Name: 快速合成及其与绿色荧光蛋白为基础的记者化学激活的转录因子筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-26T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学习在酵母中构建人工转录因子并评估其诱导GFP表达的能力。该方法通过酵母转化、报告质粒构建和流式细胞术分析，实现对基因功能的快速可逆调控。

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R.S.M. 感谢美国国家科学基金会研究生研究奖学金的资助。M.B.N. 感谢 Lewis-Sigler 奖学金以及 Peter Lewis 捐赠的专项基金支持。D.B. 感谢美国国立卫生研究院（NIH，项目编号 GM046406）以及美国国立普通医学科学研究所定量生物学中心（项目编号 GM071508）的资助。我们感谢 Christina DeCoste 在流式细胞术实验中提供的协助。

图2展示了方案第1-3部分的示意图。
1. 人工转录因子（ATF）的构建
<ol>
	<li>设计用于PCR扩增目标DNA结合域的引物。通过PCR引入与ACT1启动子和激素受体的同源序列（如图3和图4所示），以促进正确重组进入菌株yMN15。</li>
	<li>使用高保真聚合酶PCR扩增目标DNA结合域（DBD）。</li>
	<li>采用乙酸锂法将&#62;1 µg纯化的PCR产物转化入酵母13。</li>
	<li>转化后，在微型离心机中以最高速度离心15秒&#160;，弃去转化混合液。</li>
	<li>用约200 µl&#160;无菌水重悬菌体，并涂布于YPD平板上。</li>
	<li>次日，将YPD平板上的菌落复制转接到5-FOA平板上（5-FOA平板的制备方法见《冷泉港酵母实验手册》）13。</li>
	<li>培养2–4天后，挑取至少5–10个单菌落于YPD平板上划线培养。使用表1中的引物进行菌落PCR，并测序验证插入正确。</li>
</ol>
2. ATF 质粒报告系统的构建
<ol>
	<li>确定ATF的结合位点（最可能来自文献）。</li>
	<li>订购所需结合区域的寡核苷酸（或根据需要订购Ultramers），分别合成具有NotI正确突出末端的正链和反链 &amp;#38; XbaI，如图所示 表2.</li>
	<li>将寡核苷酸稀释至等摩尔浓度（100 &#181;M</li>
	<li>使用T4多核苷酸激酶进行磷酸化，然后在热循环仪中退火。反应条件见于 表3.</li>
	<li>消化约1-2 &#181;pMN8 与 NotI-HF 的克隆连接反应 &amp;#38; XbaI 中于 37 ℃ 消化 1 小时 &#176;C（反应条件在 表4).</li>
	<li>凝胶纯化载体条带。</li>
	<li>将纯化的骨架稀释至 10 ng/μL&#181;l.</li>
	<li>将双链、磷酸化的结合位点稀释至比骨架摩尔浓度高5倍的浓度 &#181;l.</li>
	<li>使用T4 DNA连接酶，在室温下将结合位点连接到已消化的骨架中，反应30分钟&#160;(表5).</li>
	<li>转化时，将一半的连接反应产物加入到50 &#181;l&#160;标准化学感受态 大肠杆菌&#160;例如 XL1-Blue&#160;或 DH5-Alpha。</li>
	<li>热激细胞 45 秒&#160;42 中 &#176;C 水浴中，然后置于冰上 2 分钟。</li>
	<li>加入 900 &#181;l&#160;向转化反应中加入SOC培养基。</li>
	<li>在37℃下培养 &#176;在旋转滚筒上于 C 条件下孵育 1 小时。</li>
	<li>铺板100-200 &#181;每升LB+AMP（100）中的细胞数 &#181;g/ml）培养板中，过夜培养。</li>
	<li>培养至生长阶段&#160;E. coli 在LB+AMP液体培养基中培养并提取质粒DNA。使用连接产物菌落对新报告质粒进行测序验证&#160;引物 5'-GTACCTTATATTGAATTTTC-3'</li>
	<li>使用乙酸锂转化法将新的报告质粒转化至第1部分含ATF的酵母菌株中。</li>
</ol>
3. 使用 GFP 报告系统定量分析 ATF 诱导对基因表达的影响
准备样品：
<ol>
	<li>配制 25 mM β-雌二醇储备液（10 ml&#160;乙醇 + 0.0681 g&#160;β-雌二醇）。置于冰箱中保存。</li>
	<li>在 5 ml&#160;SC-URA 培养基中过夜培养含有 ATF 和报告基因的菌株。</li>
	<li>取九个 250 ml&#160;摇瓶，每瓶加入 25 ml&#160;SC-URA 培养基。</li>
	<li>分别加入 0 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1 µM 或 10 µM 的 β-雌二醇。最简便的方法是将 25 mM β-雌二醇储备液进行 10 倍系列稀释。若需达到 10 µM 的终浓度，则向 25 ml&#160;SC-URA 中加入 10 µl&#160;25 mM β-雌二醇储备液。</li>
	<li>向各摇瓶中加入 125 µl&#160;过夜培养物（1:200 稀释）。</li>
	<li>对于剩余的两个摇瓶，分别接种组成型表达 GFP 的菌株和不表达 GFP 的菌株。这些用于流式细胞仪的校准。</li>
