Name: 翻译起始的分析在应力条件由多聚核糖体剖析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学习利用多聚核糖体剖析技术分析哺乳动物细胞在应激条件下的翻译起始过程。该方法通过蔗糖梯度离心分离核糖体组分，结合蛋白质免疫印迹评估蛋白质与多聚核糖体的结合，为研究癌症治疗中的翻译调控机制提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

P. A. 是某项奖学金的获得者 &#34;Pierre Durand&#34; 来自拉瓦尔大学医学院。本研究由加拿大自然科学与工程研究委员会资助（项目编号：MOP-CG095386），授予 R. M.；多核糖体分级分离仪通过加拿大创新基金会资助（项目编号：MOP-GF091050）购得，授予 R. M.。R. M. 获得加拿大卫生研究院（CIHR）新研究者薪金奖。
我们感谢 E. Khandjian、I. Gallouzi、S. Di-Marco 和 A. Cammas 博士提供的有益建议。

该方案遵循以下指南 经拉瓦尔大学伦理审查委员会批准。
1. 细胞培养与脑组织操作的准备
<ol>
	<li>哺乳动物和 果蝇&#160;细胞
	<ol>
		<li>培养HeLa宫颈癌细胞和Schneider 果蝇 建议使用美国模式培养物集存库（ATCC）推荐的胚胎细胞，并在低代次时进行实验操作。</li>
		<li>以每孔细胞密度适宜的培养板接种细胞，确保实验当天细胞融合度达到80%。为获得最佳结果，请使用 &#8764;12 x 106 每种实验条件下细胞的数量。在制备多聚核糖体分析用提取物之前，加入新鲜的完全培养基，至少刺激翻译90分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑组织分离：从出生后9至16天的小鼠中分离脑组织。安乐死采用CO2 麻醉后通过吸入法实施安乐死并进行颈椎脱位。处死后，完整分离全脑，并将其置于-80℃保存 &#176;C 或直接转移至预冷的 1× PBS 中，立即使用。</li>
</ol>
2. 密度梯度分馏系统的制备
<ol>
	<li>用 0.1% SDS 清洗管路系统 5 分钟。</li>
	<li>用 70% 乙醇清洗管路系统 5 分钟，然后用 RNaseZAP 溶液清洗 5 分钟&#160;，最后用 DEPC 水清洗。</li>
	<li>泵入空气以干燥仪器的管路系统。</li>
</ol>
3. 蔗糖梯度的制备
<ol>
	<li>在 20 mM Tris-HCl pH 7.4、1.25 mM MgCl₂ 中配制 15% 和 55% 的蔗糖溶液2，150 mM NaCl 和 1 mM DTT。</li>
	<li>生成 使用 Isco Model 160 梯度混合仪，按照制造商说明书制备线性 15–55% 蔗糖梯度。然而，必须严格控制 TRIS 蠕动泵的流速，以避免梯度中产生气泡或湍流。将梯度置于 4 °C 保存 &#176;C，直至使用。</li>
	<li>在梯度混合仪程序运行期间，将超速离心机冷却至4 &#176;C.</li>
</ol>
4. 细胞和小鼠脑组织提取物的制备
<ol>
	<li>细胞提取物的制备
	<ol>
		<li>将培养板置于冰上，洗涤细胞3次&#160;用预冷的1× PBS冲洗。</li>
		<li>收获细胞（&#8764;12 × 106) 加入 1 ml 裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，1.25 mM MgCl₂）中2，150 mM NaCl，1 mM DTT，1% Nonidet P40，5 U/ml RNase抑制剂，并加入完整的无EDTA蛋白酶抑制剂混合片剂），转移至Eppendorf管中，反复吹打15次以充分混匀&#160;使用1 cc U100胰岛素注射器（28 G 1/2）进行操作。将细胞裂解液置于冰上静置15分钟。</li>
