降低伊曲康唑浓度和处理时间在治疗两栖动物蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis）感染中具有显著疗效

本实验的总体目标是利用抗真菌化疗药物三唑类药物治疗感染了两栖动物壶菌真菌（Batrachochytrium dendrobatidis，简称 Bd）的两栖动物。首先通过培养 Bd 菌株，并用该真菌病原体接种动物以建立感染；第二步是通过皮肤拭子样本的 DNA 提取和定量 PCR（qPCR）检测，确认动物是否成功感染 Bd。

接下来，用0.0025%的克霉唑溶液对感染动物进行每天一次、每次五分钟、持续六天的药浴治疗。最后一步是在完成治疗后，对动物进行至少四周的感染状态监测，通过采集皮肤拭子样本进行QPCR分析，以确认动物是否治愈。本方案表明，使用浓度更低、治疗时间更短的抗真菌药物伊曲康唑，对感染蛙壶菌（bd）的动物仍具有良好的治疗效果。与推荐治疗方案（使用0.01%伊曲康唑溶液连续治疗11天）相比，本方案的主要优势在于：仅使用推荐剂量四分之一的药物浓度，并将治疗时间缩短至六天，依然能够有效清除BD感染，同时显著降低推荐剂量可能带来的不良副作用。

按照文本方案所述，在Tritone肉汤中孵育BD并检查游动孢子（Zo spore）活动后，向每个平板中加入5毫升陈化自来水，淹没平板，静置10分钟，使游动孢子（ZO spore）进入培养基。随后，将游动孢子（Zo Spor）悬浮液倒入便携容器中。使用血细胞计数板估算游动孢子（ZO spor）浓度，并用陈化自来水将悬浮液稀释至每3毫升含1×10⁶个游动孢子的浓度，用于接种实验动物，例如此处所示的Latoria vei Alpina。

将其置于一个50毫升的容器上方，将三毫升接种液混合物倒在它的腹侧。然后将动物放入容器中，使其接触接种液的流液。盖上容器盖子，将动物在接种容器中放置24小时，以确保感染成功。

为防止与 BD 病原体发生污染，应脱去旧手套，并将其放置于待高压灭菌后丢弃。戴上新手套后，继续接种下一个动物。

接种24小时后，将动物放回各自已消毒的饲养箱中饲养两周。记住，在处理所有液体废弃物之前，需将其用10%次氯酸钠溶液消毒两周。使用无菌棉签对动物进行拭子取样，以检测蛙壶菌（BD）感染是否成功。

在涂抹过程中及两次涂抹之间轻柔旋转棉签。在每侧腹面、每个大腿以及四肢上各涂抹五次，共45次。将棉签置于1.5毫升离心管中，于-20摄氏度保存。

使用市售的DNA提取试剂盒从拭子中提取基因组DNA，并按照文本方案进行定量PCR（QPCR）。根据文本方案中所述，准备三个处理浴，分别对应三种剂量的伊曲康唑。随后将个体两栖动物放入已消毒的容器中。

使用含有35毫升处理溶液的50毫升罐形容器。在动物之间更换手套，轻轻摇晃容器，确保动物完全浸没，持续五分钟。五分钟后，将动物放回已消毒的区域。

每天重复进行五分钟的处理，持续额外五天。治疗结束后一周对动物再次检测 BD 感染情况，并在之后连续四周每周检测一次，以确认感染已彻底清除。需注意，即使治疗已完成，仍应将动物视为具有潜在污染风险并进行相应处理。

感染后，动物需要在独立区域饲养至少一个月。如果治疗未成功，则必须重复治疗。不同物种及不同生命阶段对感染和治疗方案的反应各不相同，因此在广泛实施前必须先进行治疗方案的试验。

由于蛙壶菌（BD）具有生物危害性，需每周对单个饲养盒进行消毒，将饲养盒及处理容器浸泡于10%的次氯酸钠溶液中至少30秒，随后用清水冲洗两次以去除残留的消毒液，并将容器晾干24小时后方可再次使用，以确保青蛙的存活。此处展示了经过11天或6天蛙壶菌处理的结果。

黑色箭头指示治疗的最后一天。实线表示对照组的存活情况。实心黑色线条代表BD检测呈阳性但未接受BD治疗的动物。

实线灰色线条代表BD检测阴性且未接受BD治疗的动物。虚线表示接受指定浓度酮康唑治疗组的存活情况。所有接受0.0025%浓度酮康唑雾化治疗6天的动物，在治疗结束4周后BD检测均为阴性，因此该治疗被视为成功。

此外，该剂量的益康唑处理与BD阳性对照组相比，在死亡率上无显著差异。需要注意的是，0.01% 和 0.005% 的益康唑处理11天后，与BD阳性对照组相比，死亡率显著升高。请务必注意，真菌病原体BD属于生物危害物，操作时应采取相应的生物安全防护措施，例如佩戴并及时更换手套、对所有固体废弃物进行高压灭菌处理以及消毒等。

执行本操作步骤时，必须处理所有液体废弃物。