	<li>在 30 °C、200 rpm 条件下振荡培养 12–18 小时。 
	注：最佳培养时间应通过确定加入 β-雌二醇后 GFP 诱导水平不再变化的时间点来确定。</li>
	<li>取每种培养物 500 µl&#160;，分别在 1.7 ml 微量离心管中离心沉淀。</li>
	<li>吸除 SC-URA 培养基。</li>
	<li>用 1 ml&#160;PBS+0.1% Tween-20 洗涤一次，然后吸除。</li>
	<li>加入 1 ml&#160;PBS+0.1% Tween-20 重悬细胞。</li>
	<li>向 Falcon 管中加入 1 ml&#160;PBS+0.1% Tween-20。</li>
	<li>将重悬的细胞加入 5 ml&#160;离心管中（终体积为 2 ml）（可在 4 °C 保存数天）。</li>
	<li>可选：轻微超声处理细胞，以分散可能存在的细胞团块。 
	流式细胞术分析： 概述：通常每样本分析 10,000–100,000 个细胞的荧光信号。数据可在 FlowJo 中处理，或使用 MATLAB 或 R 中的自定义脚本进行分析。务必使用 GFP 阳性和阴性对照校准 GFP 通道的电压。导出 FCS 文件后，可使用如 图6 所示的脚本，结合函数 fca_readfcs（<a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader</a>）来处理数据。</li>
	<li>进行流式细胞术检测。
	<ol>
		<li>利用前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）识别酵母细胞。</li>
		<li>将流速设置为约 3,000 个细胞/秒。</li>
		<li>检测 GFP 荧光信号（FITC 通道）。</li>
		<li>数据采集完成后，导出 .FCS 文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动 MATLAB。</li>
	<li>将 .FCS 文件、fcs_readfcs.m 文件以及类似 图6 中的脚本文件移至同一文件夹。</li>
	<li>将当前工作目录更改为包含数据和脚本的文件夹。</li>
	<li>运行 图6 中的脚本（注：图例为手动输入，以生成 图7 所示结果）。</li>
</ol>
4. 定量分析ATF诱导对细胞生长的影响
<ol>
	<li>从冻存菌种中，分别将（1）含ATF的菌株和（2）不含ATF的菌株（如yMN15）划线接种至不同的YPD平板上。</li>
	<li>培养2天后，接种至含有5 ml培养基的独立培养管中&#160;YPD液体培养基中分别接种各菌株，30℃过夜培养 &#176;C.</li>
	<li>进行0.25 mM的10倍系列稀释 &#946;-雌二醇储备液最高稀释10,000倍（0.025 &#181;M &#946;-雌二醇）溶于100%乙醇中。</li>
	<li>加入40 &#181;l&#160;将过夜培养物接种至10 ml&#160;YPD 液体培养基（1-250 稀释度）。</li>
	<li>每种菌株分别加入 96 &#181;l&#160;将稀释后的细胞加入96孔板的18个孔中。</li>
	<li>加入4 &#181;l&#160;的 &#946;-雌二醇加入细胞中。关键步骤是确保每个孔中的总体乙醇量相同。（或者，可使用更高浓度的储备液 &#946;-雌二醇可被使用，随后稀释至乙醇对生长的影响无法测出的程度。</li>
	<li>每组实验重复三次。每种菌株应设置三个仅含乙醇的对照孔。</li>
	<li>用透气膜覆盖96孔板。</li>
	<li>监测生长（OD600在酶标仪中检测。</li>
	<li>使用多种标准方法（例如计算最大斜率）来量化生长速率。 
	注：我们已成功使用开源软件包 grofit14，该程序在 R 编程环境中运行. 值得一提的是，从96孔板测定法计算出的生长速率与摇瓶法（25 ml）相比&#160;培养物）的生长情况不一定相同（由于生理差异和仪器差异所致），但我们观察到相对生长速率相似（尽管情况并非总是如此）。</li>
</ol>
5. 创建可诱导的基因组等位基因
<ol>
	<li>获取pMN10，一种非着丝粒质粒，其含有来自pMN8的ATF响应型启动子，并与KanMX融合（方向相反）。</li>
	<li>用限制性内切酶消化载体骨架，并按照第2节所述进行凝胶回收。</li>
	<li>退火、磷酸化并连接含有适当结合位点的寡核苷酸，操作步骤如第2节所述。</li>
	<li>进行测序验证。该质粒将作为构建可诱导等位基因的DNA模板。</li>
	<li>获取表达相应目标ATF的酵母菌株。</li>
	<li>使用表6中的引物，通过PCR扩增KanMX-启动子盒（约2 kb）。</li>
	<li>采用乙酸锂法将PCR产物转化至表达ATF的菌株中。</li>
	<li>在YPD平板上涂布，次日复制至YPD+G418平板上。</li>
	<li>使用正向引物（5'-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3'）和一个位于启动子已被替换基因内部的反向引物，确认启动子的正确插入。反向引物通常设计在起始ATG下游200–300 bp范围内15。最终PCR产物大小约为1.2 kb。</li>
</ol>

