制备分段微管以研究由微管末端解聚驱动的运动

以下实验的总体目标是研究蛋白质分子和蛋白质包被的微珠与去聚合微管末端之间的相互作用。该目标通过组装一个可重复使用的流动室来实现，该流动室使用尺寸规整且洁净的盖玻片。随后，在盖玻片上制备附着的微管种子，用于引发微管的成核，并利用光可解离帽结构暂时稳定这些微管。

然后将GFP标记的蛋白质或包被有蛋白质的微珠引入流动室，使其与分段的微管结合。通过光解去除末端保护帽来触发微管去聚合。利用CH分析图像，以确定标记的蛋白质是否表现出末端追踪行为，即随去聚合微管末端移动的现象。

该技术的主要优势在于能够以高时间分辨率和空间分辨率触发微管的组装。本方法的可视化演示至关重要。该方案首先通过超声铣削进行流动腔的制备与组装。

将普通显微镜载玻片改造成具有两条凹槽的结构。两条凹槽之间的距离为14毫米，允许正负1毫米的误差，此间距最适合使用22毫米见方的盖玻片组装的腔室。

接下来，在载玻片的每条凹槽内放置一根100毫米长的聚乙烯管，使管子在凹槽内端各留出约5毫米的伸出部分。使用氰基丙烯酸酯胶水将管子固定在凹槽内，确保管子完全嵌入凹槽中。小心地用环氧树脂胶填充凹槽，避免溢出。

静置干燥一天。第二天，使用锋利的刀片从每个粘附位点远端末端起始处向内3至4毫米处切割已固化的胶水。

移除载玻片中心部位近端的多余部分。管子应保持在凹槽内，切割应形成带有管口的平整表面。接着，用注射器吸入水，检测管子是否正常工作。

如果液体能够自由流动，在槽的外端各放置一滴直径约五毫米的环氧胶，并静置约一天使其干燥。制备完成的流体腔室因此具有良好的耐用性，可重复使用数月之久。此实验方案耗时三小时，可制备12个盖玻片。

需要一个通风橱、一个陶瓷盖玻片架、三个15毫升的染色缸，以及一个带盖的250毫升玻璃瓶。染色缸必须能够容纳四片常规的1号22毫米盖玻片叠放。从陶瓷架中放置一叠12片预先清洁并干燥的盖玻片开始操作。

在瓶中加入足量的Plus One Repel Silene溶液，然后缓慢将载玻片放入其中。盖上瓶盖，在室温下孵育5分钟。确保盖玻片表面均匀处理的最关键步骤是：在盖玻片于Selene溶液中孵育期间，必须避免任何水迹残留。

此步骤对于微管状种子的牢固附着至关重要。在后续操作中，当盖玻片准备就绪后，从玻璃瓶中取出陶瓷支架，然后使用聚四氟乙烯涂层镊子将盖玻片从陶瓷支架逐一转移至盛有甲醇的染色缸中。

现在将三个烧杯放入装有金属或玻璃支架的超声波清洗槽的水槽中。水位应达到烧杯高度的三分之二，以70瓦功率超声处理20分钟。在超声过程中，每5分钟更换一次甲醇溶液。

超声处理完成后，用去离子水将盖玻片彻底冲洗10次。如果硅烷化处理成功，盖玻片从水中取出后应呈现干燥外观；无论外观如何，都必须彻底去除任何残留水分。使用氮气转移法，将干燥的盖玻片转移至装有氮气的可密封容器中。

Interlay Kim 在盖玻片之间进行铺展。如此可在室温下保存数周。本实验方案需要一至两个小时，一个流动腔室，以及制备好的 G-M-P-C-P-P 稳定的微管成核种子。

首先，组装流式室。将两段双面胶带沿已准备好的载玻片中央宽5毫米的区域粘贴，并将盖玻片牢固地压在胶带上。使用1毫升注射器，通过管路向室内加入100 µL的B rrb 80溶液。

接下来，在一个小的塑料培养皿顶部挤出少量双色快速固化密封胶。用牙签迅速而彻底地混合，混合物将变为绿色。

立即沿盖玻片的所有边缘涂抹封片剂。检查封片剂是否过度渗入盖玻片下方。若管道被堵塞，拔下注射器并抬起管道，施加轻柔压力以防止封片剂渗入。10 分钟后，确保溶液流动未受阻碍。

