一种改良的沉淀法分离尿液外泌体
2015年1月16日
本论文描述了一种使用改良沉淀法从人尿液中分离外泌体的实验方案。
本实验的总体目标是设计一种改良的外泌体沉淀方法，为从尿液中分离外泌体提供一种快速、可扩展且高效的方法。该方法首先通过离心去除尿液样本中的大块死亡细胞和细胞碎片，将含有尿液外泌体的上清液转移至新的离心管中。第二步，将沉淀物溶解于含有DTT的分离溶液中，以去除TAM马源性蛋白。
随后，经过进一步离心后，将不含微囊泡（TP）的上清液与 Exo-Quick TC 试剂在4°C过夜孵育，以沉淀外泌体。次日，将经 Exo-Quick TC 试剂处理的样品进行最后一次离心，以获得外泌体沉淀。最终，可对外泌体进行后续分析，如 Western blot 和实时定量 PCR（qPCR），以鉴定目标生物标志物。
与现有的超滤浓缩和沉淀等方法相比，该技术的主要优势在于无需超速离心步骤，操作简便、相对快速，同时仍可获得较高产量且相对纯净的外泌体，适用于后续分子分析。在收集尿液前，向一个无菌空容器中加入3.125毫升 freshly prepared 蛋白酶抑制剂混合液，然后在此容器中收集约10毫升的首次排尿尿液。将样本转移至15毫升锥形管中。
请注意，收集的24小时尿液样本也可用于外泌体分离，需在4摄氏度下保存。在37摄氏度下以17,000 ×g离心10分钟，以去除或分离尿液外泌体中的细胞碎片。接下来，小心操作以免扰动沉淀物，将上清液转移至新的离心管中，并将沉淀物重悬于500 µL分离溶液中。
将沉淀物与DTT在37摄氏度下孵育10分钟，DTT终浓度为200毫克每毫升，每2分钟涡旋震荡一次。当沉淀物完全溶解后，向样品中加入500微升分离溶液，并立即离心所得悬液。
将上清液与先前收集的上清液合并，并将新获得的沉淀重悬于50 µL分离溶液中。为进行SDS-PAGE分析以分离外泌体，首先将11 mL混合上清液与3.3 mL ExoQuick TC试剂在4 °C孵育至少12小时。孵育后离心样品，然后将上清液转移至新管中用于SDS-PAGE分析，而含有尿液外泌体的沉淀则用于提取DNA、RNA或蛋白质，或储存于-80 °C。
使用 NanoDrop 分光光度计，通过测量 2 微升样品在 260 和 280 纳米处的吸光度，确定每次提取的 DNA 和 RNA 浓度。图中显示了 SDS-PAGE 分析和利用 Western 血液分析进行生物标志物检测的改良再现结果，其中未处理尿液及第一尿液沉淀蛋白条带在 90 至 100 千道尔顿范围内被观察到，分别表明 TAM horse fall 蛋白在最终上清液和外泌体沉淀条带中的存在与去除。未观察到 TAM horse fall 蛋白条带，表明该蛋白在前期步骤中已被去除，从而提高了外泌体沉淀的得率。
在本实验中，即使使用少量样本，仍可检测到生物标志物 Alex 和 TSG 101，表明外泌体沉淀物纯度很高，适用于生物标志物分析，且不存在大量可溶性蛋白质，包括 TAM 马源性下落蛋白（TAM horse fall protein）。该技术为慢性肾病领域的研究人员利用尿液分离的外泌体进行糖尿病肾病的早期检测与诊断开辟了道路。
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概述
本手稿描述了一种使用改良沉淀法从人尿液中分离外泌体的实验方案。该方法旨在为外泌体分离提供一种快速、可扩展且高效的替代方案。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 外泌体研究
背景
- 外泌体是参与细胞间通讯的小型细胞外囊泡。
- 从尿液中分离外泌体可为多种生物学过程提供研究线索。
- 现有方法可能耗时较长且效率较低。
- 一种改良的沉淀技术可提高外泌体的回收率。
研究目的
- 建立一种从尿液中快速分离外泌体的方法。
- 提高外泌体提取的可扩展性和效率。
- 促进下游应用，如生物标志物的鉴定。
使用的方法
- 通过离心去除尿液样本中的大细胞和碎片。
- 将沉淀物溶解在含有DTT的分离溶液中。
- 将上清液与 ExoQuick TC 试剂在4°C孵育过夜。