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</ol>

McIsaac、Noyes 和 Botstein（及其他研究人员）已将该系统的一部分提交为专利披露。

此处描述的基于激素的开关具有多种应用，从研究天然细胞生物学，到测试感兴趣的 DNA 结合域在体内靶向特定 DNA 序列的能力。in vivo。该系统具备诸多理想特性，包括对诱导剂呈梯度响应、作用迅速以及严密的调控（即&#160;无明显泄漏表达，参见图 7）。然而，该系统仍有改进和拓展的空间。
合成生物学领域的近期研究强调了合成系统的多重化以及扩展经过充分表征且可编程的DNA元件库16。实现不同靶基因的独立且条件性表达，需要多种诱导剂以及不具有重叠特异性的DNA结合结构域。工程化改造及天然存在的受体为开发新型人工转录因子提供了大量可用元件。&#160;定向进化方法极大地推动了相互正交开关元件库的扩展17,18。我们对人工转录因子配体结合特异性的重新编程工作将在未来另行报道。
此前，基因敲除或过表达的表型效应已在酵母中得到广泛研究19,20。然而，要在一系列表达水平下研究基因表达对不同表型的影响仍存在困难。本文所介绍系统的首要特征是其具有梯度调控的特性（图8）。尽管通常假定基因表达与目标表型之间存在单调关系，但实际情况未必如此。诸如Z3EV和Z4EV之类的人工转录因子将使检测基因表达变化所引发的表型响应变得简便直接。
最后，本文讨论的实验方案旨在设计和表征响应β-雌二醇的人工转录因子；然而，相较于化学响应结构域，一个重要的替代方案是使用光响应结构域（如PhyB/Pif3、LOV和BLUF），其活性可在无需干扰培养基生长条件的情况下实现可逆调控21-23。基于光的系统能够实现对基因表达、蛋白质-蛋白质相互作用、离子转运以及酶活性的时空精确控制，已被证明具有强大应用潜力21-26。
综上所述，我们介绍了在酵母中快速构建可诱导型人工转录因子的方法。本实验方案提供了构建这类人工转录因子及其配对的GFP报告系统的模板，并介绍了利用流式细胞术分析报告基因数据，以及检测人工转录因子激活对细胞生长影响的方法。

