Name: 一种改进沉淀法来隔离尿外来体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: 学习改进沉淀法从尿液中分离外泌体，该方法无需超速离心，操作简便快速，可获得高纯度外泌体用于Western blot和qPCR等下游分子分析，适用于慢性肾病生物标志物研究。

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我们感谢罗尼家族基金会对本研究的支持。我们谨此感谢 M. Lucrecia Alvarez 博士在本工作所述实验的规划与实施过程中所做出的贡献。

注意：使用改良沉淀法分离尿液外泌体的步骤如图1所示。初始步骤通过离心去除较大的死亡细胞和细胞碎片。从后续每一步收集的上清液中最终获得的沉淀物即为外泌体，将其溶解于分离溶液中，用于进一步提取蛋白质、RNA和DNA。
1. 尿液采集
<ol>
	<li>在收集尿液之前，根据制造商的说明配制蛋白酶抑制剂混合液，并将3.125 ml该混合液加入一个空的无菌容器中。然后可将含有蛋白酶抑制剂混合液的试管分发给志愿者用于尿液收集。 
	注意：添加蛋白酶抑制剂的目的是尽量减少尿液样本中蛋白质的降解。尽管我们特别使用了Sigma公司的蛋白酶抑制剂混合液，但也可替换为其他市售的蛋白酶抑制剂。</li>
	<li>收集约10 ml的首次排尿尿液。收集后应立即处理尿液，不得储存或冷藏。采用改良的沉淀法平行分离尿液外泌体；其中一份用于DNA、总RNA和蛋白质的提取，另一份用于尿液外泌体颗粒的定量。 
	注意：可通过在4 °C下储存来收集24小时尿液样本用于外泌体分离。</li>
</ol>
2. 去除细胞碎片和Tamm-Horsfall蛋白（THP）
<ol>
	<li>将尿液样本转移至15 ml离心管中。取10 ml尿液在37 °C下以17,000 × g离心10分钟，以去除细胞及细胞碎片（图1）。</li>
	<li>使用移液器将上清液转移至新管中用于后续处理。将沉淀重悬于500 µl裂解液（250 mM蔗糖，10 mM三乙醇胺，pH 7.6）中，随后加入DL-二硫苏糖醇（DTT：终浓度200 mg/ml），在37 °C孵育10分钟。 
	注意：添加DTT可降解 trapping exosomes 的Tamm-Horsfall蛋白（THP），从而提高外泌体得率。转移上清液时应小心避免扰动沉淀，并确认上清液中无沉淀残留。</li>
	<li>每2分钟涡旋震荡沉淀样品一次，直至沉淀完全溶解。然后向溶解的沉淀中加入500 µl裂解液。</li>
	<li>在向沉淀中加入裂解液后，立即在37 °C下以17,000 × g离心10分钟。用移液器吸取上清液，并与先前收集的上清液合并。</li>
	<li>将沉淀用50 µl裂解液重悬，用于SDS-PAGE分析。 
	注意：重悬沉淀时可使用PBS或TBS替代裂解液。</li>
</ol>
3. 外泌体沉淀的分离
<ol>
	<li>向收集的11 ml上清液中加入3.3 ml ExoQuick-TC试剂，在4 °C孵育至少12小时。 
	注意：上清液体积与ExoQuick-TC试剂的体积比例可调整，以增加或减少外泌体产量。我们观察到，加入的试剂体积越小，外泌体的产量越低。</li>
	<li>孵育完成后，在25 °C下以10,000 × g离心30分钟，处理样品与ExoQuick-TC的混合物。</li>
	<li>将上清液转移至新管中，用于SDS-PAGE分析。</li>
	<li>外泌体沉淀物可储存于-80 °C，用于DNA、RNA和蛋白质的提取，以及通过CD9 ELISA对外泌体颗粒进行定量11。 
	注意：外泌体沉淀物在-80 °C可保存1年，应尽量减少冻融次数。</li>
</ol>
4. 外泌体沉淀物的生物标志物检测与分析
<ol>
	<li>对于后续分析，根据制造商说明书，使用DNA/RNA/蛋白质分离试剂盒和RNA分离试剂盒从外泌体沉淀中提取DNA、RNA和蛋白质。取2 µl样品，利用Nanodrop分光光度计在260 nm和280 nm处测定吸光度，以确定浓度。</li>
	<li>使用TaqMan microRNA检测试剂盒（在本研究中，我们使用了针对人miR-192和miR-1207-5p的特异性检测试剂盒）或miRNA特异性引物进行定量实时RT-PCR（qPCR）。</li>
	<li>进行SDS-PAGE分析时，使用4-12% Bis-Tris凝胶，通过一维电泳分离蛋白质样品。根据制造商说明书，使用银染试剂盒对凝胶进行显色观察。</li>
	<li>根据制造商提供的说明，使用PVDF膜进行Western印迹分析。在Western印迹检测中，使用兔多克隆抗体针对凋亡相关基因-2相互作用蛋白X（ALIX）以及小鼠单克隆抗体针对肿瘤易感基因101蛋白（TSG101）。使用开放获取的NIH ImageJ软件（http://rsbweb.nih.gov/ij/）或类似程序对条带密度进行定量分析。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用CD9 ELISA试剂盒对获得的尿液外泌体颗粒数量进行定量。</li>
</ol>