		<li>在载玻片上滴加数滴细胞裂解液，使用10倍物镜在相差显微镜下观察，以评估细胞裂解情况。裂解完全时应仅可见细胞核，无细胞膜残留。作为对照，同时观察未裂解的细胞。</li>
		<li>在4℃下以11,000 × g离心20分钟，澄清细胞裂解液 &#176;C，并保留含有多聚核糖体的可溶性裂解液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠脑组织提取物的制备
	<ol>
		<li>匀浆化整个分离的脑组织（&#8764;在冰上使用2 ml裂解缓冲液，以Dounce匀浆器匀浆（10次冲压）500 mg组织，随后在4°C下以11,000 × g离心15分钟，澄清匀浆液 &#176;C.</li>
		<li>将所得上清液加载至50%蔗糖垫上，使用超速离心机转子TH-641，在4 ℃、200,000 × g条件下离心沉降2小时 &#176;C.</li>
		<li>将含有多聚核糖体的半透明沉淀重悬于1 ml裂解缓冲液中，通过上下吹打充分混匀。将悬液置于冰上静置30分钟。&#160;在加载到梯度之前。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 将提取物上样至蔗糖梯度并进行超速离心
<ol>
	<li>使用分光光度计测定细胞质提取物中RNA的浓度。小心且缓慢地加载 &#8764;20 OD260 将提取物的单位上样至15%至55%的蔗糖梯度中。确保离心管表面留有2-3毫米的可用空间，以防止离心过程中液体溢出。</li>
	<li>使用超速离心机，以 TH-641 转子在 4 °C 条件下于 230,000 x g 离心 2 小时 30 分钟，对梯度样品进行离心 &#176;C. 离心结束后，取出离心管，小心放置于冰上，避免扰动密度梯度。</li>
</ol>
6. 多聚核糖体分析用细胞质提取物的分级分离
<ol>
	<li>将蔗糖梯度置于自动密度分馏系统中，并按照制造商说明进行自动分馏及组分收集（每份0.5 ml）。</li>
	<li>收集每一份馏分（&#8764;500 &#181;l) 分别收集到各个Eppendorf管中，同时持续监测254 nm处的吸光度。在进行梯度组分分离操作的同时，多聚核糖体图谱将被记录在记录纸上。或者，可使用连接至图表记录仪的数据采集装置，以实现多聚核糖体图谱的电子化采集。</li>
	<li>每次运行结束后，将收集的Eppendorf管转移至干冰上。此时，可将收集的组分在-80℃保存 &#176;C 或按如下步骤直接沉淀蛋白质-RNA 复合物。</li>
</ol>
7. 蛋白质提取与分析
<ol>
	<li>向蔗糖梯度中收集的每一份组分加入两倍体积的预冷100%乙醇，于-20 °C孵育过夜，使RNA-蛋白质复合物沉淀。</li>
	<li>将每份RNA-蛋白质沉淀物在4 °C下以11,000 × g离心20分钟，随后用70%乙醇洗涤。干燥后，将沉淀重悬于SDS-PAGE上样缓冲液中，再使用特异性抗体进行Western blot分析（见图&#160;2）。</li>
</ol>
8. RNA 提取与分析
<ol>
	<li>沉淀RNA-蛋白质复合物，步骤同7.1。将每份RNA-蛋白质沉淀物重悬于含有0.1% SDS的裂解缓冲液中。加入终浓度为2 mg/ml的蛋白酶K，消化沉淀物中的蛋白质组分30分钟。&#160;55 毫升 &#176;C 水浴</li>
	<li>通过加入1体积的裂解液提取沉淀物中的RNA组分 &#34;苯酚：氯仿&#34;，加入2倍体积的氯仿和0.1倍体积的2 M NaOAc（pH 4），在4℃下以10,000 × g离心 &#176;C 为&#160;20分钟。将各样本所得水相在-20℃沉淀RNA过夜 &#176;C，通过加入1体积的异丙醇和0.2 &#181;克/&#181;l 的糖原。在 4℃ 下以 10,000 × g 离心沉淀 1 小时 &#176;C. 用70%冷乙醇洗涤RNA沉淀。</li>
	<li>将RNA沉淀重悬于少量无RNase的水中。测定其含量 和质量 使用分光光度计测定RNA含量。</li>
</ol>