在酵母中开发基因开关在学术界和工业界研究中均具有重要意义。理想情况下，基因开关可用于仅在实验人员需要时激活特定基因（或一组基因）。将基因的编码序列置于合成启动子下游后，在缺乏诱导分子时该基因不会表达；而加入诱导剂后，基因应迅速表达。直到最近才证明，可在酵母中构建此类开关：在无诱导剂时，菌株表现出缺失表型；而在有诱导剂时，所有细胞中的基因表达水平随诱导剂浓度成比例激活1,2。历史上，酵母中的条件性表达系统主要依赖于营养响应型DNA序列，包括&#160;的&#160;MET, PHO 和 GAL 启动子（其活性分别对胞外甲硫氨酸、磷酸盐和半乳糖的水平敏感）。尽管可实现条件性表达，但其代价是产生显著的多效性影响。
激素受体（如人雌激素受体）已被证实可在真核生物中发挥有效的分子开关作用3,4在无激素存在的情况下，与激素受体融合的蛋白质可被滞留在细胞质中，并与Hsp90分子伴侣复合物相互作用。当受体结合相应的配体后，会发生构象改变，从而脱离Hsp90分子伴侣复合物，并暴露出核定位信号。为了观察特定含有激素受体的蛋白质的定位动态，我们构建了Gal4dbd.ER.VP16（GEV，一种包含Gal4p DNA结合域、人雌激素受体配体结合域和VP16的合成转录因子）与GFP的C端融合蛋白2核定位在加入饱和浓度的诱导剂β-estradiol后8分钟内即可观察到，而野生型酵母对该诱导剂完全无反应。此时，大多数细胞中GEV靶基因的活跃转录位点已清晰可见（通过荧光检测） 原位 杂交）以及完全成熟的mRNA2,5GEV靶基因表达上调 &#62;2.5 分钟内翻倍2,6 （使用微阵列测定），表明其所需时间 &#60;2.5 分钟&#160;嵌合激活因子需转位至细胞核，结合DNA并激活转录。
尽管已有多种其他开启型开关在酵母中得到应用，这些开关利用不同的小分子或药物（包括源自大肠杆菌（Escherichia coli）的经典多西环素调控系统7,8以及源自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的靛蓝类开关9），但它们均未能达到基于激素的开关所表现出的响应速度、特异性或严密的调控能力。值得指出的是，快速关闭型开关也已在酵母中被开发出来，通常通过将目标基因与蛋白酶或泛素连接酶的靶向序列融合来实现2,10,11,12。能够快速清除细胞中的目标蛋白，有助于对必需基因以及在缺失时易发生遗传补偿的基因进行研究10。
本方案中所述方法用于在酵母中构建和表征合成型开启开关。首先，我们展示了如何快速生成基因组整合的融合蛋白，该融合蛋白包含目标DNA结合域、人雌激素受体的配体结合域以及VP16（DBD-EV）。根据本方案，该融合蛋白由ACT1启动子驱动表达。接着，我们展示了如何为ATF构建相应的报告质粒，并通过流式细胞术检测其功能活性。尽管我们设想这些报告质粒将与新的ATF联用（图1），但它们也可作为天然转录激活因子的报告工具。最后，提供了在96孔板中检测ATF激活对细胞生长影响的详细步骤，以及可诱导基因组等位基因的构建方法。

<table><tbody><tr><td>试剂名称</td><td>公司</td><td>货号</td><td>备注&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR System</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>感受态&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Life Technologies</td><td>18258-012</td><td></td></tr><tr><td>雌二醇</td><td>Tocris Biosciences</td><td>2824</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>T4多核苷酸激酶</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-23</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>clonNAT</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB-102L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>D15-500</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BD Biosciences</td><td>210929</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>100%乙醇</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-031</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>二水合乙酸锂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6883</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>质粒pMN8和pMN10；酵母菌株yMN15</td><td>Noyes或Botstein实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3397</td><td></td></tr><tr><td>仪器：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSRII流式细胞仪&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>多种型号</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB或FlowJo</td><td>MATLAB或FlowJo</td><td></td><td>用于分析流式细胞术实验产生的.FCS文件</td></tr><tr><td>R</td><td>开源软件</td><td></td><td>用于分析酶标仪获得的生长速率数据&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon管</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml Eppendorf&amp;nbsp;离心管</td><td>GeneMate</td><td>C3262-1</td><td></td></tr><tr><td>250 ml摇瓶</td><td>Corning</td><td>4446-250</td><td></td></tr><tr><td>96孔平底板</td><td>Costar</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪（Synergy H1多功能酶标仪）</td><td>BioTek</td><td>H1MG</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy密封膜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>多家公司</td><td>多种型号</td><td></td></tr><tr><td>SC-Ura粉末</td><td>MP Biomedicals</td><td>114410622</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>Zymo Research</td><td>F9001-1</td><td></td></tr></tbody></table>