<ol><li>Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acids+within+urinary+exosomes%2Fmicrovesicles+are+potential+biomarkers+for+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease.</a> Kidney Int. 78, 191-199 (2010).</li>
<li>Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).</li>
<li>Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+quantitative+proteomics+strategy+for+protein+biomarker+studies+in+urinary+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes.</a> Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).</li>
<li>Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+systems+biology+principles+to+protein+biomarker+discovery%3A+urinary+exosomal+proteome+in+renal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation.</a> Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).</li>
<li>Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+exosomes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of exosomes in urine.</a> Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).</li>
<li>Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+storage%2C+preservation%2C+and+normalization+of+human+urinary+exosomes+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery.</a> Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Prot+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).</li>
<li>Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).</li>
<li>Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+proteomics+and+phosphoproteomics+of+urinary+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes.</a> J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).</li>
<li>Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methods+for+isolation+of+urinary+microvesicles+to+identify+biomarkers+of+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.</a> Kidney Int. 78, 810-816 (2010).</li>
<li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein%2C+microRNA%2C+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int.+Nov%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li>
<li>Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+association+of+-667+aquaporin-2+%28AQP-2%29+A%2FG+promoter+polymorphism+with+the+incidence+and+clinical+course+of+chronic+kidney+disease+in+Korea%5BTitle%5D)+AND+%22Renal+Fail%22%5BJournal%5D)">Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea.</a> Renal Fail. 29, 693-698 (2007).</li>
</ol>

本文的出版费用由 SBI Biosciences 支付。

大多数从尿液中沉淀外泌体的方法均未解决Tamm-Horsfall蛋白（THP）形成的聚合物网络的去除问题。该蛋白在尿液中含量较高，可能在初始低速离心过程中捕获外泌体。在我们改进的方法中，于外泌体沉淀前使用DTT降低THP含量。如图所示 图2在未处理的尿液和沉淀物中观察到较高含量的THP，而最终上清液和外泌体沉淀物中均未检测到THP，表明该蛋白已被去除。对沉淀物中的蛋白进行定量显示，产量高出六倍；通过CD9 ELISA对沉淀物进行定量分析，结果显示每毫升尿液中外泌体的产量比未经改良的沉淀法高出五倍（结果未显示）。11）。生物标志物Alix6 和 TSG1018 在外泌体沉淀中检测到了这些蛋白质；使用未修饰的沉淀方法时，我们仅能通过浓缩样品检测到这些蛋白质。我们还观察到miRNA的最高水平（即，miR-192 和 miR-1207-5p）以及 mRNA 表达（即TSG101、PDCD6IP 和 AQP212采用改良沉淀法11该改良沉淀方法的优缺点如图所示。 <st...

