Name: 分段微管的制备研究运动驱动的微管拆解完 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: 了解分段微管制备技术，用于研究运动驱动的微管拆解过程。该方法利用光可降解稳定帽实现精确控制，帮助分析蛋白质分子与微管末端的动态相互作用。

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作者感谢 F. I. Ataullakhanov 在可重复使用流动腔室的设计与制造方面提供的帮助，感谢 N. Dashkevich、N. Gudimchuk 和 A. Korbalev 提供图示所用图像，感谢 N. Gudimchuk 和 P. Zakharov 开发实验方案并提供用于制备地高辛标记微管种子的试剂，感谢 A. Potapenko 在文本编辑方面的协助，以及 Grishchuk 实验室其他成员提供的建议与讨论。本研究部分由 NIH 基金 GM R01-098389 及宾夕法尼亚肌肉研究所向 E.L.G. 提供的启动基金资助，E.L.G. 为基梅尔学者；F. I. Ataullakhanov 获俄罗斯基础研究基金会（RFBR）基金 12-04-00111-a、13-04-40190-H 和 13-04-40188-H，以及俄罗斯科学院主席团资助（分子系统整合机制和分子与细胞分子生物学项目）；J.R. McIntosh 获 NIH 基金 GM R01 GM033787 资助；V.A.V. 获得德米特里·齐明王朝基金会博士后奖学金资助。

作者无任何利益冲突需要披露。

如今，许多单分子实验常规使用经过特殊处理的盖玻片，以显著减少非特异性蛋白质吸附。本文所述方法是对Howard实验室开发的原始方案32的改进。我们发现，即使在基于微分干涉差（DIC）的珠粒实验（不使用荧光）中，对盖玻片进行硅烷化处理也值得付出努力。使用此类盖玻片组装的样品室表面更洁净，在可溶性微管结合蛋白存在条件下获得的实验结果更具可重复性，尤其是在使用极低蛋白浓度时更为明显。
成功制备分段微管（MTs）最关键的步骤是：
<ol>
	<li>微管蛋白浓度和孵育时间的优化（步骤 5.1–5.2）。本方案中提供的孵育时间和浓度为近似值，可能因微管蛋白制备物的差异、反应腔体积的不同而有所变化， 等等.</li>
	<li>微管成核位点与盖玻片的特异性紧密附着，以及</li>
	<li>准确控制流速的能力。在我们的实验中，使用密封的流动腔室进行实验时可获得最佳结果。</li>
</ol>
该方案的主要优势在于，微管去聚合过程可以被高时间分辨率和高空间分辨率地触发，从而有助于分析微管解聚末端的运动行...