基于gfp报告系统的化学激活型转录因子的快速合成与筛选

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

合成生物学旨在合理设计并构建具有理想定量特性的合成基因线路，同时提供用于解析天然调控线路结构的工具。在这两种情况下，能够以快速、可调节且无脱靶效应的方式编程基因表达将非常有用。我们构建了酵母菌株，其含有位于URA3表达盒上游的ACT1启动子，其后接人类雌激素受体的配体结合域及VP16。通过向该菌株转化包含DNA结合域的线性PCR产物，并对URA3的存在进行负向筛选，可经同源重组生成持续表达的人工转录因子（ATF）。以此方式构建的人工转录因子可在诱导剂存在时激活唯一的靶基因，从而避免了常用条件性基因表达系统中存在的脱靶激活及非生理性的生长条件。本文还提供了一种简便方法，用于快速构建响应特定天然或人工转录因子的GFP报告质粒。

图5展示了Z3EV、Z4EV或GEV随时间推移对GFP的诱导作用。请注意，含有非酵母DNA结合域的ATF导致GFP产量增加。我们近期推测，这是由于这些因子在酵母基因组中实现了单基因特异性1。单独使用GEV诱导会激活或抑制数百个基因的表达，而Z3EV和Z4EV仅激活位于含相应结合位点（分别为5'-GCGTGGGCG-3'和5'-GCGGCGGAGGAG-3'）的合成启动子下游的目标基因表达1。图7展示了该系统的严密调控特性（无诱导剂时无GFP可检测）以及所有细胞均能响应诱导剂而被诱导。Z3EV在不同浓度β-雌二醇下诱导GFP表达的能力如图8所示。
<img alt="激素信号通路示意图；转录因子结合、报告质粒激活、GFP表达。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 在缺乏β-雌二醇的情况下，人工转录因子与Hsp90相互作用。 当β-雌二醇与ATF结合后，Hsp90解离，从而使ATF进入细胞核并激活质粒报告基因的表达。
<img alt="人工转录因子流程；PCR、质粒构建、流式细胞术；生物学示意图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 构建含人工转录因子的菌株及构建/测试相应 GFP 报告系统的实验流程示意图。
<img alt="DNA重组过程示意图；基因编辑的序列比对和PCR引物同源性。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 菌株yMN15在LEU2位点的ACT1pr-URA3-EV序列。
<img alt="用于PCR扩增DNA结合域的引物、序列细节、扩增方法。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 设计用于扩增目标DNA结合域的PCR引物，其附加序列具有同源性，以便在成功转化至yMN15后生成新的融合蛋白。
<img alt="GFP表达量图表；三种条件（Z4EV、GEV、Z3EV）下时间与强度的关系；实验结果。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 三种不同的ATF-启动子组合在1 µM β-雌二醇刺激下诱导GFP表达。
<img alt="用于GFP荧光直方图分析的MATLAB脚本；FCS数据处理与图谱生成。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6. 用于处理流式细胞术数据的MATLAB脚本。该脚本改编自<a href="http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data">http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data</a>。
<img alt="Fluorescence intensity analysis graph for GFP expression with varied estradiol concentrations." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 7"> 
图7. Z诱导GFP表达3EV 对 0 的响应 µM β-雌二醇和 1 µM β-雌二醇，诱导18小时后。 从缺乏GFP的细胞中也测量了荧光，以说明Z的严格调控3EV 系统。该图使用代码生成 图6.
<img alt="Fluorescence response: log scale graph (A), dose-response curve analysis (B), β-estradiol fit." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 8"> 
图8. 诱导剂浓度与表达输出之间的关系呈梯度变化，其希尔系数约为1。 (A) 绿色荧光蛋白表达分布随β-雌二醇浓度的变化。B) 来自（分布的平均荧光强度A). 数据拟合至函数 G(D) = G分钟 + (G最大−G分钟)Dn/(Kn+Dn其中 D 为 β-雌二醇剂量，G分钟 和 G最大值 分别为 GFP 的最小值和最大值，n 是 Hill 系数，K 是产生 ½ (G最大值 + G分钟).
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="176">
	<tbody>
		<tr>
			<td>寡核苷酸序列</td>
			<td>名称</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’-TTGAAACCA 
			AACTCGCCTCT-3’</td>
			<td>DBD 检测正向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’-tccagagac 
			ttcagggtgct-3’</td>
			<td>DBD 检测反向引物</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 用于验证目标DBD与雌激素受体正确融合的引物。 上游引物与 ACT1 启动子同源，下游引物与雌激素受体同源。对于典型的 DNA 结合域（约 300 bp），PCR 产物为 &lt;1.5 kb

