，将泵速降低至每分钟 30 微升，并用预热的未标记微管蛋白溶液灌注腔室。

该协议最关键的方面是避免气泡。使用新鲜制备的微管蛋白溶液并遵循方案的确切时间，尤其是在微管帽期间。在 5 到 7 分钟的孵育过程中，使用 DIC 光学元件监测微管的生长情况。

微管通常长出约 10 微米，快速将溶液与战前瘤胃肠微管蛋白混合物交换，并允许多孵育 8 到 10 分钟。用 100 μL 的运动缓冲液以每分钟 20 μL 的速度充分清洗腔室，以去除湍流和核苷酸，以及可溶性微管片段。接下来，用 GFP 标记的蛋白质或蛋白质包被的珠子的加热溶液灌注腔室，然后进行成像酵母动力学成分 DAM，其中 1 个用 GFP 标记，从细菌细胞中纯化并用作尖端追踪测定的阳性对照。

这种蛋白质与微管的解聚端一起跟踪，并稳步向盖玻片附着的种子移动。这些蛋白质在相应的图表上显示为一条斜线，然后可以对其进行分析以确定尖端示踪复合物中的蛋白质分子数量。该分析在文本协议中有详细说明。

相比之下，未能进行尖端追踪的蛋白质在拆解微末端不显示荧光信号的富集。这在人 NDC 80 GFP 蛋白中可见。蛋白质包被的微珠和微管之间的结合通常非常强，因此当微珠添加到显微镜室中时，它们很容易结合到分段的盖玻片连接的微管上。

当珠子追踪是进行性的时，可以进行许多观察。附着在一个微管上的珠子显示出类似弧形的运动，因为微管围绕其生长部位略微旋转。当稳定帽被照亮时，如果只能在种子和珠子的远端看到一个红色片段，则珠子连接到一个微管上。

可以看到瓶盖跟随珠子的运动，直到瓶盖被漂白漂白后不久，珠子的运动似乎与微管方向一致。随着微管缩短并且珠子向种子移动，弧状振荡的幅度减小。如果珠子未能与稳定的微管形成持久的附着。

可以使用激光捕获具有加末端定向驱动蛋白 SE E 的不同蛋白质构建体的珠子，需要这种技术在 TP 存在下将珠子发射到分段的微管壁上。这些珠子在图表上迅速向加帽的微管正端移动。这种运动导致在帽被破坏后，一条斜线指向帽。如绿色箭头所示，涂有截短 spy 蛋白的珠子从微管中分离。

相比之下，具有全长 B 蛋白的微珠可以维持相反方向的运动。这在 chm 图上被视为锯齿形图案，这是由于在与微管的正端和/或负端相反的方向上运动的。看完这个视频，你应该对如何准备流动室和生长分段的微管有一个很好的了解，以研究由微输卵管拆卸驱动的运动。