<ol><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Fournier, M. -J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell International. 10 (12), (2010).</li>
<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+Mental+Retardation+protein+determinants+required+for+its+association+with+polyribosomal+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs.</a> Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).</li>
<li>Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Metazoan+stress+granule+assembly+is+mediated+by+P-eIF2alpha-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms.</a> RNA. 15 (10), New York, N.Y. 1814-1821 (2009).</li>
<li>Gareau, C., Houssin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fragile+x+mental+retardation+protein+recruitment+and+dynamics+in+Drosophila+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules.</a> PLoS ONE. 8 (2), (2013).</li>
<li>Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMR1+transcript+isoforms%3A+association+with+polyribosomes%3B+regional+and+developmental+expression+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain.</a> PLoS ONE. 8 (3), (2013).</li>
<li>Khandjian, E. W., Huot, M. -E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+the+association+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+brain+polyribosomal+ribonucleoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).</li>
<li>Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+gene+expression+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neuropsychopharmacol+Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Translational control of gene expression in the human brain.</a> Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).</li>
<li>Stephens, S. B., Nicchitta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+In+vitro+and+tissue+culture+methods+for+analysis+of+translation+initiation+on+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum.</a> Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).</li>
<li>Koritzinsky, M., Wouters, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+regulation+of+messenger+RNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and regulation of messenger RNA translation.</a> Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).</li>
<li>Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes.</a> Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).</li>
<li>Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+slowdown+mediates+translational+arrest+during+cellular+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).</li>
<li>Thomas, J. D., Johannes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mRNAs+that+continue+to+associate+with+polysomes+during+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia.</a> RNA. 13, 1116-1131 (2007).</li>
<li>Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+gene+translation+profiles+reveal+tumor+type+and+cancer-specific+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components.</a> Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).</li>
<li>Fournier, M. -J., Coudert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+mTORC1-eIF4E+Pathway+alters+Stress+Granules+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).</li>
<li>Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+survival+motoneuron+protein+as+a+translational+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator.</a> Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).</li>
<li>Béchade, C., Rostaing, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+distribution+of+survival+motor+neuron+%28SMN%29+protein%3A+possible+involvement+in+nucleocytoplasmic+and+dendritic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport.</a> The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).</li>
<li>Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDRD3%2C+a+novel+Tudor+domain-containing+protein%2C+localizes+to+cytoplasmic+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules.</a> Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).</li>
<li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+let-7a+miRNA+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).</li>
<li>Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+analyse+the+specific+impact+of+rapamycin+on+mRNA-ribosome+association%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association.</a> BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).</li>
<li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).</li>
<li>Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+footprints+on+a+transcriptome+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal footprints on a transcriptome landscape.</a> Genome Biology. 10 (4), (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

蔗糖梯度中的多聚核糖体图谱分析可通过检测从细胞或组织中分离的多聚核糖体的密度来评估翻译起始效率9,11-14。该技术是目前测量体内（in vivo）翻译起始的最优（即使不是唯一）方法。它被用于监测细胞周期过程中增殖细胞的翻译状态15，并评估多种应激因素（包括病毒感染、缺氧13,16、辐射17以及治疗中使用的化学药物18）对翻译起始的影响。然而，尽管该技术在评估细胞培养物及特定组织（如脑和肝）的翻译起始方面效果良好，但其是否可用于比较正常组织与病变组织及肿瘤之间的翻译起始水平，仍有待确定。
在影响翻译延伸或终止的条件下，多核糖体图谱也可能发生变化。在这些情况下，翻译延伸速率受到抑制将导致多核糖体峰增加，而终止过程受到抑制则应导致相对于对照组出现更大的多核糖体。相反，翻译起始抑制剂会阻止多核糖体的重新形成，因为活性翻译起始复合物的形成被阻断。这在多核糖体图谱中表现为多核糖体峰减少，同时伴随80S单体核糖体的增加。由于翻译抑制剂使翻译起始复合物停滞，预期40S和...