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176">
	<tbody>
		<tr>
			<td>寡核苷酸序列</td>
			<td>名称</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5'-ggccgc…DBD 结合位点… t-3'</td>
			<td>上游引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’-ctaga…DNA 结合位点反向…gc-3’  </td>
			<td>下游引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5'-gccgcGTGGGCGTGCGTGGGCGGG 
			CGTGGGCGTGCGTGGGCGGGCGTG 
			GGCGTGCGTGGGCGt-3'</td>
			<td>上游寡核苷酸 + 6个Zif268结合位点</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC 
			CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC 
			CACGCACGCCCACgc-3’ </td>
			<td>下游寡核苷酸 + 6x Zif268 结合位点</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

表2. S含目的结合位点的双链DNA引物结构。 为了构建Z3EV响应性启动子使用了寡核苷酸Top oligo + 6x Zif268 Binding Sites和Bottom oligo + 6x Zif268 Binding。用于生成正确DNA突出端的序列以小写字母表示。Zif268共识结合位点GCGTGGGCG在上游寡核苷酸中加下划线。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>用量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Buffer</td>
			<td>5 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase (@10,000 units/ml)</td>
			<td>1 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>上游引物 (100 µM)</td>
			<td>1.5 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>下游引物 (100 µM)</td>
			<td>1.5 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>41 µl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

表3. 使用上述描述的50 µl 反应体系，在PCR仪中对引物进行磷酸化和退火。 共有两个PCR仪程序步骤：步骤1：37 °C 反应30分钟（磷酸化）；步骤2：95 °C 变性30秒（每30秒降低1 °C，直至降至4 °C；退火）。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>用量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>1 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>1 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>质粒 DNA</td>
			<td>5 µl (1-2 µg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Cut Smart Buffer</td>
			<td>5 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>38 µl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

表4. 质粒pMN8用XbaI和NotI进行限制性酶切。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176">
	<tbody>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl65" height="22" style="height:16.5pt;width:66pt" width="88">试剂</td>
			<td class="xl66" style="width:66pt" width="88">用量</td>
		</tr>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td>T4 Ligase Buffer</td>
			<td>2 µl</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td>T4 Ligase</td>
			<td>0.2 µl</td>
		</tr>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td>Backbone @ 10 ng/µl</td>
			<td>1 µl</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td>Binding Sequences@ 5x molar concentration/µl</td>
			<td>1 µl</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td>Water</td>
			<td>15.8 µl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

表5. 将结合位点连接至质粒DNA。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物</td>
			<td>描述</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATG 上游约 40 bp + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3’</td>
			<td>扩增 KanMX-启动子的正向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’- ATG + 约 37 bp 的反向互补序列 + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3’</td>
			<td>扩增 KanMX-启动子的反向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’-caatttgtctgctcaagaaaataaa 
			ttaaatacaaataaaCGCAC 
			TTAACTTCGCATCTG-3’</td>
			<td>用于构建 GCN4 启动子替换的正向引物。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’-tggatttaaagcaaataaacttgg 
			ctgatattcggacatTATAGTT 
			TTTTCTCCTTGACG-3’</td>
			<td>用于构建 GCN4 启动子替换的反向引物。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

