Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

该程序的总体目标是通过多核糖体分析测量应激条件对哺乳动物细胞和组织的翻译、起始的影响。这是通过首先用抗癌药物处理哺乳动物癌细胞，然后制备细胞提取物来实现的。第二步是制作蔗糖、梯度。

接下来，将细胞提取物加载到蔗糖上，梯度，并超速离心以分离核糖体组分。最终，使用特异性抗体进行 western blot 分析以评估测试蛋白质与多核糖体的关联。现有方法（如代谢标记）的这种技术的主要优点是，它允许我们评估应激条件对翻译起始步骤的影响。

这种方法可以帮助回答压力治疗领域的关键问题，例如抗癌药物是否以及如何影响翻译起始。该技术的含义延伸到癌症治疗，因为它有助于揭示翻译起始的新调节途径。虽然这种方法可以深入了解细胞培养物中的翻译起始调控，但它也可以应用于其他系统，例如分离的组织，包括脑和肿瘤。

要首先制备自动密度梯度分离系统，请用 0.1% SDS 清洗装置的管路系统 5 分钟。然后用 70% 乙醇清洗管路系统 5 分钟，然后用 RNA Zap 溶液清洗 5 分钟。最后，使用 DEPC，水，通过将空气泵入系统来干燥管道系统。

接下来，制备 15% 和 55% 蔗糖溶液，使用 ISCO 模型一个 60 梯度形成器生成线性 15% 至 55% 蔗糖梯度。按照制造商的说明，仔细控制 tris 蠕动泵的速度非常重要，以避免在梯度生成器程序运行时在梯度中产生气泡或湍流，将超速离心机冷却至 4 摄氏度。在使用前，将梯度保持在 4 摄氏度，本实验利用先前接种的低传代 helo 宫颈癌细胞达到 80% 汇合。

在实验当天。在此过程中，从新鲜细胞中提取并避免 RNA 污染非常重要，在添加抗癌药物前 90 分钟，用新鲜的完全培养基替换细胞培养基。为了刺激翻译，将细胞放回培养箱中。

将抗癌药物作为对照加入细胞培养物中。DMSO 在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育 4 小时，4 小时后，将板放在冰上，并在 1 毫升裂解缓冲液中用冷 PBS 收获细胞洗涤细胞 3 次，以获得最佳结果。每个实验条件使用大约 1200 万个细胞。

将细胞从刮板转移到 einor 管中，并通过注射器将其 15 次充分混合。让细胞裂解物在冰上静置 15 分钟。接下来，将几滴细胞裂解物滴在载玻片上，并使用 10 x 物镜通过相差显微镜评估细胞裂解。

验证细胞裂解后，在 4 摄氏度下以 11， 000 Gs 离心 20 分钟，澄清细胞裂解物。将含有多聚核糖体的可溶性裂解物转移到新试管中，并在将细胞质提取物加载到蔗糖梯度上之前将其保存在冰上。使用分光光度计仔细测量存在的 RNA 浓度，并将大约 20 OD 的两个 60 单位的提取物缓慢加载到 15 至 55% 蔗糖梯度上。

确保试管表面有 2 到 3 毫米的可用空间，以避免离心过程中试管溢出。将管子加载到转子上。将转子放在超速离心机上，在 4 摄氏度下以 230， 000 Gs 离心梯度 2 小时 30 分钟。

离心完成后，取出试管并小心地将它们放在冰上，不要干扰梯度。要开始细胞质提取物的分级分离，请将蔗糖梯度置于自动密度分级分离系统上，并按照制造商的说明进行自动分级分离和级分收集。将每个 0.5 毫升馏分收集到单独的 Einor 管中，连续监测 250 纳米的吸光度，同时进行梯度分馏作，在每次运行结束时，聚核糖体曲线将在图表纸上进行编辑。

将带有收集馏分的 eend 管转移到冰上。要开始此过程，向每个收集的级分中加入两体积的 100% 冷乙醇，并让 RNA 蛋白复合物在零下 20 摄氏度下沉淀过夜。对于蛋白质的提取，用 70% 乙醇风干洗涤后，将每个 RNA 蛋白沉淀物在 11， 000 G 下在 4 摄氏度下离心 20 分钟，然后重悬沉淀物。

SDS 页面样品缓冲液 在进行蛋白质印迹分析以提取 RNA Resus 之前，将每个 RNA 蛋白沉淀悬浮在含有 0.1% SDS 的裂解缓冲液中，用 2 毫克/毫升蛋白酶 K 消化沉淀物的蛋白质成分 30 分钟。在 55% 摄氏度的水浴中，加入 1 体积的苯酚氯仿、2 体积的氯仿和 0.1 体积的 2 摩尔乙酸钠 pH 4。让它在冰上静置 15 分钟。

4 摄氏度下以 10， 000 GS 离心 20 分钟。通过添加 1 体积的异丙醇和每微升糖原 0.2 μg 并在零下 20 摄氏度下放置过夜，收集每个样品沉淀 RNA 的水相。第二天，在 4 摄氏度下以 10， 000 Gs 的速度旋转沉淀物 1 小时。

去除上清液，用 70% 冷乙醇洗涤 RNA 沉淀，将 RNA 沉淀重悬到小体积 RNA 中。免费水。使用分光光度计评估 RNA 的数量和质量。

此处显示的是来自细胞质提取物的代表性多核糖体谱。由在正常条件下生长或用蛋白酶体抑制剂处理 4 小时后生长的 helo 细胞制备，并以 15% 至 55% 体积重量线性蔗糖梯度离心。40 s 核糖体 60 s、核糖体 80 s、单体和多核糖体的位置在每个剖面中都标明。

左到右显示从上到下的馏分，收集馏分并通过 Western blot 分析针对大核糖体 L 28 蛋白的抗体，以及在正常生长条件下用作多核糖体完整性对照的多核糖体相关蛋白 FMRP。翻译起始复合物被转化为多核糖体，其通过多核糖体分析检测到活性翻译起始，如此处观察到。用蛋白酶体抑制剂处理可减少多核糖体峰，同时 DS Monos 增加，表明翻译起始受到抑制 在参加此程序时，重要的是在无 r nase 的环境中工作，以小心处理梯度并控制细胞裂解 遵循此程序。

可以执行其他方法，例如西血和北血，以回答其他问题，例如特定蛋白质或 M MNA 与多核糖体的关联，在其发展后受到抗癌治疗的影响。这项技术为 ary 翻译领域的研究人员探索调节翻译起始因子对癌症和神经退行性疾病等人类疾病的影响铺平了道路。