真核细胞 constantly 遭遇多种有害的生理和环境应激条件，需要迅速产生适应性细胞反应。细胞应激反应涉及促生存与抗生存作用因子之间的精确平衡。打破这种平衡可能导致不可逆的后果，引发癌症和神经退行性疾病等人类病理学疾病的发生。在应激反应的第一阶段，细胞会激活促生存通路，该过程涉及在 mRNA 翻译水平上对基因表达变化的协调调控。
真核生物中的mRNA翻译是一个复杂的细胞过程，涉及翻译起始因子（eIFs）、特定的RNA结合蛋白（RBDs）与RNA分子之间的协调相互作用1。mRNA翻译可分为三个明确的阶段：起始、延伸和终止。尽管这三个阶段均受到调控机制的影响，但翻译调控机制主要靶向翻译的起始阶段，因此该阶段构成了蛋白质合成的限速步骤2。
翻译起始是一个高度有序的过程，首先由eIF2α·GTP·Met-tRNAiMet三元复合物的形成开始，该复合物随后与40S核糖体亚基结合，形成翻译前起始复合物。下一步是将前起始复合物招募至mRNA，此过程涉及翻译起始因子如eIF4F和eIF3的参与。由此形成的48S前起始复合物经历特定的构象变化，使该复合物能够沿mRNA的5'非翻译区进行扫描，直至识别起始密码子AUG。随后，大多数翻译起始因子被释放，60S亚基被招募，形成具有翻译活性的80S核糖体复合物，此时蛋白质合成开始（图1）。在同一时间，多个80S单体核糖体可同时翻译同一条mRNA，形成所谓的多聚核糖体（或多核糖体）。mRNA上多聚核糖体的密度反映了翻译的起始、延伸和终止速率，因此可作为特定转录本可翻译性的衡量指标。然而，多聚核糖体图谱主要用于评估mRNA翻译在起始阶段的变化。在本研究中，我们使用了一种蛋白酶体抑制剂作为翻译起始抑制剂。用该药物处理癌细胞会诱导一种应激反应，其特征是应激激酶HRI被激活，进而磷酸化翻译起始因子eIF2α3。eIF2α的磷酸化是导致哺乳动物细胞中翻译起始受到抑制的主要事件之一4。

<table><tbody><tr><td colspan="4">细胞</td></tr><tr><td>HeLa 宫颈癌细胞</td><td>美国模式培养物集存库（美国弗吉尼亚州马纳萨斯；ATCC）</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Schneider &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; 胚胎细胞</td><td>美国模式培养物集存库（美国弗吉尼亚州马纳萨斯；ATCC）</td><td>CRL-1963</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">培养基与添加剂</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SO146-500ml</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>11995-073</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientist Scientist</td><td>SH30396-03</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">蔗糖溶液</td></tr><tr><td>D-蔗糖</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP220-212</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49767</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Fisher Scientist</td><td>B3925</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tekniscience</td><td>3624-05</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 9779</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nonidet P40（Igepal CA-630）</td><td>MJS Biolynx</td><td>19628</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Tekniscience</td><td>4095-02</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RNase 抑制剂（RnaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂）</td><td>Life technologies</td><td>10777-019</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗蛋白酶（complete, mini, EDTA free）</td><td>Roche</td><td>11,836,170,001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA 提取</td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Life technologies</td><td>AM2542</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>苯酚:氯仿</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP1754I-400</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientist</td><td>C298-500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>糖原</td><td>Life technologies</td><td>10814-010</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Acros organics</td><td>327270010</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">抗体</td></tr><tr><td>抗 FMRP 抗体</td><td>Fournier &lt;i&gt;et al.&lt;/i&gt;, Cancer Cell International, 2010</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

