Name: 减少伊曲康唑的浓度和持续时间是成功的治疗 Batrachochytrium壶菌感染两栖动物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-14T18:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 了解使用低浓度伊曲康唑治疗两栖动物壶菌感染的方法。该方案通过每日药浴六天并结合QPCR监测，在有效清除Batrachochytrium dendrobatidis的同时显著降低死亡率与副作用。

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我谨感谢C.L. Richards-Zawacki在实验设计构思和材料准备方面提供的帮助，感谢A. Pessier在建立治疗方案和尸体解剖分析方面的协助，感谢M.W.H. Chatfield、M.J. Robak、K. Tasker和D. Lenger在实验室工作中的支持与帮助，以及感谢Taronga动物园的M. McFadden和P. Harlow在拍摄期间提供场地使用。本项目部分资金由路易斯安那州野生动物和渔业部通过路易斯安那州环境教育委员会授予L.A. Brannelly的资助以及Life Technologies提供。

伦理审批：本研究及其方法已获得杜兰大学动物使用与护理委员会的批准（方案编号：0407）。
1. 棘蛙壶菌（Bd）感染检测
<ol>
	<li>对Bd进行拭子采样
	<ol>
		<li>使用无菌棉签在动物腹面擦拭5次，每侧大腿、每侧身体和每个肢体各擦拭5次，总共45次擦拭。拭子采样是一种对两栖动物皮肤上Bd进行非侵入性取样的方法。</li>
		<li>在擦拭过程中及每次擦拭之间轻轻旋转棉签，以确保棉签上收集到尽可能多的DNA。</li>
		<li>将棉签储存于1.5 ml微量离心管中，置于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA提取与qPCR检测
	<ol>
		<li>使用市售的DNA提取试剂盒，按照动物组织操作说明从棉签样本中提取基因组DNA。</li>
		<li>采用定量实时PCR（qPCR）分析提取的DNA，具体步骤参照Boyle et al.17的方法，并作如下修改：</li>
		<li>用双蒸水将DNA提取物按1:10比例稀释。</li>
		<li>向反应体系中加入0.7 µl牛血清白蛋白（BSA），以防止PCR抑制。</li>
		<li>每个样本中均加入内参阳性对照，以确保PCR抑制未影响检测结果。</li>
		<li>检测时需设置阳性对照、阴性对照以及一系列稀释标准品，用于估算游动孢子（感染负荷）的数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 接种
<ol>
	<li>培养Bd
	<ol>
		<li>通过将10 g胰蛋白胨加入1 L反渗透或去离子水中，高压灭菌（121 °C，40分钟），冷却后制备胰蛋白胨肉汤。待冷却至23 °C后，加入1 ml青霉素-链霉素溶液。</li>
		<li>将Bd菌株（JEL411，由J. Longcore提供，分离自巴拿马瓜巴尔地区的Phyllomedusa lemur）在胰蛋白胨肉汤中于23 °C培养七天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将肉汤培养物转移至含胰蛋白胨的琼脂平板。
	<ol>
		<li>制备平板时，将10 g胰蛋白胨和10 g琼脂加入1 L反渗透或去离子水中，高压灭菌（121 °C，40分钟）。</li>
		<li>待高压灭菌后的混合物冷却至可触碰但尚未凝固时，在超净工作台中倒入培养皿，每皿填充1/4至1/3体积。</li>
		<li>待琼脂完全凝固并冷却后，向每块平板加入0.5 ml Bd肉汤，并均匀涂布，静置使其干燥。</li>
		<li>平板接种Bd游动孢子后，用Parafilm密封。</li>
