神经干/祖细胞在小鼠EAE的慢性全身性注射

该方案的总体目标是通过静脉注射将神经干祖细胞输送到 CNS，用于受实验性自身免疫性脑脊髓炎（一种模拟多发性硬化症的疾病模型）影响的小鼠。这是通过首先从成年小鼠的大脑脑室下区获得神经干祖细胞或 NPC 来实现的。第二步是用病毒载体技术对 NPC 进行基因标记，用于体内细胞鉴定和追踪。

接下来，将增殖的神经球解离成单细胞悬液，以所需的密度重悬，并在疾病高峰期注射到 EAE 小鼠的尾静脉中。最终，进行死后器官和组织病理学和免疫组化，以识别和表征注射干细胞的存活分布和整合。该技术的主要优点是它提供了一种微创、安全且有效的方法，可将干细胞和祖细胞移植到炎症神经系统中。

该方法有助于回答与神经系统炎症性疾病模型中全身注射干细胞的安全性和有效性相关的三个关键问题。这种方法的视觉演示对年轻科学家特别有用，因为它有助于理解从脑干细胞分离到准备在多发性硬化症小鼠模型中进行全身注射的关键实验步骤，第一步是将解剖所需的所有解决方案收集在一起。使用适当的无菌技术。

将新鲜分离的大脑放在大脑切片器矩阵上。使用两个剃须刀片产生冠状切片，距大脑前极 2 毫米，不包括视迹，在前一次切割后方 3 毫米。将脑切片放在干净的培养皿上，并在解剖显微镜下工作以分离脑室下组织。

将组织切碎后，将其添加到 30 毫升预先制备和过滤的消化溶液中。轻轻摇晃并孵育 30 分钟，每 15 分钟摇动一次。离心后，去除上清液，将沉淀重悬于 200 μL 的完全生长中。

培养基或 CGM 移液器。首先使用 P 1000，然后使用 P 200 移液器。达到单细胞悬液后，用 CGM 将其调至 5 mL，然后转移到新的培养瓶中。

将细胞放入培养箱中，让神经球形成 5 到 7 天。准备好后，将悬浮液收集到 15 毫升试管中并离心。去除上清液，将上颚重悬于 200 微升 CGM 中。

通过将神经球通过 P 200 移液器吸头 100 至 150 次，机械地分离神经球。用 CGM 将悬浮液调至 1 毫升。接下来，准确稀释悬浮液。

将适当体积与活体染色剂混合，并填充血细胞仪以确定细胞计数。以正确的浓度重悬细胞并转移到新的培养瓶中。每 4 到 5 天重复这些步骤，以帮助识别体内移植的细胞。

NPC 转导后 72 小时用编码报告基因的病毒载体转导 NPC。荧光报告基因的表达可通过免疫荧光或流式细胞术进行验证。准备好后，通过离心收获表达 GFP 的神经球并去除上清液。

接下来，加入 200 μL 细胞聚集体解离溶液并孵育 10 分钟。取回细胞并轻轻重悬以获得单细胞悬液。注意避免气泡。

计数和稀释细胞后，将细胞悬液放在冰上直至准备使用。一旦神经球准备好了，就可以检索以前准备用作 CNS 小鼠模型的小鼠。损伤治疗应在疾病表达高峰期进行。

首先将小鼠放入加热箱中约 10 分钟，让尾静脉扩张。准备好后，将一只鼠标从加热箱转移到鼠标限制器上。关闭限制器以限制移动并隔离尾部。

用适当的局部溶液对尾部的注射区域进行消毒。在 1 毫升胰岛素注射器中加入 150 微升细胞悬液，并确保去除所有气泡。将静脉定位在尾巴的背表面，并将针头平行于尾巴中下部的静脉放置。

这里的静脉更接近皮肤表面。从而促进了程序。轻轻地将针头插入静脉，抽取几微升血液，确保其位置正确。

然后将溶液缓慢注入尾静脉注射后，取出针头并施加压力几秒钟以减缓出血。将鼠标放入新的笼子中并进行监控，直到恢复。在预定的实验时间点对所有小鼠重复相同的程序。

从处理过的动物和对照动物中收集样品并进行分析，以确定 NPC 在增殖时浸润和整合到 CNS 和其他组织中，因为神经球 NPC 表达有丝分裂活性的标志物，如磷酸化组蛋白 H 3，以绿色显示，未分化神经细胞如巢，以红色显示，当在适当的分化条件下接种时， NPC 表达三个神经谱系的典型标志物，如星形胶质细胞标志物、GFAP、神经元标志物、微管相关蛋白 2 和寡二醇胶质细胞标志物 O 4 和髓鞘碱性蛋白核用 dpi 未分化 MPC 复染，移植后要有治疗效果，必须表达细胞表面粘附分子，包括 CD 44 和极晚期抗原 4 的 α 4 亚基。这些例子表明，转导的 NPC 表达 GFP，既作为增殖的神经球，也作为生长因子撤离时体外分化。在 EAE 小鼠中全身注射的同基因 NPC 几乎只存在于移植后 45 天内大脑和脊髓中箭头指示的 CNS 损伤的血管周围区域。

该程序的一个关键步骤是细胞解离。事实上，单细胞悬液的制备对于避免可能导致血管闭塞的夹子或聚集体至关重要。这项技术为再生医学的研究人员铺平了道路，他们正在探索将非周期性干细胞有效递送到小型实验动物的大脑中的微创方案，以及近距离观察受炎症性神经系统疾病影响的人类的大脑。

观看此视频后，希望您将清楚地了解与患有脑部疾病的实验动物分离、准备和全身注射组织特异性姿势相关的故障排除。