应激条件下通过多聚核糖体分析检测翻译起始

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

mRNA翻译的精确调控对于真核细胞的稳态至关重要，尤其是在应对生理和病理应激时。该调控程序的异常可能导致受损细胞的异常增殖——这是癌症发展的标志，或导致细胞过早死亡，如在神经退行性疾病中所见。目前关于翻译调控分子机制的许多认识均来自利用密度梯度分离系统进行的多聚核糖体（polysome）分析。该技术依赖于将细胞质提取物在蔗糖线性梯度溶液中进行超速离心。离心完成后，可对对应于不同翻译中核糖体群体的区带进行分离和定量，从而获得多聚核糖体图谱（polysome profile）。多聚核糖体图谱的变化提示了在各种应激条件下翻译起始过程发生的变化或缺陷。该技术还可用于评估特定蛋白质在翻译起始中的作用，并测量特定mRNA的翻译活性。本文中，我们描述了用于构建多聚核糖体图谱的实验方案，以评估真核细胞和组织在正常或应激生长条件下的翻译起始情况。

如前所述，多聚核糖体图谱可用于分析在应激条件下翻译起始的变化。图1展示了翻译起始的简化示意图，如前所述，该过程为多步骤过程，涉及翻译起始复合物的有序组装。在正常生长条件下，翻译起始复合物转化为多聚核糖体，通过多聚核糖体图谱检测到这些多聚核糖体，表明翻译起始处于活跃状态（图2；未处理组）。然而，在应激条件下，翻译起始受到抑制，导致80S单体核糖体积累，同时多聚核糖体峰减少（图2；蛋白酶体抑制剂处理组）。
<img alt="蛋白质合成示意图：40S、60S 核糖体；eIF2α·GTP·Met-tRNA 复合物；mRNA 翻译过程。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51164/51164fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51164/51164fig1.jpg" width="500px" data-...

