细胞外基质蛋白纳米纤维和纳米结构工程采用表面引发大会
2014年4月17日
A到从单个或多个细胞外基质蛋白得到纳米纤维和纳米结构复杂的方法进行描述。此方法使用蛋白质表面的相互作用与可调的组成和架构，在各种组织工程和生物技术应用创造自由站立蛋白质为基础的材料。
该程序的总体目标是使用表面引发的组装从单个或多个细胞外基质蛋白设计独立的纳米纤维、纳米结构和 2D 基质。这是通过首先准备聚二甲基索烷或 PDMS 印章来实现的，方法是将 PDMS 预聚物倒入具有地形图案的母模上并使其固化。第二步是切下固化的 PDMS 印记，并用含有所需细胞外基质蛋白的溶液包被它们。
接下来，邮票经过清洗、干燥和微接触印刷到聚 N 异丙基丙烯酰胺或管道 PAM 涂层玻璃盖玻片上。最后一步是用 40 摄氏度的温去离子水合盖玻片，并使其逐渐冷却还原溶液。温度低于约 32 摄氏度会触发热敏管道 PAM 层的溶解和组装的蛋白质纳米纤维或纳米结构的释放。
最终，组装的纳米纤维和纳米结构在溶液中是独立的，通过相差和/或荧光显微镜证实，并且可以用于进一步的应用，例如组织工程支架。与现有方法（如面部分离或静电纺丝）相比，该技术的主要优势在于能够使用一种真正模拟细胞通常在体内构建 ECM 纤维的技术来设计 ECM 蛋白纳米纤维。表面引发组装技术具有许多独特的优势，包括能够控制蛋白质组成、纤维形态和支架结构。
此外，我们可以从细胞外基质蛋白（如纤维 nin 层压板和 4 型胶原蛋白）设计 ECM 蛋白纳米纤维，这已被证明使用其他类型的方法很困难。这种方法可以帮助回答组织工程领域的关键问题，使研究人员能够开发具有特定和明确的物理和化学线索的构建体，以指导各种细胞行为，如粘附和分化。如果您不熟悉这项技术，您应该记住不断检查茎的质量以及微接触印刷图案的保真度。
这对于获得 ECM 纳米纤维和纳米结构的正确组装至关重要。要开始此程序，通过将弹性体基体和固化剂以 10 比 1 的重量比混合来制备聚二甲基索烷或 PDMS 预聚物，通常使用 80 克基和 8 克固化剂来确保有足够的 PDMS 覆盖母模一厘米厚的层混合物，并使用向心混合器将 PDMS 设置为以下混合物2000 RPM 持续 2 分钟，DGA 以 2000 RPM 保持 2 分钟。够穷的。
PDMS 预聚物在母模上形成一厘米厚的层，PDMS 在 65 摄氏度下烘烤 4 小时。固化后，用手术刀切出包含图案的区域，形成 PDMS 印章。将特征侧与 PDMS 标记的背面区分开来。
从邮票背面的一个角上切出一个缺口。通过清洁 25 毫米直径的玻璃盖玻片开始此过程，在 95% 乙醇中对盖玻片进行超声处理 1 小时，然后在 65 摄氏度的烘箱中干燥。接下来，准备聚丙烯酰胺和异丙基丙烯酰胺或 piam 溶液，将 piam 溶解在浓度为 10% 的丁醇中，将干净的玻璃盖玻片放在旋转锥的真空吸盘上，然后将 200 微升管道 Pam 溶液移液到玻璃表面以完全覆盖表面。
以6， 000 RPM 的速度旋转盖玻片 1 分钟。通过在 50% 乙醇中超声处理 30 分钟来清洁 PDMS 印记，然后在氮气干燥流下干燥，所有后续步骤均应在生物安全柜中进行，以保持细胞外基质或 ECM 纳米结构将与细胞一起使用的应用中的无菌性。微接触打印步骤是此程序中最困难的方面。
使用前检查 PDMS 印章是否有任何可见的缺陷非常重要。此外，请勿使用超过两周的蛋白质溶液 Place。PIAM 涂层盖可滑入密闭的培养皿中，并使用紫外线照射进行消毒。
在生物安全柜中在紫外线下放置 45 分钟就足够了。用 200 微升蛋白质溶液涂覆每个 PDMS 邮票的图案表面。纤连蛋白或 FN 在此处使用的无菌蒸馏水中浓度为每毫升 50 微克。
在室温下孵育 1 小时，一小时后清洗 PDMS 印章和蒸馏水以去除多余的蛋白质，并在氮气流下彻底干燥。重要的是要完全去除水以避免管道过早溶解。盖玻片上的 Pam 涂层和蛋白质转印不当。
如果需要，通过将 PDMS 印章的特征面与管道 PAM 涂层盖玻片接触来执行微接触打印。使用镊子轻轻敲击印章背面，以去除任何气泡并确保五分钟后均匀接触。从盖玻片上撕下 PDMS 印章。
在这个阶段。根据研究，可以对其他 ECM 蛋白进行图案化，以创建更复杂的多组分结构。打印 ECM 模型后，将图案化管道 PAM 涂层盖玻片放入 35 毫米培养皿中，并使用相差显微镜检查模型保真度。
根据图案的不同，可能需要 CCD 相机来解析图案的特征。荧光显微镜也可用于检查模式，前提是 ECM 蛋白是荧光标记的。验证模型保真度后，向培养皿中加入 3 毫升 40 摄氏度蒸馏水，让水逐渐冷却管道的溶解。
PAM 层和 ECM 蛋白模式的释放可以使用相差显微镜进行监测。通常，为了确保 ECM 蛋白纳米结构得到释放，水被冷却到室温，远低于管道的临界溶液下限温度 pam，即 32 摄氏度。如果应用不允许使用光学技术，则可以通过测量溶液温度来监测释放。