微管是高度保守的细胞骨架结构，在细胞形态维持、细胞运动、细胞分裂和细胞内运输中具有重要作用1这些动态聚合物在GTP存在下由微管蛋白组装而成，并能自发地在生长与缩短状态之间转换2微管非常纤细（直径仅为25 nm），因此需采用特殊的光学技术以增强对比度，才能在光学显微镜下观察到微管。以往对这些聚合物的研究曾利用微分干涉差（DIC）技术来观察其动态行为。3。这项及类似的研究 体外 结果显示，在典型的实验条件下，微管发生 catastrophe 并转换为去聚合的现象很少发生，大约每 5-15 分钟一次（该频率对应于在 28-32 °C 下检测的 7-15 mM 可溶性微管蛋白浓度）4因此，人们提出了多种技术以可控的方式诱导微管去聚合。通过洗去可溶性微管蛋白，可触发微管缩短5,6，使用激光束切割微管7或使用片段化的微管8，如本文所述。先前利用被分割的微管以及随机切换状态的聚合物进行的研究发现，较小的细胞内货物（如染色体、囊泡和蛋白质包被的微珠）可在微管缩短的末端发生移动9-13这一现象被认为对有丝分裂细胞中染色体的运动具有直接影响，其潜在机制目前正处于积极研究之中14-16.
近年来，基于荧光的技术（包括全内反射荧光显微镜，TIRF）已被用于研究与动态微管末端相关的运动性17-24该方法的优势在于能够利用不同荧光染料标记的蛋白质，实时观察微管与微管结合蛋白之间的相互作用。研究发现，多种蛋白复合物可随着延伸和/或缩短的微管末端进行持续性移动，其中包括微管相关蛋白Dam110,12,18Ska119，以及 XMAP21520，以及驱动蛋白马达Kif18A21,22，MCAK23 和 CENP-E24这些蛋白质表现出具有持续性的尖端追踪行为，这与经典的尖端追踪蛋白（如 EB1）的追踪方式在本质上不同。25尽管EB1分子及其相关伙伴似乎稳定地与动态微管末端结合，但单个分子与微管尖端的结合仅持续约0.8秒，随后便与可溶性分子库快速交换。26相比之下，像 Dam1 这样的持续性末端追踪蛋白能够随微管末端移动数微米，其与微管末端的结合可持续数十秒。末端结合时间以及由此产生的追踪速率在很大程度上取决于形成末端追踪复合物的分子数量。27较大的蛋白质复合物通常具有更优的追踪微管末端的能力。例如，分离的酵母着丝粒复合体等大型复合结构可与微管末端持续耦合数小时28一些微管结合蛋白， 例如 Ndc80着丝粒蛋白复合物在单分子水平上被发现无法追踪微管末端，然而Ndc80在偶联微珠货物运动方面却非常高效19,29-31因此，为了理解不同蛋白质复合物在尖端追踪中的机制及其生物学功能，有必要研究尖端追踪行为如何依赖于尖端追踪复合物中分子数量的变化，并确定这些复合物在珠状货物表面表现出集体运动能力的情况。
以下我们提供了制备和开展分段微管实验的详细方案（图1A）。首先，将市售的玻璃载玻片进行改造，以连接短段聚乙烯管（方案1）。然后，将该载玻片与经过化学或等离子清洗并硅烷化的盖玻片组装成可重复使用的显微镜流动室（方案2）32-34。最终形成的流动室体积仅为20–25 μl&#160;（或低至15 μl，详见方案1中的注意事项3），包括进样管路的体积。也可使用市售的流动室，但其体积通常较大，会导致蛋白质的不必要浪费。若使用较大的流动室，则下述方案中所有溶液的体积应按比例相应放大。随后制备微管种子，例如使用缓慢水解的GTP类似物GMPCPP（Guanosine-5’-[(α,β)-methyleno]triphosphate）（方案3，另见Hyman&#160;等35）。将种子固定在清洁的盖玻片表面，并对表面进行封闭处理，以防止其他蛋白质的非特异性吸附32（方案4描述了使用地高辛标记进行种子固定的步骤）。随后可使用方案5制备分段微管。该方法的主要原理在于：在GTP存在下形成的动态微管聚合物，可通过添加含有GMPCPP的稳定微管蛋白短段“帽”结构而暂时稳定。这些帽结构中还含有罗丹明标记的微管蛋白，因此只需用530–550 nm的激光或汞弧灯照射视野，即可将其去除（方案6）36。随后可利用尖端追踪信号的荧光强度来估算随解聚微管末端移动的分子数量，同时需考虑显微镜照明视野的不均匀性（方案7）。类似的方法也可用于研究去聚合微管与蛋白包被微珠之间的相互作用，微珠的制备方法如文献27所述（方案8）。某些蛋白质可直接结合到分段微管的管壁上，也可使用光镊将微珠固定在微管壁附近，从而促进其结合。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表1. 显微镜及其他设备。&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>蔡司&lt;br/&gt; 尼康</td><td>Axio Imager 2&lt;br/&gt; Eclipse Ti</td><td>其他能够进行微分干涉差（DIC）和落射荧光成像的显微镜型号也可使用</td></tr><tr><td>目标</td><td>Zeiss&lt;br/&gt; 尼康</td><td>420490-9900-000&lt;br/&gt; CFI Apo 100x Oil 1.49</td><td>100倍，微分干涉差（DIC），数值孔径1.3–1.49</td></tr><tr><td>目标加热器</td><td>Bioptechs</td><td>150803, 150819-19</td><td></td></tr><tr><td>荧光滤光立方体</td><td>染色</td><td>49004 或 49008&lt;br/&gt; 41017 或 49020</td><td>适用于罗丹明荧光的优化条件&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 适用于GFP荧光的优化</td></tr><tr><td>采集软件</td><td>免费软件 MicroManager&lt;br/&gt; Molecular Devices</td><td>不适用&lt;br/&gt; MetaMorph 7.5</td><td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/&lt;br/&gt; 其他软件可用于图像采集和颗粒追踪</td></tr><tr><td>EMCCD相机</td><td>Andor</td><td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td><td>高灵敏度EMCCD相机</td></tr><tr><td>捕获激光</td><td>IPG Photonics</td><td>YLR-10-1064-LP</td><td>1,064 nm 激光，10 W</td></tr><tr><td>荧光激发激光器</td><td>相干公司&lt;br/&gt; Coherent, Inc.