一种改进沉淀法来隔离尿外来体
January 16th, 2015
这份手稿描述了一种使用改良沉淀技术从人尿液中分离外泌体的方案。
该程序的总体目标是设计一种改良的外泌体沉淀方法，为从尿液中分离外泌体提供一种快速、可扩展且有效的替代方案。这是通过首先通过离心从尿液样本中去除大死细胞和细胞碎片，然后将含有尿液外泌体的 snat 转移到新管中来实现的。在第二步中，将沉淀溶解在含有 DTT 的分离溶液中，以去除 TAM 马跌落蛋白。
然后在进一步离心后，将不含 TP 的上清液与 exo quick TC 试剂孵育过夜，以便在第二天沉淀外泌体。将 exo quick TC 试剂处理的样品最后一次离心以获得外泌体沉淀。最终，可以对外泌体进行下游过程，例如 Western blot 和实时 QPCR，以识别感兴趣的生物标志物。
与超浓缩过滤和沉淀等现有方法相比，该技术的主要优点是 arm 方法不需要超认证步骤，易于执行相对较快，同时仍为尿液收集前的后续分子分析提供高、相对纯净的外泌体产量。将 3.125 毫升新鲜制备的蛋白酶抑制剂混合物加入空的无菌容器中，然后在容器中收集大约 10 毫升的第一次排尿。将样品转移到 15 mL 锥形管中。
请注意，收集的 24 小时尿液样本也可用于外泌体分离，只需储存在 4 摄氏度下即可。在 17， 000 GS 和 37 摄氏度下旋转试管 10 分钟，以去除或分离尿液外泌体中的细胞碎片。接下来，注意不要干扰沉淀，将上清液转移到新管中，并将沉淀重悬于 500 微升分离溶液中。
将沉淀与终浓度为 200 毫克/毫升的 DTT 在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。每 2 分钟涡旋一次样品。然后，当沉淀完全溶解时，向样品中加入 500 μL 分离溶液，并立即旋转所得悬浮液。
将上清液与先前收集的上清液混合并重悬，将新沉淀重悬于 50 μL 分离溶液中。对于分离外泌体的 SDS 页面分析，首先将 11 毫升混合上清液与 3.3 毫升 exo quick TC 试剂在 4 摄氏度下孵育至少 12 小时。孵育后，离心样品，然后将上清液转移到新管中进行 SDS 页面分析，含有尿外泌体的沉淀用于提取 D-N-A-R-N-A 或蛋白质，或储存在零下 80 摄氏度。
使用 NanoDrop 分光光度计通过测量 260 和 280 纳米处的吸光度和两微升样品来确定每次提取的 DNA 和 RNA 的浓度。使用蛋白质血液分析的 SDS 页面分析和生物标志物检测的修改复制显示在未处理尿液的泳道中，并且观察到对应于 90 至 100 道尔顿的第一个尿颗粒蛋白禁令，表明在最终上清液和外泌体颗粒泳道中分别存在和去除 TAM 马坠蛋白。未观察到 TAM 马跌蛋白条带，表明在早期步骤中去除了 TAM 马跌蛋白，导致外泌体沉淀产量增加。
在本实验中，即使使用少量样品，也检测到生物标志物 Alex 和 TSG 1 0 1，表明用于生物标志物分析的外泌体沉淀非常纯，并且缺乏丰富的可溶性蛋白，包括 TAM 马坠蛋白发育后。这项技术为慢性肾脏病领域的研究人员使用尿液分离的外泌体进行糖尿病肾病的早期检测和诊断铺平了道路。
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概述
本手稿描述了一种使用改良沉淀技术从人尿液中分离外泌体的协议。该方法旨在提供一种快速、可扩展且有效的外泌体分离替代方案。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 外泌体研究
背景
- 外泌体是参与细胞间通讯的小型细胞外囊泡。
- 从尿液中分离外泌体可以为各种生物过程提供洞见。
- 当前的方法可能耗时且效率较低。
- 改良的沉淀技术可以增强外泌体的回收。
研究目的
- 开发一种从尿液中快速分离外泌体的方法。
- 提高外泌体提取的可扩展性和有效性。
- 为生物标志物鉴定等下游应用提供便利。
使用的方法
- 离心以去除尿液样品中的大细胞和碎片。
- 将沉淀溶解在含有DTT的分离溶液中。
- 用exo quick TC试剂与上清液过夜孵育。
- 最终离心以获得外泌体沉淀。
主要结果
- 改良的方法成功地从尿液中分离出外泌体。
- 外泌体可以用于下游分析，如Western blot和qPCR。
- 有效去除污染物提高了分离出的外泌体的纯度。
- 该协议可以扩展到更大的样品规模。
结论
- 改良的沉淀技术是一种可行的外泌体分离方法。
- 这种方法可以简化各种生物学研究中的外泌体研究。
- 未来的研究可能探索分离出的外泌体的其他应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolating urinary exosomes enables non-invasive biomarker discovery for kidney disease, supporting early detection and mechanistic de-risking in renal therapeutic development. The modified precipitation method offers a scalable, high-yield alternative to ultracentrifugation, improving reproducibility and throughput for target validation workflows. This approach enhances predictive confidence in biomarker identification by reducing contamination and increasing exosome purity for downstream molecular profiling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating exosomes that reflect cell-type-specific cargo from nephron segments.
- Operational Value: Provides a quick, scalable method for isolating exosomes without ultracentrifugation, reducing technical variability.
- Predictive Value: Increases confidence in biomarker detection by yielding high-purity exosome pellets enriched in miRNA and mRNA for profiling.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated exosome samples for downstream assays such as Western blot and qPCR to detect disease-associated biomarkers.
- Operational Value: Standardizes exosome isolation through a precipitation-based workflow compatible with high-throughput sample processing.
- Assay Readiness: Generates consistent exosome yields suitable for RNA extraction and protein analysis, supporting reproducible biomarker screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from biomarker discovery in urine to preclinical validation by providing disease-relevant exosome cargo.
- Mechanistic De-risking: Enables detection of altered exosome content under renal dysfunction, clarifying pathophysiological pathways.
- Predictive Confidence: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking exosome biomarkers to early signs of diabetic nephropathy.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling non-invasive biomarker isolation that informs target selection and preclinical continuity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating exosomes that reflect cell-origin-specific cargo from urinary tract cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative exosome outputs suitable for biomarker assay development and compound screening.
- Analytics: Enables measurement of exosome-associated RNA and protein levels via qPCR and Western blot for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects urinary exosome biomarkers to preclinical models of kidney disease through disease-relevant cargo detection.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized isolation platform applicable across multiple urine sample types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation by reducing mechanistic ambiguity through pure exosome isolation for biomarker profiling.
- Operational Value: Improves standardization and scalability by eliminating ultracentrifugation steps and simplifying workflow.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by increasing confidence in early biomarker detection for kidney disease.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of renal therapeutic candidates based on robust exosome biomarker data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in exosome biology and molecular techniques such as RNA extraction and qPCR.
- Needs access to centrifugation equipment, ExoQuick TC reagent, and spectrophotometric tools for RNA/DNA quantification.
- Demands standardization across teams to ensure consistent incubation times, temperatures, and reagent handling.
- Requires adaptation considerations when applying the method to different urine collection protocols or storage conditions.
- Practical limitations include the need for overnight incubation and careful handling to avoid exosome loss during transfers.