		<li>将平板置于23 °C培养5至7天。接种前检查游动孢子的运动情况以确保其活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备用于游动孢子接种的悬浮液
	<ol>
		<li>经过5至7天的Bd培养和生长后，向每块平板加入5 ml陈化自来水，使游动孢子释放至液体中，静置10分钟。</li>
		<li>将游动孢子悬浮液倒入便携容器中。</li>
		<li>使用血细胞计数板估算游动孢子浓度。</li>
		<li>用陈化自来水将悬浮液稀释至每3 ml含1 × 106&#160;个&#160;游动孢子的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种动物
	<ol>
		<li>在单独的50 ml容器中，将3 ml接种液倾倒于每只动物的腹侧进行接种。让多余的接种液滴入接种容器底部。</li>
		<li>每只动物在接种容器中保留24小时，以确保感染成功。</li>
		<li>接种24小时后，将动物转移回各自已消毒的饲养箱中。</li>
		<li>让感染发展两周时间。通过拭子采样和qPCR结果确认感染后，开始治疗。</li>
		<li>对于Bd&#173;阴性对照组，用5 ml陈化自来水冲洗无Bd的琼脂平板，并采用与上述相同的方法对动物进行模拟接种。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 治疗方案
<ol>
	<li>准备处理液
	<ol>
		<li>将 2.50 ml 水溶性伊曲康唑（1% 斯皮仁诺口服溶液）加入 1 L 两栖动物林格氏液中（终浓度为 0.0025% 伊曲康唑——最低有效治疗浓度）。
		<ol>
			<li>两栖动物林格氏液配方：1 L 反渗透水或去离子水，6.6 g 氯化钠，0.15 g 氯化钾，0.15 g 氯化钙，以及 0.2 g 碳酸氢钠。121 °C 高压灭菌 40 分钟，冷却至室温。</li>
			<li>如需配制 0.01% 伊曲康唑处理液，将 10.00 ml 水溶性伊曲康唑（1% 斯皮仁诺口服溶液）加入 1 L 两栖动物林格氏液中。</li>
			<li>如需配制 0.005% 伊曲康唑处理液，将 5.00 ml 水溶性伊曲康唑（1% 斯皮仁诺口服溶液）加入 1 L 两栖动物林格氏液中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于 Bd 阳性及 Bd 阴性对照组，将动物置于不含伊曲康唑的两栖动物林格氏液中浸泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理过程
	<ol>
		<li>将单个两栖动物放入盛有 35 ml 处理液的已消毒 50 ml 容器中。</li>
		<li>轻轻旋转容器，确保动物完全浸没于液体中，持续 5 分钟。</li>
		<li>将动物放回已消毒的饲养箱中。连续重复处理 6 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确认治疗效果
	<ol>
		<li>在开始治疗当天检测动物是否感染 Bd。</li>
		<li>治疗结束后一周进行 Bd 感染检测，并在此后每周检测一次，连续四周，以确认感染已清除。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Bd 作为一种生物危害
<ol>
	<li>每周对单个饲养箱进行消毒。
	<ol>
		<li>将饲养箱和处理容器浸泡在10%的次氯酸钠溶液中。</li>
		<li>用流动水将经过次氯酸钠处理的每个容器冲洗两次。</li>
		<li>容器在重新使用前需静置干燥24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>操作动物时应佩戴洁净的丁腈手套，以防止Bd病原体交叉污染。每次处理不同动物之间均需更换手套。</li>
	<li>所有液体废弃物在丢弃前须用10%次氯酸钠溶液进行消毒处理。</li>
	<li>所有可能接触过Bd的固体废弃物在丢弃前须经高压灭菌处理。</li>
</ol>