尿液外泌体是多泡体（MVB）来源的直径约100 nm的小型内体囊泡，在正常和病理条件下，尿液空间中所有细胞类型（包括肾小球足细胞、肾小管上皮细胞以及尿路引流系统内衬细胞）均可释放此类外泌体，且其富含miRNA1-2。许多研究人员已在健康个体以及患有肾脏和/或系统性疾病个体的尿液外泌体中检测到不同的蛋白质3-5。外泌体可通过多种方法分离，例如两步差速超速离心法（使用或不使用蔗糖）6-7、纳米膜过滤联合超速离心法8-9，或沉淀法10-11。我们近期开发了一种简单、快速、可扩展且高效的尿液外泌体分离方法，并可用于检测miRNA和蛋白质生物标志物11。尽管生物标志物可在多种不同的生物液体中检测到，但对于肾脏及泌尿道疾病患者而言，尿液是最为便捷的样本来源，因其可相对无创地大量获取。
尽管已有多种方法可用于分离尿液外泌体6-11，但最常用的方法依赖于在30%蔗糖垫上的差速超速离心法。虽然该方法效率较高，且所获得的外泌体质量良好，但该技术本身需要熟练的操作人员，且耗时较长，需进行多次超速离心步骤。其他方法，如过滤法和沉淀法，也已被开发用于外泌体的分离，其中包括一种使用专有沉淀试剂的方法（即，ExoQuick-TC：System Biosciences；Mountain View, CA）。尽管使用该试剂进行沉淀操作快速且相对简便，但与超速离心法相比，所分离外泌体的纯度较低。我们近期比较了六种尿液外泌体分离方法，其中包括我们实验室开发的一种对ExoQuick-TC沉淀法的改良方法11。我们发现，这种改良的沉淀法所获得的蛋白质、miRNA和mRNA含量更高，且操作过程比超速离心法更快、更易于实施。本文以逐步方式详细描述了我们改良后的沉淀法实验方案，并讨论了该技术与其他外泌体分离方法相比的优缺点。该改良沉淀法包括首先对外泌体颗粒进行初步沉淀，随后去除Tamm-Horsfall蛋白——该蛋白与外泌体蛋白相关，已知会降低尿液中外泌体的得率。我们发现，这些改良措施显著提高了尿液外泌体提取物的得率和纯度。

<table><tbody><tr><td>Corning 15 ml 离心管</td><td>Corning (Sigma Aldrich)</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Sorvall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9779</td><td>使用终浓度为 200 mg/ml</td></tr><tr><td>Novex NuPAGE SDS-PAGE 系统（4-12% Bis-Tris 凝胶，1.0 mm，10 孔）</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td>用于 SDS-PAGE 分析</td></tr><tr><td>ECL Advance 蛋白印迹检测试剂盒</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2135</td><td>用于生物标志物的蛋白印迹检测</td></tr><tr><td>Exoquick-TC 试剂</td><td>System Biosciences (SBI)</td><td>EXOTC50A-1</td><td>用于外泌体分离</td></tr><tr><td>外泌体 CD9 ELISA 完整试剂盒</td><td>System Biosciences (SBI)</td><td>EXOEL-CD9-A-1</td><td>用于外泌体定量</td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA/蛋白小型试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>80004</td><td>用于 DNA、RNA、蛋白的分离</td></tr><tr><td>Rneasy MinElute 清洁试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 UV-Vis 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>用于蛋白定量</td></tr><tr><td>ProteoSilver 银染试剂盒</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PROTSIL1-1KT</td><td>用于 SDS-PAGE 凝胶染色</td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell 电泳系统</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>用于运行 SDS-PAGE 凝胶</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 检测试剂</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>用于 RT-PCR 检测</td></tr><tr><td>qBasePlus v1.5 软件</td><td>Biogazelle NV</td><td></td><td>用于 RT-PCR 检测数据分析</td></tr><tr><td>兔多克隆抗体 ALIX</td><td>Millipore</td><td></td><td>用于生物标志物的蛋白印迹检测</td></tr><tr><td>鼠单克隆抗体 TSG101</td><td>Abcam</td><td></td><td>用于生物标志物的蛋白印迹检测</td></tr></tbody></table>

一种改良的沉淀法分离尿液外泌体

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

多年来，鉴定可在尿液和血浆中实现肾脏疾病早期检测的生物标志物一直是一个备受关注的研究领域。尿液外泌体囊泡在正常情况下由肾单位各节段的细胞释放进入尿液，大小为40-100 nm，可能含有代表其来源细胞类型的蛋白质、mRNA和microRNA。在肾功能障碍或损伤条件下，外泌体可能含有这些成分比例的改变，这些改变可作为疾病的生物标志物。目前已有多种可用于分离尿液外泌体的方法，我们此前已对这些方法进行了实验性比较，包括三种基于超速离心的方法、一种使用纳米膜超滤浓缩装置的方法、一种使用商用沉淀试剂的方法，以及一种在本实验室开发的基于ExoQuick试剂的改良沉淀技术。我们发现，改良后的沉淀法能获得最高的外泌体颗粒、miRNA和mRNA产量，因此适用于后续RNA谱分析所需的外泌体分离。我们得出结论：这种改良的外泌体沉淀方法为从尿液中分离外泌体提供了一种快速、可扩展且高效的方法。在本报告中，我们描述了使用ExoQuick试剂从人尿液中分离外泌体的改良沉淀技术。