</td><td>Sapphire 488 LP&lt;br/&gt; Sapphire 552 LP</td><td>绿色荧光染料的激发&lt;br/&gt; 红色荧光染料的激发</td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>商用流体腔室</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-20 或 RC-30</td><td></td></tr><tr><td>灌流泵</td><td>Cole Palmer&lt;br/&gt; 哈佛仪器</td><td>Masterflex 77120-52&lt;br/&gt; Pico Plus</td><td>两种泵均可提供所需的液体流速，但蠕动泵在极低流速下可能会产生脉冲。注射泵在较宽的流速范围内流量更稳定，但该泵存在惯性。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表2. 显微镜观察室的制备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>用于可重复使用腔室的改良载玻片</td><td>科罗拉多精密玻璃吹制公司</td><td>定制订购 www.precisionglassblowing.com</td><td>使用示意图对载玻片进行超声开槽 &lt;strong&gt;图1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>Intramedic</td><td>427410</td><td>内径 0.58 mm，外径 0.965 mm；使用这些管子将组装好的腔室连接至泵和废液容器</td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>Intramedic</td><td>427400</td><td>内径 0.28 mm，外径 0.61 mm；使用这些管子制作可重复使用的样品室</td></tr><tr><td>普通显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>其他类似的载玻片也可使用</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>48393-150, 48366-067</td><td>其他类似的盖玻片也可使用</td></tr><tr><td>硅密封胶</td><td>世界精密仪器公司</td><td>KIT，5分钟固化硅酮密封胶</td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂胶</td><td>Loctite</td><td>83082</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯粘合剂</td><td>3M 透明胶带</td><td>AD114</td><td>或其他制造商的氰基丙烯酸盐粘合剂</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表3. 盖玻片的清洗与包被。&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>分子筛，564级</td><td>Macron</td><td>4490-04</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片染色缸</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>21036</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片陶瓷支架</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542e40</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Repel Silane</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>抗地高辛抗体</td><td>罗氏应用科学</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表4. 种子及分段微管的制备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>微管蛋白</td><td>从牛脑中纯化&lt;br/&gt; 细胞骨架公司</td><td>&lt;br/&gt; T238P</td><td>纯化方案详见 &lt;sup&gt;49&amp;ndash;51&lt;/sup&gt;&lt;br/&gt; 未标记的猪源微管蛋白</td></tr><tr><td>标记的微管蛋白</td><td>细胞骨架公司&lt;br/&gt; Invitrogen&lt;br/&gt; Invitrogen</td><td>TL590M&lt;br/&gt; C1171（罗丹明）&lt;br/&gt; A-2952（地高辛）</td><td>罗丹明标记的猪微管蛋白&lt;br/&gt; 微管蛋白可用任何胺反应性染料进行标记，方法见参考文献&lt;sup&gt;52&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-405</td><td>分装并储存在 -70 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>VALAP</td><td>按质量比1:1:2的凡士林、羊毛脂和石蜡</td><td></td><td>参见参考文献&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt;</td></tr></tbody></table>