- 最终离心以获得外泌体沉淀。
主要结果
- 该改良方法可成功从尿液中分离出外泌体。
- 分离得到的外泌体可用于后续分析，如蛋白质印迹和定量PCR。
- 有效去除污染物可提高分离外泌体的纯度。
- 该实验方案可扩展用于更大样本量的处理。
结论
- 改良沉淀法是一种可行的外泌体分离方法。
- 该方法可简化外泌体在各类生物学研究中的应用。
- 未来的研究可进一步探索分离外泌体的其他应用。
常见问题
行业应用价值
分离尿液外泌体可实现对肾脏疾病的无创生物标志物发现，有助于早期检测以及在肾脏治疗开发中降低机制性风险。经改进的沉淀法为超速离心提供了一种可扩展、高得率的替代方案，提高了靶点验证工作流程的可重复性和通量。该方法通过减少污染并提高外泌体纯度，从而增强下游分子分析中生物标志物鉴定的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过分离反映肾单位节段细胞类型特异性内容物的外泌体，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：提供一种快速、可扩展的外泌体分离方法，无需超速离心，降低技术变异性。
- 预测价值：获得富含miRNA和mRNA的高纯度外泌体沉淀，用于分子谱型分析，提高生物标志物检测的可靠性。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：制备经过验证的外泌体样本，用于后续检测疾病相关生物标志物的实验，如蛋白质印迹法（Western blot）和定量聚合酶链式反应（qPCR）。
- 操作价值：通过基于沉淀的标准化流程实现外泌体的分离，适用于高通量样本处理。
- 检测适用性：获得稳定一致的外泌体产量，适用于RNA提取和蛋白质分析，支持可重复的生物标志物筛选。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过提供与疾病相关的外泌体内容物，支持从尿液生物标志物发现到临床前验证的转化研究。
- 机制去风险化：可在肾功能障碍条件下检测外泌体内容物的改变，有助于阐明病理生理通路。
- 预测可靠性：通过将外泌体生物标志物与糖尿病肾病的早期征象相关联，促进基于风险评估的后续研发决策。
流程与工作流整合
该方法适用于从假设验证到先导物识别的整个发现过程，能够实现无创生物标志物的分离，从而为靶点选择和临床前研究的连续性提供依据。
- 发现生物学：通过分离反映尿路细胞来源特异性内容物的外泌体，支持假设验证。
- 筛选：提供可重复、定量的外泌体输出结果，适用于生物标志物检测开发和化合物筛选。
- 分析：通过qPCR和Western blot检测外泌体相关RNA和蛋白质水平，实现不同条件间的比较分析。
- 转化研究：通过检测与疾病相关的内容物，将尿液外泌体生物标志物与肾脏疾病临床前模型相联系。
- 企业级复用：建立可扩展、标准化的分离平台，适用于多种尿液样本类型及多个研究项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过纯化外泌体用于生物标志物分析，减少机制上的不确定性，从而增强靶点验证。
- 操作价值：通过去除超速离心步骤并简化操作流程，提高实验的标准化程度和可扩展性。
- 战略价值：通过提高肾脏疾病早期生物标志物检测的可信度，支持更优的“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于可靠的外泌体生物标志物数据，实现对肾脏治疗候选药物的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备外泌体生物学以及RNA提取和qPCR等分子技术方面的专业知识。
- 需要配备离心设备、ExoQuick TC试剂以及用于RNA/DNA定量的分光光度计工具。
- 要求各实验团队之间进行标准化操作，以确保孵育时间、温度和试剂处理的一致性。
- 在将该方法应用于不同的尿液采集方案或储存条件时，需考虑相应的调整因素。
- 实际操作中的局限性包括需要过夜孵育，以及在转移过程中需小心操作以避免外泌体损失。