尿液外泌体携带由肾小管上皮细胞分泌的蛋白质、miRNA 和 mRNA 生物标志物。分离和检测这些外泌体可能为糖尿病肾病等肾脏疾病的早期诊断提供有用的工具。目前已有多种方法可用于从人类受试者收集的尿液样本中分离外泌体。我们此前比较了六种尿液外泌体分离方法，并分析了所得的蛋白质、mRNA 和 miRNA 水平11。本文旨在详细描述我们开发的一种经改进的沉淀法，用于高效分离尿液外泌体。
<img alt="外泌体分离流程图；通过离心处理尿液；SDS-PAGE，生物标志物分析。" src="/files/ftp_upload/51158/51158fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1 描述了采用改良沉淀法分离尿液外泌体过程中各步骤的示意图流程图。 所得两份外泌体沉淀中的一份用于CD9检测，使用CD9 ELISA试剂盒进行测定，从而获得外泌体颗粒的相对...

本论文描述了一种使用改良沉淀法从人尿液中分离外泌体的实验方案。

多年来，鉴定可实现尿液和血浆中肾脏疾病早期检测的生物标志物一直备受关注。

本实验的总体目标是设计一种改良的外泌体沉淀方法，为从尿液中分离外泌体提供一种快速、可扩展且高效的方法。该方法首先通过离心去除尿液样本中的大块死细胞和细胞碎片，将含有尿液外泌体的上清液转移至新的离心管中。第二步，将沉淀物溶解于含有DTT的分离溶液中，以去除TAM马血清蛋白。随后，经过进一步离心后，将不含微囊（TP）的上清液与 ExoQuick TC 试剂在4°C过夜孵育，以沉淀外泌体。次日，将经 ExoQuick TC 试剂处理的样品进行最后一次离心，以获得外泌体沉淀。最终，可对外泌体进行后续分析，如 Western blot 和实时定量 PCR（realtime QPCR），以鉴定感兴趣的生物标志物。与现有的超滤浓缩和沉淀等方法相比，该技术的主要优势在于无需超速离心步骤，操作简便、相对快速，同时仍能获得较高产量且相对纯净的外泌体，可用于后续分子分析。在收集尿液前，向一个无菌空容器中加入3.125毫升 freshly prepared 蛋白酶抑制剂混合液，然后将约10毫升首次排尿的尿液收集至该容器中。将样本转移至15毫升锥形离心管中。请注意，收集的24小时尿液样本也可用于外泌体分离，需在4摄氏度下保存。在17,000 ×g 和37摄氏度条件下离心10分钟，以去除或分离尿液外泌体中的细胞碎片。接下来，小心操作以免扰动沉淀物，将上清液转移至新的离心管中，并将沉淀物重悬于500微升的分离溶液中。将沉淀物与DTT在37摄氏度下孵育10分钟，DTT的终浓度为200毫克每毫升，每2分钟涡旋混匀一次。待沉淀物完全溶解后，向样品中加入500微升的分离溶液，并立即离心所得悬浮液。将上清液与先前收集的上清液合并，并将新形成的沉淀重悬于50 µL分离溶液中。为进行SDS-PAGE分析以分离外泌体，首先将11 mL合并后的上清液与3.3 mL Exo-Quick TC试剂在4 °C孵育至少12小时。孵育后离心样品，将上清液转移至新的离心管用于SDS-PAGE分析，而含有尿液外泌体的沉淀则用于提取DNA、RNA或蛋白质，或在−80 °C下保存。使用 NanoDrop 分光光度计，通过测量 2 μL 样品在 260 和 280 纳米处的吸光度，确定每次提取物中 DNA 和 RNA 的浓度。图中显示了 SDS-PAGE 分析和利用 Western 印迹法检测生物标志物的改良再现结果：在泳道中，未处理尿液和第一尿沉淀蛋白条带均出现在 90 至 100 千道尔顿范围内，分别表明 TAM horse fall 蛋白的存在及其在最终上清和外泌体沉淀中的去除。未观察到 TAM horse fall 蛋白条带，说明该蛋白在前期步骤中已被去除，从而提高了外泌体沉淀的得率。在本实验中，即使使用少量样本，仍检测到了生物标志物 Alex 和 TSG 101，表明获得了高纯度的外泌体沉淀，适用于生物标志物分析，且未见大量可溶性蛋白质污染，包括 TAM 马源性下落蛋白（TAM horse fall protein）在其发育之后。该技术为慢性肾病领域的研究人员利用尿液分离的外泌体进行糖尿病肾病的早期检测与诊断开辟了道路。