然后将样品室转移至预热至32摄氏度的显微镜载物台上。将其中一根管路连接至泵以用于溶液去除。将进样管的游离端浸入装有温热BRB 80缓冲液的0.5毫米样品瓶中。

将泵的流速设置为每分钟100微升，并根据需要轻轻推动以排出气泡。此步骤也可手动完成。现在使用泵加载30微升温热的抗原抗体。

关闭泵并等待五分钟。所有孵育期间均需关闭泵。接下来，用约 100 微升温热的 b rrb 80 清洗室。

然后向其中灌注 50 µL 含 1% F127 的 BRB80 缓冲液。静置 10 分钟，使其阻断硅化盖玻片的疏水表面。随后用 100 µL 运动缓冲液洗涤反应室。

接下来，将泵速降低至 15 微升/分钟，并向腔室中灌注 30 至 40 微升微管种子溶液，该溶液用运动缓冲液按 1:200 至 1:600 的比例稀释。孵育 15 分钟后，以 100 微升/分钟的速度用 400 微升运动缓冲液冲洗腔室，以去除未结合的物质。随后，将泵速降至 30 微升/分钟，并向腔室中灌注预热的未标记微管蛋白溶液。

本方案最关键的步骤是避免产生气泡，使用 freshly prepared tubulin 溶液，并严格遵循实验步骤的时间要求，尤其是在微管末端封闭过程中。在 5 到 7 分钟的孵育期间，利用 DIC 光学系统监测微管的生长情况。

微管通常快速生长约10微米后，更换为预热的Rumine微管蛋白混合液，并继续孵育8到10分钟。用100微升运动缓冲液以每分钟20微升的速度充分洗涤反应腔，以去除湍流、核苷酸以及可溶性微管片段。接着，将反应腔灌注温热的GFP标记蛋白溶液或包被蛋白的微珠溶液，并开始成像。酵母动粒组分DAM1（用GFP标记）从细菌细胞中纯化获得，并作为尖端追踪实验的阳性对照。

这类蛋白质会追踪微管的去聚合末端，并持续向附着在盖玻片上的成核种子移动。在相应的图像中，这些蛋白质呈现为一条斜线，可通过分析该斜线来确定末端追踪复合物中蛋白质分子的数量。该分析方法在文本方案中有详细说明。

相比之下，无法追踪微管末端的蛋白质在去组装的微管末端不会显示出荧光信号的富集。人类NDC80-GFP蛋白即表现出这种现象。蛋白包被的微珠与微管之间的结合通常非常牢固，因此当微珠被加入显微镜观察室时，会迅速结合到固定在分段盖玻片上的微管。

当珠子追踪具有持续性时，可进行多次观测。附着于单根微管的珠子会呈现弧线状运动，因为微管在其生长位点周围发生轻微摆动。当稳定帽被光照激活时，若仅能在种子和珠子的远端观察到一个红色片段，则表明该珠子附着于单根微管。

在微管末端结合蛋白（cap）被漂白之前，通常可以观察到其跟随珠状物的运动。漂白后不久，珠状物的运动与微管的取向一致。随着微管的缩短，珠状物向成核位点移动，其弧状振荡的幅度逐渐减小。如果珠状物未能与稳定的微管形成持久的连接，则可能出现异常行为。

激光捕获可用于携带不同蛋白构建体的微珠，这些蛋白构建体包含朝向正端的驱动蛋白SE E，需要利用该技术将微珠锚定在分段的微管壁上，并在ATP存在条件下启动。这些微珠在图像中快速向微管正端的末端帽移动，形成一条指向末端帽的斜线。在末端帽被破坏后，包被截短型Spy蛋白的微珠从微管上解离，如绿色箭头所示。

相比之下，带有全长B蛋白的微珠能够维持反向运动。在chm图上表现为锯齿状模式，这是由于微珠朝微管的正端和/或负端相反方向运动所致。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何制备流动小室以及生长分段微管，以研究由微管解聚驱动的运动。