制备分段微管以研究由微管末端解聚驱动的运动

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

微管去聚合可提供驱动力，用于运输不同的蛋白质复合物及蛋白质包被的微珠 体外其潜在机制被认为在细胞分裂过程中依赖微管的染色体运动中起关键作用，但相关蛋白质及其确切功能尚不明确。因此，迫切需要开发可用于研究此类运动的实验方法。 体外 使用纯化的组分和明确的生化环境。然而，微管本质上是不稳定的多聚体，其在生长与缩短状态之间的转换具有随机性且难以控制。本文所述的实验方案利用了带有光可消融稳定帽的节段化微管。此类节段化微管的去聚合可被高时间和空间分辨率地触发，从而有助于对微管解聚末端的运动行为进行研究。该技术可用于对荧光标记的蛋白质复合物中分子数量进行定量分析，这些复合物能够随着动态微管末端持续移动。为了优化本实验及其他定量荧光检测中的信噪比，应处理盖玻片以减少可溶性荧光标记蛋白的非特异性吸附。本文提供了详细方案，以校正荧光照明不均的问题，并通过等距高斯拟合确定单个荧光分子的强度。最后，我们描述了利用节段化微管研究蛋白包被微珠沿微管依赖性运动的方法，从而揭示不同马达蛋白和非马达蛋白将微管去聚合过程与货物持续运动相偶联的能力。

利用微管解聚末端进行蛋白质追踪。 酵母着丝粒组分 Dam1 是目前所知对微管解聚末端具有最强追踪能力的末端追踪蛋白14。该十亚基复合物可用 GFP 标记，并可从细菌细胞中高效表达并纯化18,38，因此我们建议将其作为末端追踪实验的阳性对照。能够追踪微管解聚末端的荧光蛋白在显微镜下表现为一个明亮的荧光斑点，持续向固定在盖玻片上的微管种子方向移动（视频 3）。在相应的线扫图（kymograph）中则呈现为一条倾斜的亮线（图 2E）。相反，若该蛋白无法实现末端追踪，则微管缩短过程中其末端不会出现荧光信号富集，例如人源 Ndc80-GFP 复合物的情况19（图 2F）。当观察到持续性追踪时，可通过追踪移动的荧光斑点，或测量线扫图中斜线的斜率来确定微管缩短速率。该参数可反映蛋白质与微管末端结合的强度45。与微管结合较强的蛋白质（如 Dam1 环状复合物）会减缓微管解聚的速率。然而，这种效应在很大程度上取决于末端追踪复合物的大小...

微管是本质上不稳定的多聚体，其在生长与缩短之间的转换具有随机性且难以控制。本文描述了使用带有可光解稳定帽的节段化微管的实验方案。通过高时间和空间分辨率触发节段化微管的去聚合，从而有助于分析由微管解聚末端所驱动的运动过程。