本文介绍了一种用于分析真核细胞在应激条件下mRNA翻译起始变化的方法。该方法基于正在翻译的核糖体与非翻译核糖体在蔗糖梯度中沉降速度的差异进行分离。

mRNA翻译的精确调控对于真核细胞的稳态至关重要，尤其是在应对生理和病理应激时。

本实验的总体目标是通过多聚核糖体分析，检测应激条件对哺乳动物细胞和组织翻译起始过程的影响。首先用抗癌药物处理哺乳动物癌细胞，然后制备细胞裂解液；第二步是制备蔗糖梯度。接下来，将细胞提取物加样到蔗糖梯度中，并通过超速离心分离核糖体组分。最终，使用特异性抗体进行蛋白质印迹分析，以评估受试蛋白与多聚核糖体的结合情况。该技术相较于现有方法（如代谢标记）的主要优势在于，能够用于评估应激条件对翻译起始阶段的影响。该方法有助于解答应激治疗领域的关键问题，例如抗癌药物是否以及如何影响翻译起始。该技术的应用意义延伸至癌症治疗，因为它有助于揭示翻译起始的新调控通路。尽管该方法可为细胞培养中的翻译起始调控提供见解，也可应用于其他系统，如分离的组织，包括脑组织和肿瘤组织。首先，为准备自动密度梯度分馏系统，用0.1% SDS清洗装置的管路系统5分钟。然后用70%乙醇清洗管路系统5分钟，接着用RNA Zap溶液清洗5分钟。最后，用DEPC水冲洗后，通过向系统中泵入空气将管路系统干燥。接下来，配制15%和55%的蔗糖溶液，并使用ISCO Model One 60梯度形成仪生成线性15%至55%的蔗糖梯度。按照制造商的说明，在梯度生成程序运行期间，需仔细控制Tris蠕动泵的速度，以避免梯度中产生气泡或湍流。将超速离心机预冷至4°C。将梯度液置于4°C保存直至使用。本实验采用低传代次数的HELO宫颈癌细胞，这些细胞此前已接种并培养至80%融合度。实验当天。从新鲜细胞中进行提取非常重要，并且在此过程中需避免RNA污染。在加入抗癌药物前90分钟，将细胞培养基更换为新鲜的完全培养基。为刺激翻译，将细胞放回培养箱中继续孵育。将抗癌药物直接加入细胞培养物中作为对照添加。DMSO孵育，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育四小时。四小时后，将培养板置于冰上，用预冷的PBS洗涤细胞三次，然后在1毫升裂解缓冲液中收集细胞。为获得最佳结果，每种实验条件建议使用约1200万个细胞。将刮取的细胞从培养板转移至微量离心管中，通过注射器反复吹打15次以充分混匀。将细胞裂解液置于冰上静置15分钟。随后，取少量细胞裂解液滴加到载玻片上，使用10倍物镜通过相差显微镜观察细胞裂解情况。在确认细胞裂解后，于4°C条件下以11,000 G离心20分钟，澄清细胞裂解液。将含有多核糖体的可溶性裂解液转移至新离心管中，并置于冰上保存，待后续将细胞质提取物加样至蔗糖梯度。使用分光光度计准确测定RNA浓度，并缓慢加载约20 OD260单位的提取物至15%–55%蔗糖梯度中。确保离心管管口留有2至3毫米的可用空间，以防止离心过程中液体溢出。将离心管装入转子中。将转子放入超速离心机，于4°C、230,000 G条件下离心2小时30分钟。离心完成后，取出离心管并小心地置于冰上，避免扰动密度梯度。为开始细胞质提取物的分级分离，将蔗糖梯度置于自动密度梯度分级系统上，并按照制造商说明进行自动分级及组分收集。在梯度分级的同时，持续监测250纳米处的吸光度，将每0.5毫升组分分别收集至独立的einor管中。每次运行结束时，多聚核糖体图谱将绘制在记录纸上。将收集到的组分转移至冰上的离心管中。开始此操作时，向每份收集的组分中加入两倍体积的100%冷乙醇，并在-20摄氏度下静置过夜，使RNA-蛋白质复合物沉淀。为提取蛋白质，先用70%乙醇洗涤各RNA-蛋白质沉淀，离心（11,000 ×g，4摄氏度，20分钟），然后将沉淀空气干燥并重新悬浮。在进行RNA提取的Western印迹分析之前，向每个RNA蛋白沉淀中加入含有0.1% SDS的裂解缓冲液，使沉淀重悬。加入终浓度为每毫升2毫克的蛋白酶K，消化沉淀中的蛋白质组分，孵育30分钟。在55°C水浴中进行反应，随后加入等体积的苯酚-氯仿、两倍体积的氯仿以及0.1倍体积的2摩尔/升、pH为4的醋酸钠溶液。冰上静置15分钟。在4°C、10,000 × g条件下离心20分钟。收集各样品的水相，通过加入等体积异丙醇和0.2微克/微升的糖原沉淀RNA，并在-20°C下静置过夜。次日，在4°C、10,000 × g条件下离心1小时以收集沉淀。去除上清液，用70%冷乙醇洗涤RNA沉淀，将RNA沉淀重悬于少量无RNA酶的水中。使用分光光度计评估RNA的浓度和质量。图中显示的是从细胞质提取物中获得的典型多聚核糖体图谱。样品来源于在正常条件下培养的helo细胞，或经蛋白酶体抑制剂处理四小时后的helo细胞，通过15%至55%（体积/重量）的线性蔗糖梯度离心分离。每条图谱中标注了40S核糖体、60S核糖体、80S单体以及多聚核糖体的位置。从左到右依次显示密度梯度从顶部到底部的各组分；收集各组分后，使用针对大核糖体蛋白L28以及多聚核糖体相关蛋白FMRP的抗体进行Western印迹分析，二者在正常生长条件下可作为多聚核糖体完整性的对照。翻译起始复合物会转化为多聚核糖体，通过多聚核糖体分析对其进行检测，可反映活跃的翻译起始过程，如本实验所观察到的结果。使用蛋白酶体抑制剂处理后，多聚核糖体峰减少，同时80S单核糖体峰相应增加，表明翻译起始受到抑制。在进行该实验操作时，需注意在RNase-free环境中操作，小心处理密度梯度，并严格控制细胞裂解情况。还可以采用其他方法，如Western blot和Northern blot，以回答更多问题，例如特定蛋白质或mRNA与多聚核糖体的结合如何受到抗癌治疗的影响。该技术的建立为从事翻译调控研究的科研人员探索翻译起始因子在癌症和神经退行性疾病等人类疾病中的作用奠定了基础。