<ol><li>Stuart, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Status+and+trends+of+amphibian+declines+and+extinctions+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide.</a> Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).</li>
<li>Skerratt, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+of+chytridiomycosis+has+caused+the+rapid+global+decline+and+extinction+of+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22EcoHealth%22%5BJournal%5D)">Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs.</a> EcoHealth. 4, 125-134 (2007).</li>
<li>Wake, D. B., Vredenburg, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloquium+paper%3A+are+we+in+the+midst+of+the+sixth+mass+extinction%3F+A+view+from+the+world+of+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Colloquium paper: are we in the midst of the sixth mass extinction? A view from the world of amphibians.</a> PNAS. 105, 11466-11473 (2008).</li>
<li>Voyles, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrolyte+depletion+and+osmotic+imbalance+in+amphibians+with+chytridiomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Aquat.+Org%22%5BJournal%5D)">Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis.</a> Dis. Aquat. Org. 77 (2), 113-118 (2007).</li>
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<li>McMahon, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis+has+nonamphibian+hosts+and+releases+chemicals+that+cause+pathology+in+the+absence+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis has nonamphibian hosts and releases chemicals that cause pathology in the absence of infection.</a> PNAS. 110 (1), 210-215 (2013).</li>
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<li>Garner, T. W. J., Garcia, G., Carroll, B., Fisher, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+itraconazole+to+clean+Batrachochytrium+dendrobatidis+infection%2C+and+subsequent+depigmentation+of+Alytes+muletensis+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Aquat.+Org%22%5BJournal%5D)">Using itraconazole to clean Batrachochytrium dendrobatidis infection, and subsequent depigmentation of Alytes muletensis tadpoles.</a> Dis. Aquat. Org. 83, 257-260 (2009).</li>
<li>Brannelly, L. A., Richards-Zawacki, C. L., Pessier, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+trials+with+itraconazole+as+a+treatment+for+chytrid+fungal+infections+in+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Aquat.+Org%22%5BJournal%5D)">Clinical trials with itraconazole as a treatment for chytrid fungal infections in amphibians.</a> Dis. Aquat. Org. 101 (2), 95-104 (2012).</li>
<li>Jones, M. E. B., Paddock, D., Bender, L., Allen, J. L., Schrenzel, M. S., Pessier, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+chytridiomycosis+with+reduced-dose+itraconazole%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Aquat.+Org%22%5BJournal%5D)">Treatment of chytridiomycosis with reduced-dose itraconazole.</a> Dis. Aquat. Org. 99 (3), 243-249 (2012).</li>
<li>Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantitative+detection+of+chytridiomycosis+%28Batrachochytrium+dendrobatidis%29+in+amphibian+samples+using+real-time+Taqman+PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Aquat.+Org%22%5BJournal%5D)">Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay.</a> Dis. Aquat. Org. 60 (2), 141-148 (2004).</li>
<li>Martel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+safe+antifungal+treatment+protocol+to+eliminate+Batrachochytrium+dendrobatidis+from+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians.</a> Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).</li>
<li>Bowerman, J., Rombough, C., Weinstock, S. R., Padgett-Flohr, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terbinafine+hydrochloride+in+ethanol+effectively+clears+Batrachochytrium+dendrobatidis+in+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Herpetol.+Med.+Surg%22%5BJournal%5D)">Terbinafine hydrochloride in ethanol effectively clears Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians.</a> J. Herpetol. Med. Surg. 20 (1), 24-29 (2010).</li>
<li>Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloramphenicol+with+fluid+and+electrolyte+therapy+cures+terminally+ill+green+tree+frogs+%28Litoria+caerulea%29+with+chytridiomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Zoo+Wildlife+Med%22%5BJournal%5D)">Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis.</a> J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

采用本方案，我们能够安全有效地降低两栖动物Bd感染伊曲康唑治疗的用药剂量和治疗时间。最低剂量和最短疗程（0.0025%浓度，持续6天）对亚临床感染的I. nebulifer实现了有效的治疗效果。较低剂量与较短疗程的有效性表明，有必要开展针对Bd感染的临床治疗试验，因为目前尚无适用于所有种类和年龄阶段两栖动物的安全有效治疗方法。
目前尚不清楚伊曲康唑治疗导致死亡的具体原因11。 &#160;在 Brannelly et al.15&#160;的研究中，对治疗期间或治疗结束后不久死亡的一小部分个体进行了尸检和组织病理学分析。这些分析结果未能明确死亡原因，但可以确定的是，没有动物死于壶菌病。个体死亡至样本保存之间发生了中度自溶，这可能影响了我们检测不同治疗组之间细微差异的能力。
尽管本方案支持存在一种安全有效的治疗方案，但仍需开展更多类似的试验。另一种唑类药物伏立康唑（voriconazole）已在至少一个物种中证明有...