表6. PCR扩增KanMX-启动子以构建可诱导等位基因。

本实验方案描述了一种快速构建人工转录因子（ATFs）及其相应GFP报告系统的实验方法&#160;并通过流式细胞术定量分析ATF刺激GFP表达的能力。

基于GFP报告系统的化学激活型转录因子的快速合成与筛选

合成生物学旨在合理设计并构建具有理想定量特性的合成回路，同时提供用于探究……的工具

本实验的总体目标是构建、测试并验证具有预期特异性的可诱导型遗传编码人工转录因子（ATF）。首先通过简单的酵母转化构建ATF，将一个DNA结合域的PCR产物插入载体，使其与人雌激素受体和VP16发生同框融合。实验的第二步是为该ATF构建GFP报告质粒，即将质粒PMN8中的结合位点替换为该转录因子的靶向序列。该实验流程的第三步是检测转录因子激活GFP报告基因的能力，同时通过测定酵母生长速率来评估其对酵母生理状态的影响。流程的最后一步是利用已验证的转录因子，对基因组内的天然靶基因进行条件性表达。最终，任何感兴趣的靶基因均可被设计为条件性激活状态。与现有的半乳糖介导基因表达诱导等方法相比，该技术的主要优势在于可在多种营养和生理条件下实现选择性诱导，且不会产生多效性效应。该方法通过快速且可逆地引入目标基因产物，有助于解答酵母生物学中的关键问题，从而实现对基因功能获得和功能缺失的双重研究。首先，使用高保真聚合酶通过PCR扩增目标DNA结合结构域（DVD）。使用乙酸锂方法将超过一微克的纯化PCR产物转化至酵母中。转化后，在微量离心机中以最高速度离心细胞15秒，弃去转化混合液，将细胞重悬于约200微升无菌水中，随后涂布于酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基平板上。次日，将YPD平板上的菌落影印转移至五组氟乳清酸（5-FOA）平板上。培养两到四天后，将至少五个到十个菌落重新划线至YPD培养基上。然后使用文本方案中所述的引物进行菌落PCR，并通过测序验证插入情况。将目标结合区域的寡核苷酸稀释至等摩尔浓度。使用T4多核苷酸激酶磷酸化结合区域，然后根据文本方案中的反应条件，使用新式热循环仪进行反应。接下来，在37摄氏度下，用NotI HF和XbaI酶解约1至2微克的PMN8，反应1小时，随后进行凝胶电泳。纯化载体片段，并将纯化后的载体稀释至10纳克/微升。随后将双链磷酸化结合位点稀释至摩尔浓度为载体的5倍（每微升）。使用T4 DNA连接酶在室温下将结合位点连接入已消化的载体中，反应30分钟。将连接反应产物的一半加入到50微升标准化学感受态EIA大肠杆菌细胞中，按照文本方案中列出的步骤进行转化。细胞复苏后，将100至200微升细胞涂布于每块LB（Luria-Bertani）或含氨苄青霉素的LB平板，过夜培养。次日，在含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养大肠杆菌，然后按照文本方案所述方法提取质粒DNA。然后从连接反应的菌落中测序验证新的报告质粒。最后，使用乙酸锂转化法将新的报告质粒转入含有A TF的E菌株中。首先，在5毫升缺乏尿嘧啶的合成完全培养基中，过夜培养含有转录因子及报告质粒的菌株。取9个250毫升的摇瓶，每瓶加入25毫升SC缺URA培养基。然后根据文本方案中列出的浓度，用25毫摩尔β-雌二醇储备液进行10倍系列稀释，制备七种不同稀释度的β-雌二醇，并将125微升过夜培养物接种至这七个摇瓶中。对于剩余的两个摇瓶，分别接种组成型表达GFP的菌株和不表达GFP的菌株。这两个样品用于流式细胞仪的校准。将锥形瓶在 200 RPM、30 摄氏度条件下振荡培养 12 至 18 小时。然后取每种培养物 500 微升，分别在 1.7 毫升离心管中离心沉淀。吸除上清液后，用流式细胞术缓冲液洗涤细胞沉淀一次，再将细胞重悬于 1 毫升相同缓冲液中。接下来，向9个Falcon管中各加入1毫升流式细胞术缓冲液。将重悬的细胞加入含有缓冲液的Falcon管中，使最终体积达到2毫升。最后，进行流式细胞术分析。使用前向散射和侧向散射来鉴定酵母细胞。将流速设置为每秒约3000个细胞。通过50通道检测GFP，并按照文本方案操作：从冻存菌种中将含有ATF的菌株和缺乏ATF的菌株分别划线接种到YPD培养基上。经过两天生长后，分别接种含有5毫升YPD液体培养基的培养管，并在30°C下过夜培养各菌株。将0.25毫摩尔的β-雌二醇储备液用100%乙醇进行10倍系列稀释，最高稀释至10,000倍。将每种过夜培养物各40微升加入10毫升YPD液体培养基中。对于每种菌株，将96微升稀释后的菌液加入96孔板的18个孔中。然后向细胞中加入 4 µL 的 β-雌二醇。关键要点是确保每个孔中的总乙醇量相同。每种菌株设置三个孔进行三复孔实验，其中三个孔仅加入乙醇作为对照。使用透气膜覆盖96孔板的对照组。在酶标仪中以600纳米的光密度监测生长情况。可采用多种方法对生长速率进行定量，例如计算最大斜率。按照文本方案中的指示制备质粒后，通过PCR扩增canMX启动子盒。利用乙酸锂法将PCR产物转化至表达A TF的菌株中，将转化后的细胞涂布于YPD培养基上，并于次日在YPD加G418抗生素培养基上进行影印培养。最后，使用上游引物及一段位于已被替换启动子基因内部的下游引物，验证启动子的正确插入。最终的PCR产物大小约为1.2 KB。此处显示的是在1微摩尔β-雌二醇处理下，三种不同的人工转录因子（aTF）启动子组合Z4 EVZ3 EV或GEV随时间诱导GFP表达的情况。注意，含有非酵母DNA结合域的人工转录因子（ATFs）导致GFP产量增加。这可能是因为这些因子在酵母基因组中实现了对单个基因的特异性调控。单独的GEV诱导可导致数百个基因的激活或抑制，而Z三EV和Z四EV仅能激活位于含适当结合位点的合成启动子下游的目标基因表达。此处显示了在0纳摩尔β-雌二醇和18小时诱导后1微摩尔β-雌二醇条件下，Z三EV对GFP的诱导作用。还测量了不含GFP的细胞的荧光，以说明Z三EV系统的严密调控性。此处展示了Z三EV在一系列β-雌二醇浓度下诱导GFP表达的能力。分布的平均荧光强度显示，诱导剂浓度与表达输出之间的关系呈梯度变化，其希尔系数约为1，表明Z三元EV的结合是独立的。通过此方法，还可进行其他实验，例如基因表达微阵列，以回答更多问题，比如单个基因表达水平的改变如何影响全基因组范围内的基因表达模式。观看本视频后，您应能够充分理解如何设计、测试并验证人工转录因子的有效性。这些人工转录因子可条件性地调控位于适当DNA靶序列下游的基因表达。