analysis-translation-initiation-during-stress-conditions-polysome

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

翻译起始的分析在应力条件由多聚核糖体剖析

本文介绍了一种从真核细胞中提取正在翻译的核糖体的实验方案。提取后，通过蔗糖梯度分级分离将核糖体分为单体核糖体和多聚核糖体，从而实现对不同核糖体群体的分析。因此，该方法是研究翻译调控的金标准。...

真核生物多聚核糖体图谱分析

核糖体在蛋白质合成中起着核心作用。通过蔗糖密度梯度离心法对多核糖体（多聚体）进行分级分离，可直接在全基因组范围内测定各个mRNA的翻译效率。此外，该方法还可用于对与核糖体和多核糖体相关的分子（如分子伴侣和信号分子）进行生物化学分析。...

多聚核糖体分级分离及哺乳动物转译组的全基因组规模分析

细胞适应应激的能力对其存活至关重要。mRNA 翻译的调控即为一种此类适应策略，可实现对蛋白质组的快速调控。本文提供了一种标准化的多聚体分析流程，用于鉴定在应激条件下被选择性翻译的特定...

通过多聚体图谱分析评估哺乳动物细胞中mRNA的选择性翻译

本方案描述了一种根据结合的核糖体数量从植物组织中提取和分级分离转录本的简便方法。该方法可用于全局评估翻译活性，并确定特定mRNA的翻译状态。...

一种简便的植物多聚核糖体分析方法

转录后调控在控制蛋白质丰度中起着重要作用。本文中，我们描述了一种用于定量分析芽殖酵母 Saccharomyces cerevisiae...

通过核糖体图谱分析对芽殖酵母进行全基因组翻译定量分析

哺乳动物mRNA上翻译起始复合物形成的脚印分析

多核糖体分析技术的总体目标是分析蛋白质合成过程中单个mRNA或转录组mRNA的翻译活性。该方法对于研究健康状态及多种人类疾病中的蛋白质合成调控、翻译激活与抑制具有重要意义。...

利什曼原虫、人细胞和小鼠睾丸中的多聚核糖体分析

哺乳动物大脑的发育需要在翻译水平上对基因表达进行精确调控。本文介绍了一种多聚核糖体分析系统，该系统配备易于组装的蔗糖梯度制备与分级分离平台，可用于评估发育中大脑内mRNA的翻译状态。...

利用多聚核糖体分析法研究小鼠发育大脑中的翻译过程

我们介绍一种利用甲醛交联在活酵母和哺乳动物细胞中快速稳定翻译（蛋白质生物合成）复合物的技术。该方法能够解析瞬时中间产物以及动态的RNA:蛋白质相互作用。交联后的复合物可用于多种下游应用，例如基于深度测序的分析方法、显微镜观察和质谱分析。...

快速 体内 真核细胞中翻译复合物的固定与分离

本实验方案描述了如何在不使用自动梯度生成仪或梯度分段收集系统的情况下，制备多聚核糖体图谱。...

无需梯度混合器或组分分离系统的多聚核糖体分析

本方案通过多聚核糖体分析，将与核糖体结合的转录组（即翻译组）分离为非多聚核糖体RNA和多聚核糖体RNA 拟南芥 通过蔗糖密度梯度离心法。该方法可检测热应激条件下翻译效率 拟南芥.

热应激条件下利用多聚核糖体图谱检测翻译效率

学习利用多聚核糖体剖析技术分析哺乳动物细胞在应激条件下的翻译起始过程。该方法通过蔗糖梯度离心分离核糖体组分，结合蛋白质免疫印迹评估蛋白质与多聚核糖体的结合，为研究癌症治疗中的翻译调控机制提供重要工具。

应激条件下通过多聚核糖体分析检测翻译起始

探索更多视频