两栖动物目前正经历着所有脊椎动物类群中最大的生物多样性下降1。壶菌病是一种由壶菌真菌病原体Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）引起的皮肤疾病，是导致这些显著种群衰退的主要原因之一2。Bd是有记录以来对生物多样性丧失影响最严重的病原体：它可感染超过600种两栖动物，已导致300多个物种数量下降，其中多达200个物种已沦为极危或灭绝2,3。两栖动物壶菌对宿主无特异性，目前尚不清楚宿主的哪些特性允许Bd感染进展并引发严重疾病。壶菌病通过破坏皮肤中的离子通道导致死亡，引发电解质流失和心力衰竭4。此外，Bd的上清液（不含Bd游动孢子）可引起蝌蚪的免疫反应5，使研究人员推测Bd会产生一种有毒副产物6。
由于许多物种数量正在迅速下降，圈养保育种群和繁育计划已成为重要的保护措施，对某些物种而言可能是唯一的生存保障。建立并维持无病种群对于两栖动物管理机构而言是一项挑战。目前治疗Bd感染的化学疗法虽然有效，但可能对受治疗动物造成伤害，且尚无任何单一治疗方法能在不同种类和不同年龄阶段的两栖动物中均取得成功7。
针对Bd感染的治疗方案，目前开展的临床试验较少7。最常用的三种治疗方法为热疗、氯霉素和伊曲康唑。热疗是一种非化学治疗手段，似乎副作用较少，可用于多个生活史阶段，且通常有效。在一项治疗试验中，Chatfield 和 Richards-Zawacki8发现，将动物置于30 °C环境下饲养10天后，96%的受试动物已清除感染。尽管该试验未达到100%的成功率，但为其他研究人员评估其自身物种的热疗效果提供了基准。尽管热疗对许多物种有效，但对于无法长时间耐受高温的高山物种而言，该方法并不实用。氯霉素是一种抗菌剂，已成功用于多种物种的Bd治疗，并可在体外抑制真菌生长。作为抗菌剂，氯霉素并非特异性地攻击真菌，但已知可导致真核细胞发生凋亡9。有推测认为，氯霉素治疗可引发皮肤细胞凋亡，从而杀死细胞内的孢子囊，但其确切作用机制尚不明确。尽管尚未开展临床试验，因此剂量和治疗时长尚未得到评估，目前的治疗方案通常需要浸泡两到四周10,11，这使得该疗法&#160;不适用于陆生两栖动物。此外，由于人类接触氯霉素与一种罕见的再生障碍性贫血相关，一些国家已限制其在兽医领域的使用12。
伊曲康唑是一种唑类抗真菌药物，是目前在圈养两栖动物中治疗Bd感染应用最广泛的方法。最常用的治疗方案是将动物置于0.01%的伊曲康唑溶液中浸泡，每天一次，每次5分钟，连续11天。该方案源自哺乳动物用药标准，虽然对两栖动物有效，但并未基于针对两栖动物的临床试验11,13。该方案可能在某些物种中引起不良副作用，尤其在Rana属以及蝌蚪和近期完成变态的个体中更为明显11。使用更低浓度（0.0005%）的伊曲康唑治疗蝌蚪已取得成功，但伴随出现脱色现象14。相同浓度在近期完成变态的个体中进行试验时，发现无法有效清除感染15。由于伊曲康唑治疗存在产生不良副作用的风险，一些实践者采用常规浓度的一半（0.005%）进行治疗，连续11天，结果证实该方案可成功治愈Bd感染16。
本研究是一项使用伊曲康唑治疗Bd感染的临床治疗试验的总结15。该方案旨在探索对感染Bd的动物使用伊曲康唑治疗时，既安全又有效的最低剂量和最短治疗时间。本研究使用的动物为墨西哥湾沿岸蟾蜍（Incilius nebulifer）的近期变态个体。