微管去聚合可在体外为运输不同的蛋白质复合物及蛋白质包被的微珠提供动力。其潜在机制是……

以下实验的总体目标是研究蛋白质分子和蛋白质包被的微珠与去聚合微管末端之间的相互作用。该目标通过组装一个可重复使用的流动室来实现，该流动室使用尺寸精确且洁净的盖玻片。随后，在盖玻片上制备附着的微管种子，用于成核生成微管，并利用光可解离帽结构暂时稳定这些微管。然后将GFP标记的蛋白质或包被有蛋白质的微珠引入流动室，使其与分段的微管结合。通过光解去除末端保护帽后，触发微管去聚合。利用CH分析图像，以确定标记的蛋白质是否表现出末端追踪行为，即随去聚合微管末端移动的现象。该技术的主要优势在于能够以高时间分辨率和空间分辨率触发微管组装。本方法的可视化演示至关重要。该方案首先使用超声铣削进行流动腔室的制备与组装。将普通显微镜载玻片改造成具有两条凹槽的结构，使两条凹槽之间的距离为14毫米，允许正负1毫米的误差，此间距最适合使用22毫米见方的盖玻片组装的腔室。接下来，在载玻片的每条凹槽内放置一根100毫米长的聚乙烯管，使管子在凹槽内端各露出约5毫米。使用氰基丙烯酸酯胶水将管子固定在凹槽内，确保管子完全嵌入凹槽中。小心地用环氧树脂胶填充凹槽，避免溢出。静置干燥一天。第二天，使用锋利的刀片从每个粘附位点远端末端起始处向内3至4毫米处切割已凝固的胶水。移除载玻片中心部位近端的多余部分。管子应保持在凹槽内，切割应形成带有管口的平整表面。接下来，用注射器吸取水，检测管子是否正常工作。如果液体能够自由流动，在槽的外端各放置一滴直径约五毫米的环氧胶，并静置约一天使其干燥。制备完成的流体腔室因此具有良好的耐用性，可重复使用数月之久。此实验方案耗时三小时，可制备12个盖玻片。需要一个通风橱、一个陶瓷盖玻片架、三个15毫升的染色缸，以及一个带盖的250毫升玻璃瓶。染色缸必须能够容纳四片常规的1号22毫米盖玻片叠放。从陶瓷架中放置一叠12片预先清洁并干燥的盖玻片开始操作。将广口瓶装满Plus One Repel Silene溶液，缓慢放入载玻片。盖上瓶盖，在室温下孵育5分钟。确保盖玻片表面均匀处理的最关键步骤是在盖玻片于Selene溶液中孵育期间避免任何水分残留。此步骤对于微管状种子的牢固附着至关重要。在后续实验流程中，当盖玻片准备就绪后，从玻璃瓶中取出陶瓷支架，然后使用聚四氟乙烯涂层镊子将盖玻片从陶瓷支架上逐一转移至盛有甲醇的染色缸中。现在将三个烧杯放入装有金属或玻璃支架的超声波清洗槽的水槽中。水位应达到烧杯高度的三分之二，以70瓦功率超声处理20分钟。在超声过程中，每5分钟更换一次甲醇溶液。超声处理完成后，用去离子水将盖玻片彻底冲洗10次。如果硅烷化处理成功，盖玻片从水中取出后应呈现干燥外观；无论外观如何，都必须彻底去除所有残留水分。使用氮气转移法，将干燥的盖玻片转移至充满氮气的可密封容器中。Interlay Kim 在盖玻片之间进行铺展。如此可在室温下保存数周。本实验方案需要一至两个小时，一个流动腔室，以及制备好的 G-M-P-C-P-P 稳定的微管成核种子。首先，组装流式室。将两段双面胶带沿已准备好的载玻片中央宽五毫米的区域粘贴，并将盖玻片牢固地压在胶带上。使用1毫升注射器，通过导管向室内加入100 µL的B rrb 80溶液。接下来，在一个小的塑料培养皿顶部挤出少量双色快速固化密封剂。用牙签迅速而彻底地混合，混合物将变为绿色。立即沿盖玻片的所有边缘涂抹封片剂。检查封片剂是否过深地渗入盖玻片下方。如果管道被堵塞，拔下注射器并抬起管道，施加轻柔压力以防止封片剂渗入。10分钟后，确保溶液流动未受阻碍。然后将样品室转移至预热至32摄氏度的显微镜载物台上。将其中一根管路连接至泵以用于溶液移除。将进样管的游离端浸入装有温热BRB 80缓冲液的0.5毫米样品瓶中。