慢性EAE小鼠模型中神经干细胞/祖细胞的全身注射

本方案的总体目标是通过静脉注射，将神经干细胞前体细胞递送至患有实验性自身免疫性脑脊髓炎的小鼠中枢神经系统，该疾病模型可模拟多发性硬化症。首先从成年小鼠脑部的侧脑室下区分离获得神经干细胞前体细胞（NPCs）；第二步是利用病毒载体技术对NPCs进行遗传标记，以实现体内细胞的识别与追踪。

随后，将增殖的神经球解离为单细胞悬液，重悬至所需密度，并在EAE小鼠疾病高峰期经尾静脉注射。最终，通过尸检器官和组织病理学检查及免疫组织化学分析，鉴定并表征注射的干细胞的存活分布与整合情况。该技术的主要优势在于，它提供了一种微创、安全且有效的方法，可将干细胞和前体细胞移植到炎症的神经系统中。

该方法有助于回答三个关键问题，这些问题涉及系统性注射干细胞在神经系统炎症性疾病模型中的安全性和有效性。该方法的可视化演示尤其对年轻科研人员具有帮助，因为它有助于理解从脑干细胞分离到为多发性硬化小鼠模型进行系统性注射准备等关键实验步骤。第一步是准备好解剖所需的所有溶液，并采用正确的无菌技术。

将新鲜分离的脑组织置于脑切片矩阵上。使用两片剃须刀片进行冠状面切取，第一刀位于脑前极后方2毫米处，避开视束，第二刀位于前一刀后方3毫米处。将脑切片置于洁净的培养皿中，并在解剖显微镜下操作，分离室管膜下区组织。

将组织剪碎后，加入30毫升预先配制并过滤的消化液中。轻轻振荡，37℃孵育30分钟，每15分钟摇动一次。离心后，弃去上清液，将沉淀物重悬于200微升完全培养基中。

使用移液器将培养基或CGM轻轻吹打。先用P1000移液器，再用P200移液器进行操作。待形成单细胞悬液后，用CGM补至5 mL，并转移至新的培养瓶中。

将细胞放入培养箱中，孵育5至7天以形成神经球。准备就绪后，将悬浮液收集至15毫升离心管中并离心。弃去上清液，将沉淀物重悬于200微升CGM培养基中。

通过将神经球反复吹打100至150次，使用P200移液器枪头进行机械性解离。用CGM将悬液体积调至1毫升。随后，精确稀释该悬液。

将适当体积的细胞悬液与活体染料混合，填充血细胞计数板以确定细胞数量。将细胞重悬于正确浓度的溶液中，并转移至新的培养瓶。每四到五天重复这些步骤，以帮助识别体内移植的细胞。

在NPC转导72小时后，用编码报告基因的病毒载体对NPC进行转导。可通过免疫荧光或流式细胞术检测荧光报告基因的表达。当准备就绪时，通过离心收集表达GFP的神经球，并移除上清液。

接着，加入 200 µL 细胞聚集体解离液，孵育 10 分钟。收集细胞并轻轻重悬，以获得单细胞悬液，注意避免产生气泡。

计数并稀释细胞后，将细胞悬液置于冰上保存，直至准备使用。待神经球准备好后，取出此前已准备好的小鼠，作为中枢神经系统（CNS）的动物模型。损伤处理应在疾病表型最显著时进行。

首先将小鼠放入加温箱中约10分钟，以使尾静脉扩张。准备就绪后，将一只小鼠从加温箱转移至小鼠固定器中。关闭固定器以限制其活动，并暴露尾部。

使用适当的局部消毒液对尾部注射区域进行消毒。用1毫升胰岛素注射器吸取150微升细胞悬液，并确保排除所有气泡。定位尾部背侧的静脉，将针头与静脉平行，置于尾部中下段位置。

此处静脉更靠近皮肤表面，因此便于操作。轻轻将针头插入静脉，并通过回抽几微升血液来确认其位置正确。

然后缓慢将溶液注入尾静脉。注射后，拔出针头并按压数秒钟以减缓出血。将小鼠放入洁净的笼子中，并监测直至其恢复。在预定的实验时间点，对所有小鼠重复相同的操作步骤。

从经处理和对照组动物采集样本并进行分析，以确定神经前体细胞（NPCs）向中枢神经系统及其他组织的浸润与整合情况。当以神经球形式增殖时，NPCs表达有丝分裂活性标志物（如绿色显示的磷酸化组蛋白H3）以及未分化神经细胞标志物（如红色显示的巢蛋白）。在适当的分化条件下培养时，NPCs表达出三种神经谱系的典型标志物，例如星形胶质细胞标志物GFAP、神经元标志物微管相关蛋白2（MAP2），以及少突胶质细胞标志物O4和髓鞘碱性蛋白（MBP）。细胞核用DPI复染。为确保移植后具有治疗功效，未分化的MPCs必须表达包括CD44以及极迟抗原4（VLA-4）的α4亚单位在内的细胞表面黏附分子。这些示例显示，经转导的NPCs在增殖性神经球状态以及体外撤除生长因子后发生分化的过程中均表达绿色荧光蛋白（GFP）。在EAE小鼠中系统性注射的同源NPCs，在移植后长达45天内几乎仅分布于中枢神经系统损伤部位的血管周围区域，如箭头所示，该现象在脑和脊髓中均可观察到。

该操作的关键步骤是细胞解离。事实上，制备单细胞悬液至关重要，可避免形成可能在移植后导致血管阻塞的团块或细胞聚集体。该技术为再生医学领域的研究人员奠定了基础，使其能够探索将非周期性干细胞高效递送至小型实验动物脑内的微创方案，并有望进一步应用于患有炎症性神经系统疾病的人类患者。

观看本视频后，您将能够清晰理解与脑部疾病实验动物组织特异性细胞的分离、制备及系统性注射相关的各种问题排查方法。