<table><tbody><tr><td>0.1% 水性伊曲康唑，Sporonox</td><td>杨森制药公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510-100</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td>医疗与导丝设备</td><td>MW113</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>73.703.217</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNEasy 血液与组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69581</td><td></td></tr><tr><td>7500 实时荧光定量 PCR</td><td>应用生物系统公司</td><td>4351104</td><td></td></tr><tr><td>VIC IPC</td><td>应用生物系统公司</td><td>4308323</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>应用生物系统公司</td><td>AM2618</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Invitrogen</td><td>Q10029</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430589</td><td></td></tr></tbody></table>

降低伊曲康唑浓度和处理时间在治疗两栖动物蛙壶菌（batrachochytrium dendrobatidis）感染中具有显著疗效

Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians

两栖动物是所有脊椎动物类群中种群下降最严重的类群，而造成这一下降的主要原因之一是一种真菌病原体——Batrachochytrium dendrobatidis（Bd），其引发壶菌病。全球范围内，人工保育种群对于受威胁的两栖动物物种至关重要，可能是那些濒临灭绝物种的唯一生存希望。维持无病种群是人工饲养管理者的首要任务，然而目前尚未确定对所有物种及各发育阶段均安全有效的治疗方法。最常用的化学治疗药物是伊曲康唑，但其常用剂量可能对某些个体和物种产生危害。我们开展了一项临床治疗试验，以评估是否可以找到一种更低、更安全但仍然有效的伊曲康唑剂量来治愈Bd感染。研究发现，将治疗浓度从0.01%-0.0025%降低，并将治疗时间从每次5分钟、连续11天缩短至6天，即可在减少副作用和降低治疗相关死亡率的情况下治愈青蛙的Bd感染。

如果治疗结束四周后所有动物的Bd检测结果均为阴性，则认为伊曲康唑治疗成功。在治疗开始前、接种后两周，所有接种Bd的动物均被感染，平均游动孢子负荷量为1,121.7（±17.34）；而在治疗结束四周后，Bd阳性对照组动物的平均游动孢子负荷量为16,765.12（±14643.08）。
使用浓度为0.0025%的伊曲康唑溶液对Incilius nebulifer（n = 15）进行治疗，每天浸泡5分钟，持续6天，取得了成功。该低浓度伊曲康唑治疗组与Bd阳性对照组在死亡率上无显著差异（Cox回归分析：χ2,1 = 2.17，exp(b) = 20,500，p = 0.339）（图1B），许多阳性对照个体在试验结束时仍存活，但伴有Bd感染。
使用0.0025%伊曲康唑药浴治疗11天，以及使用0.005%和0.0025%伊曲康唑治疗6天，均被证实为有效且安全的治疗方案（<st...

Batrachochytrium dendrobatidis 感染两栖动物后，可通过降低伊曲康唑的浓度（0.0025%）并缩短处理时间（每天浸泡5&#160;分钟，持续6天）来清除，该方案所用剂量低于常规方法。采用此改良治疗方案后，观察到更低的死亡率以及更少的不良副作用。

降低伊曲康唑浓度和处理时间在治疗两栖动物蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis）感染中具有显著疗效