将泵的流速设置为100微升每分钟，并根据需要轻轻推动以排出气泡。此步骤也可手动完成。现在使用泵加载30微升温热的抗原抗体。关闭泵并等待五分钟。所有孵育期间均需关闭泵。接下来，用约 100 µL 温热的 b rrb 80 清洗室。然后向其中灌注 50 微升含 1% F127 的 BRB80 缓冲液。静置 10 分钟，使其封闭硅化盖玻片的疏水表面。随后用 100 微升运动缓冲液洗涤反应腔室。接着，将泵速降低至 15 微升每分钟，并以 30 至 40 微升在运动缓冲液中稀释 1:200 至 1:600 的微管种子溶液灌注腔室。孵育 15 分钟后，以每分钟 100 微升的速度用 400 微升运动缓冲液冲洗腔室，以去除未结合的物质。随后，将泵速降至 30 微升每分钟，并向腔室灌注预热的未标记微管蛋白溶液。该实验方案最关键的步骤是避免产生气泡。使用 freshly prepared tubulin 溶液，并严格遵循实验流程的时间控制，尤其是在微管末端封闭过程中。在 5 至 7 分钟的孵育期间，利用 DIC 光学显微镜监测微管的生长情况。微管通常快速生长约10微米后，更换为预热的Rumine微管蛋白混合液，并继续孵育8到10分钟。用100微升运动缓冲液以每分钟20微升的流速充分洗涤反应腔，以去除湍流、核苷酸以及可溶性微管片段。接着，向反应腔灌注温热的GFP标记蛋白溶液或包被蛋白的微珠溶液，并开始成像。酵母动粒组分DAM1（用GFP标记）从细菌细胞中纯化获得，并作为尖端追踪实验的阳性对照。这类蛋白质会追踪微管的去聚合末端，并持续向附着在盖玻片上的成核种子移动。在相应的图像中，这些蛋白质呈现为一条斜线，可通过分析该斜线来确定末端追踪复合物中蛋白质分子的数量。该分析方法在文本方案中有详细说明。相比之下，无法实现尖端追踪的蛋白质在去组装的微管末端不会显示出荧光信号的富集。人类NDC80-GFP蛋白即表现出这种现象。蛋白质包被的微珠与微管之间的结合通常非常牢固，因此当微珠被加入显微镜观察室时，会迅速结合到固定在分段盖玻片上的微管。 当珠子追踪具有持续性时，可进行多次观测。附着于一条微管上的珠子会呈现弧线状运动，因为微管在其生长位点周围发生轻微摆动。当稳定帽被光照激活时，若仅能在种子和珠子的远端观察到一个红色片段，则表明该珠子附着于一条微管上。在帽结构被漂白之前，通常可以观察到其随着类似珠子的运动而移动。漂白后不久，珠子的运动与微管的方向一致。随着微管缩短，珠子向成核位点移动，弧状振荡的振幅逐渐减小。如果珠子无法与稳定的微管形成持久的连接，则实验可能失败。激光捕获可用于携带不同蛋白构建体的微珠，这些构建体含有朝向正端的驱动蛋白SE E，需要利用该技术在ATP存在的情况下将微珠附着到分段的微管壁上。这些微珠在图像中迅速向加帽的微管正端移动，形成一条朝向帽端的斜线。在帽端被破坏后，运动轨迹发生改变。如绿色箭头所示，包被截短型Spy蛋白的微珠从微管上脱离。相比之下，带有全长B蛋白的微珠能够维持反向运动。在chm图上表现为锯齿状模式，这是由于微珠朝微管的正端和/或负端相反方向运动所致。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何制备流动小室以及生长分段微管，以研究由微管解聚驱动的运动。

preparation-segmented-microtubules-to-study-motions-driven

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

分段微管的制备研究运动驱动的微管拆解完

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