快速合成及其与绿色荧光蛋白为基础的记者化学激活的转录因子筛选

该程序的总体目标是创建、测试和验证具有所需特异性的基因编码、可诱导的人工转录因子或 ATF。这是通过首先通过简单的酵母转化产生 A TF 来实现的，其中包含 A DNA 结合域 PCR 产物会导致与人雌激素受体和 VP 16 的框内融合。该程序的第二步是通过用 TF 靶向序列替换质粒 PMN 8 中的结合位点，为 A TF 创建用于 A TF 的 GFP 报告质粒。

该程序的第三步是测定 ATF 激活 GFP 报告基因的能力，并通过测量生长速率来评估其对酵母生理学的影响。该程序的最后一步是使用经过验证的 TF 有条件地表达天然基因组靶标。最终，任何感兴趣的靶基因都可以被条件性地激活。

与半乳糖介导的基因表达诱导等现有方法相比，该技术的主要优点是可以在不同的营养和生理条件下实现选择性诱导，而不会产生多效性效应。该方法可以通过快速和可逆地引入所需的基因产物来帮助回答酵母生物学中的关键问题，从而能够研究功能的获得和丧失。首先，使用高保真聚合酶 PCR 扩增目标 DNA 结合结构域或 DVD。

使用乙酸锂方法将大于 1 μg 的纯化 PCR 产物转化到酵母中。转化后，在微量离心机中以最高速度旋转细胞 15 秒，去除转化混合物，并将细胞重悬于约 200 μL 无菌水中，然后接种在酵母提取物上。第二天，将 Pepto 葡萄糖或 YPD 培养基从 YPD 复制板复制到五个氟性情酸板上。

生长 2 到 4 天后，将至少 5 到 10 个菌落重新移植到 YPD 上。然后使用文本方案和序列中的引物进行菌落 PCR，以验证包含。将所需的结合区寡核苷酸稀释至等摩尔浓度。

使用 T 四多核苷酸激酶磷酸化结合区，然后根据文本方案中的反应条件使用 neo 热循环仪。接下来，消化大约 1 到 2 微克 PMN 8，而不是一个 HF 和 xb。1 次在 37 摄氏度凝胶下放置 1 小时。

纯化主链条带并将纯化的主链稀释至 10 ng/μL。然后将双链磷酸化结合位点稀释至每微升主链摩尔浓度的五倍。使用 T 4 DNA 连接酶，在室温下将结合位点连接到消化的主链中 30 分钟。

将一半的连接反应物加入 50 μL 标准化学感受态 EIA 大肠杆菌细胞中，并按照文本方案中列出的程序进行转化。回收细胞后，每 luria berti 或 lb 加氨苄青霉素板添加 100 至 200 微升细胞，孵育过夜。第二天，培养大肠杆菌和 lb 加氨苄青霉素液体，并按照文本方案中的说明收获质粒 DNA。

然后对来自连接菌落的新报告质粒进行测序验证。最后，使用醋酸锂转化将新的报告质粒转化为含有 A TF 的 E 菌株。首先，在 5 毫升不含尿嘧啶的合成完全培养基中培养含有菌株过夜的 TF plus 报告基因。

获得 9 250 毫升，摇匀瓶，并向每个瓶中加入 25 毫升 SC 减去 URA。然后用文本方案中列出的不同稀释度的 β 雌二醇制备 7 个烧瓶，从 25 毫摩尔 β 雌二醇原液的 10 倍连续稀释和 125 微升过夜培养物到这七个烧瓶中，其余两个烧瓶接种组成型 GFP 产生菌株和缺乏 GFP 的菌株。这些是校准流式细胞仪所必需的。

以 200 RPM 和 30 摄氏度摇动培养瓶 12 至 18 小时。然后取出每种培养物 500 微升，并在单独的 1.7 毫升浓度管中离心。吸出上清液后，用流式细胞术缓冲液冲洗沉淀的细胞一次，然后将细胞重悬于 1 毫升相同缓冲液中。

接下来，将 1 毫升流式细胞术缓冲液添加到 9 falcon 2 中。将重悬的细胞添加到含有 falcon 管的缓冲液中，最终体积等于 2 mL。最后，进行流式细胞术。

使用前向散射和侧向散射来识别酵母细胞。将流速设置为每秒大约 3000 个单元格。通过 50 通道测量 GFP，并按照文本方案从冷冻原液中将含有 A TF 的菌株和缺乏 A TF 的菌株划线到 YPD 上生长两天后，接种含有 5 毫升 YPD 液体的单独培养管，并将每个菌株在 30 摄氏度下生长过夜。

将 0.25 毫摩尔 β 雌二醇储备液连续稀释 10 倍，直至 10， 000 倍，在 100% 乙醇中折叠。将 40 微升每种过夜培养物添加到 10 毫升 YPD 液体中。对于每种菌株，将 96 微升稀释的细胞添加到 96 孔板的 18 个孔中。

然后向细胞中加入 4 微升 β 雌二醇。一个关键的点是确保每个井中总乙醇的含量相同。一式三份，每个菌株的三个孔仅乙醇。

对照品将 96 孔板覆盖在透气膜中。在读板器中以 600 纳米的光密度监测生长。使用任意数量的方法量化增长率，例如求最大斜率。

按照文本方案 PCR 中的说明制备质粒后，扩增罐 MX 启动子盒。使用乙酸锂法板将 PCR 产物转化成表达 A TF 的菌株，第二天将转化细胞转化到 YPD 上，并将复制板转化到 YPD 加 G 4 18 抗生素上。最后，使用启动子已被替换的基因内部的正向引物和反向引物确认启动子的正确插入。

最终的 PCR 产物约为 1.2 KB，此处显示的是响应于一种微摩尔 β 雌二醇的三种不同的 TF 启动子对 Z、4 EVZ、3 EV 或 GEV 随时间诱导 GFP。注意响应于含有非酵母 DNA 结合域的 ATF 而增加的 GFP 产生。这可能是由于这些因素在酵母基因组中实现了单基因特异性。

单独的 GEV 诱导会导致数百个基因的激活或抑制，而 Z 3 EV 和 Z 4 EV 仅激活位于包含适当结合位点的合成启动子下游的靶基因的表达。在这里，Z 三个 EV 响应于零纳摩尔 β 雌二醇和 1 微摩尔 β 雌二醇诱导 GFP，诱导 18 小时后还测量了来自缺乏 GFP 的细胞的荧光，以说明 Z 三个 EV 系统的严格调节。Z three EV 在一系列 β 雌二醇浓度下诱导 GFP 的能力如图所示。

分布的平均荧光显示，诱导剂浓度和表达输出之间的关系以大约 1 的希尔系数进行分级，表明 Z 三个 EV 的独立结合。按照此程序，可以执行其他方法，如基因表达微阵列，以回答其他问题，例如改变单个基因的表达如何影响基因组葡萄酒基因表达模式。看完这个视频后，你应该对如何设计、测试和验证人工转录因子的功效有了很好的了解。这些人工转录因子有条件地控制位于适当 DNA 靶序列下游的基因的表达。