两栖动物正经历着所有脊椎动物类群中最严重的种群衰退，其中主要致因之一是一种真菌病原体，壶菌属（Batrachochytrium）……

本实验的总体目标是利用抗真菌化疗药物三唑类药物治疗感染了两栖动物壶菌真菌（Batrachochytrium dendrobatidis，简称 Bd）的两栖动物。首先通过培养 Bd 菌株，并用该真菌病原体接种动物以建立感染；第二步是通过皮肤拭子样本的 DNA 提取和定量 PCR（qPCR）检测，确认动物是否成功感染 Bd。接下来，用0.0025%的克霉唑溶液对感染动物进行每天一次、每次五分钟、持续六天的药浴治疗。最后一步是在完成治疗后，对动物进行至少四周的感染状态监测，通过采集皮肤拭子样本进行QPCR分析，以确认动物是否治愈。本方案表明，使用浓度更低、治疗时间更短的抗真菌药物伊曲康唑，对感染蛙壶菌（bd）的动物仍具有良好的治疗效果。与推荐治疗方案（使用0.01%伊曲康唑溶液连续治疗11天）相比，本方案的主要优势在于：仅使用推荐剂量四分之一的药物浓度，并将治疗时间缩短至六天，依然能够有效清除BD感染，同时显著降低推荐剂量可能带来的不良副作用。按照文本方案所述，在Tritone肉汤中孵育BD并检查游动孢子（Zo spore）活动后，向每个平板中加入5毫升陈化自来水，淹没平板，静置10分钟，使游动孢子（ZO spore）进入培养基。随后，将游动孢子（Zo Spor）悬浮液倒入便携容器中。使用血细胞计数板估算游动孢子（ZO spor）浓度，并用陈化自来水将悬浮液稀释至每3毫升含1×10⁶个游动孢子的浓度，用于接种实验动物，例如此处所示的Latoria vei Alpina。将其置于一个50毫升的容器上方，将三毫升接种液混合物倒在它的腹侧。然后将动物放入容器中，使其接触接种液的流液。盖上容器盖子，将动物在接种容器中放置24小时，以确保感染成功。为防止与 BD 病原体发生污染，应脱去旧手套，并将其放置于待高压灭菌后丢弃。戴上新手套后，继续接种下一个动物。接种24小时后，将动物放回各自已消毒的饲养箱中饲养两周。记住，在处理所有液体废弃物之前，需将其用10%次氯酸钠溶液消毒两周。使用无菌棉签对动物进行拭子取样，以检测蛙壶菌（BD）感染是否成功。在涂抹过程中及两次涂抹之间轻柔旋转棉签。在每侧腹面、每个大腿以及四肢上各涂抹五次，共45次。将棉签置于1.5毫升离心管中，于-20摄氏度保存。使用市售的DNA提取试剂盒从拭子中提取基因组DNA，并按照文本方案进行定量PCR（QPCR）。根据文本方案中所述，准备三个处理浴，分别对应三种剂量的伊曲康唑。随后将个体两栖动物放入已消毒的容器中。使用含有35毫升处理溶液的50毫升罐形容器。在动物之间更换手套，轻轻摇晃容器，确保动物完全浸没，持续五分钟。五分钟后，将动物放回已消毒的区域。每天重复进行五分钟的处理，持续额外五天。治疗结束后一周对动物再次检测 BD 感染情况，并在之后连续四周每周检测一次，以确认感染已彻底清除。需注意，即使治疗已完成，仍应将动物视为具有潜在污染风险并进行相应处理。感染后，动物需要在独立区域饲养至少一个月。如果治疗未成功，则必须重复治疗。不同物种及不同生命阶段对感染和治疗方案的反应各不相同，因此在广泛实施前必须先进行治疗方案的试验。由于蛙壶菌（BD）具有生物危害性，需每周对单个饲养盒进行消毒，将饲养盒及处理容器浸泡于10%的次氯酸钠溶液中至少30秒，随后用清水冲洗两次以去除残留的消毒液，并将容器晾干24小时后方可再次使用，以确保青蛙的存活。此处展示了经过11天或6天蛙壶菌处理的结果。黑色箭头指示治疗的最后一天。实线表示对照组的存活情况。实心黑色线条代表BD检测呈阳性但未接受BD治疗的动物。实线灰色线条代表BD检测阴性且未接受BD治疗的动物。虚线表示接受指定浓度酮康唑治疗组的存活情况。所有接受0.0025%浓度酮康唑雾化治疗6天的动物，在治疗结束4周后BD检测均为阴性，因此该治疗被视为成功。此外，该剂量的益康唑处理与BD阳性对照组相比，在死亡率上无显著差异。需要注意的是，0.01% 和 0.005% 的益康唑处理11天后，与BD阳性对照组相比，死亡率显著升高。请务必注意，真菌病原体BD属于生物危害物，操作时应采取相应的生物安全防护措施，例如佩戴并及时更换手套、对所有固体废弃物进行高压灭菌处理以及消毒等。执行本操作步骤时，必须处理所有液体废弃物。

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免疫学与感染

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