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一种改进沉淀法来隔离尿外来体

血浆分离的外泌体可作为一种无创且可重复的方法，用于生物标志物的检测和随访，以实现早期发现和疾病进展监测。本视频介绍了从非小细胞肺癌患者血浆样本中分离外泌体的实验方案，该方法可用于后续的DNA和蛋白质提取。...

外泌体分离：一种从非小细胞肺癌患者血浆中分离外泌体的技术

关键词：外泌体，非小细胞肺癌，血浆，分离技术，生物标志物

本视频介绍了一种基于密度的超速离心技术，用于从人胚胎肾细胞培养物收集的条件培养基中分离外泌体，该方法采用在重水中配制的25%（w/w）蔗糖垫层。所分离的外泌体可用于后续应用。...

外泌体分离：利用蔗糖垫密度梯度超速离心法从培养细胞条件培养基中分离外泌体

本文介绍了一种从全血中分离外泌体，并利用半自动仪器通过纳米颗粒追踪技术进行进一步分析的方法。该技术为液体悬浮液中颗粒的可视化与分析提供了极为灵敏的方法。...

一种用于外泌体定量与粒径测量的创新方法

胆汁是细胞外囊泡/外泌体的宝贵来源，其中可能含有重要的生物标志物。本方案提供了一种可靠的方法，用于从人胆汁中分离外泌体，以便进行后续分析，包括miRNA谱型分析。...

从人胆汁中分离和分析含微小RNA的外泌体

本文介绍了一种从血浆和血清中纯化外泌体的方案，可显著减少非外泌体血液蛋白的共纯化。优化后的方案包括超滤、蛋白酶处理和尺寸排阻色谱。外泌体的高效纯化有助于后续分析，包括对外泌体更准确的定量以及蛋白质组学表征。...

蛋白质消化、超滤和尺寸排阻色谱法优化人血浆和血清中外泌体的分离

本文介绍了两种细胞外囊泡的分离方案：超滤离心法和密度梯度超速离心法，用于从小鼠支气管肺泡灌洗液样本中分离细胞外囊泡。通过这两种方法获得的小鼠支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡均进行了定量和表征。...

使用超滤离心技术从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离细胞外囊泡

本文介绍了一种通过移植来源于正常肌源性前体细胞的外泌体， transiently...

纯化并移植源自成肌祖细胞的外泌体以改善杜氏肌营养不良小鼠的心脏功能

本方案阐述了以下两个方面：1）从小鼠成年腓肠肌中分离和培养原代成纤维细胞；以及...

骨骼肌成纤维细胞外泌体的分离与表征

本方案详细描述了利用功能化磁珠高效分离尿液细胞外囊泡的方法。此外，还包括后续分析步骤，如蛋白质印迹、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学。...

基于化学亲和力的生物流体细胞外囊泡分离用于蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析

细胞外囊泡在生物医学应用中具有巨大潜力，但目前的分离方法耗时较长，且难以适用于临床。在本研究中，我们介绍了一种微流控装置，可对大量生物流体进行连续、步骤极少的细胞外囊泡直接分离。...

利用分流式A4F微流控芯片单步分离大体积样品中的细胞外囊泡

学习改进沉淀法从尿液中分离外泌体，该方法无需超速离心，操作简便快速，可获得高纯度外泌体用于Western blot和qPCR等下游分子分析，适用于慢性肾病生物标志物研究。

一种改良的沉淀法分离尿液外泌体

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