rapid-synthesis-screening-chemically-activated-transcription-factors

Research

科研

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Biology

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增强型酵母单杂交筛选技术用于鉴定结合人类DNA序列的转录因子

为了鉴定转录因子的新调控因子，我们开发了一种方法，利用基于双荧光素酶的转录报告基因检测技术，对排列式慢病毒或逆转录病毒RNAi文库进行筛选。该方法能够在单次实验中快速且相对低成本地筛选数百个候选基因。...

利用阵列文库中通量筛选和双荧光素酶报告系统鉴定转录因子调控因子

本研究描述了一种用于384孔板的高通量细胞内钙荧光检测方法，可用于在重组G蛋白偶联受体（GPCRs）上筛选小分子文库。该检测以牛蜱Rhipicephalus...

一种用于高通量筛选重组G蛋白偶联受体的“双加样”钙荧光检测法

本研究描述了一种利用3D打印LED阵列进行高通量实验的方法，用于优化HEK293T细胞中光诱导基因表达。...

快速优化光诱导系统以调控哺乳动物基因表达

在本视频中，我们介绍了通过CD40配体和白细胞介素-4刺激，从外周血单个核细胞（PBMC）中ex...

人源CD40活化B细胞的制备

学习在酵母中构建人工转录因子并评估其诱导GFP表达的能力。该方法通过酵母转化、报告质粒构建和流式细胞术分析，实现对基因功能的快速可逆调控。

基于GFP报告系统的化学激活型转录因子的快速合成与筛选

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