纳米纤维和其他纳米结构在管道 PAM 层释放后将漂浮在水中。对于进一步的应用，需要纵纳米织物和其他纳米结构，但确切的方法将取决于实验目标。这里展示了代表性结果，以证明表面引发组装或 SIA 能够在精确控制纤维尺寸的情况下设计 ECM 蛋白纳米纤维。
将一系列长 50 微米、宽 20 微米的纤连蛋白矩形图案化到 piam 涂层的盖玻片上，加入 40 摄氏度的去离子水，随后冷却到下临界溶液以下。piam 的温度触发 piam 的溶解和释放时丝素蛋白纳米纤维的释放。纤维收缩是因为它们处于固有的预应力下。
当图案化到 piam 表面时，Alice 对纤连蛋白纳米纤维尺寸的分析显示，它们为单分散体，平均长度为 50.19 正负 0.49 微米，平均宽度为 19.98 正负 0.17 微米。释放后，纳米纤维明显收缩，但保持单分散，平均长度为 14.15 正负 0.92 微米，平均宽度为 2.65 正负 0.32 微米。原子力显微镜提供了与 SIA 释放过程相关的纤维尺寸变化的更高分辨率视角。
值得注意的是，释放前纤维的厚度均匀约为 5 纳米，而释放后纤维的厚度约为几百纳米，而长度和宽度有所减少。使用 SIA 工艺，可以设计出各种大小、形状和组成可调的 ECM 蛋白纳米结构。例如，最初宽度为 20 微米、长度为 1 厘米的纤连蛋白纳米纤维被图案化到管道上。
冷却和管道时涂有 PAM 涂层的盖玻片。Pam 溶解后，纳米纤维被释放出来，形成宽度减小了约 3 微米的长线。此外，由于图案由用于微接触印刷的 PDMS 印章的表面形貌定义，因此可以设计复杂的 ECM 蛋白纳米结构作为概念验证。
创建了多臂 Fibroin STARS。热释放导致旋臂收缩，但不是旋臂连接在一起的恒星中心区域收缩。SIA 也适用于其他 ECM 蛋白，如层压蛋白或 LN，并且多种 ECM 蛋白可以掺入同一结构中。
在这个例子中，正交互连的 20 微米宽的纤连蛋白线（红色显示）和 50 微米宽的层粘连蛋白线（绿色显示）集成到 2D 纳米织物中，然后在释放时释放两种类型的纳米纤维收缩，但整体互连性和方形晶格结构保持不变。这些结果表明，SIA 可用于设计具有各种成分和结构的 ECM 材料。最后，显示了 ECM 纳米纤维 SIA 失败的一些实例。
一个原因是由于 ECM 蛋白向 piam 表面的转移不良，导致不完整模式的释放不当。在微接触打印过程中，孔洞、不规则边缘和其他缺陷的存在将产生不完整的纳米纤维和纳米结构，释放时容易断裂和碎裂。管道 PAM 的快速溶解也会导致释放后模型保真度不佳。
例如，使用 20 摄氏度的水，温度已经低于临界下解。piam 的温度会导致 piam 迅速膨胀和溶解。这会导致纳米纤维弹回和断裂，如第 32 张图所示，并形成随机的无序配置，如 52 秒图所示。
在开始此过程之前，PDMS 的状况会阻止缺陷，并确保所有表面都没有灰尘。否则，它会阻止正确的蛋白质转移并导致 A CM 结构组装不良。因此，按照此程序，释放纳米纤维或纳米结构可用于做许多事情，例如分析蛋白质纤维的机械特性，或用作组织工程的支架。
观看此视频后，您应该对如何设计具有可调整成分、几何形状和结构的 ECM 蛋白纳米纤维和纳米结构有很好的了解。具体来说，您应该了解如何将 ECM 蛋白的微接触打印图案贴在 python 涂层的玻璃盖玻片上，然后热触发表面的溶解以组装 ECM 结构。
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概述
本文描述了一种从细胞外基质蛋白制造自由支撑纳米纤维和复杂纳米结构的方法。该技术利用表面引发的组装来创建适合组织工程和生物技术应用的材料。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物技术
- 组织工程
- 纳米技术
背景
- 细胞外基质蛋白在组织结构和功能中起着至关重要的作用。
- 纳米纤维和纳米结构可以模仿自然的组织环境。
- 表面引发的组装是一种允许对材料性质进行精确控制的技术。
- 创建自由支撑的蛋白质基材料可以增强其在各个领域的应用。
研究目的
- 开发一种从细胞外基质蛋白制造纳米纤维和纳米结构的方法。
- 利用蛋白质-表面相互作用进行材料设计。
- 探索在组织工程和生物技术中的应用。
使用的方法
- 从图案化的母模具制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章。
- 用细胞外基质蛋白溶液涂覆PDMS印章。
- 在聚N-异丙基丙烯酰胺（PIPAAm）涂层玻璃载玻片上进行微接触印刷。
- 水化和冷却载玻片以触发组装的纳米结构的释放。
主要结果
- 成功创建自由支撑的蛋白质基纳米纤维和纳米结构。
- 展示了材料组成和结构的可调性。
- 在组织工程和生物技术的各个领域中的潜在应用。
- 通过实验结果验证了该方法。
结论
- 该方法提供了一种工程化蛋白质基材料的多功能方法。
- 表面引发的组装对于创建复杂的纳米结构是有效的。
- 这些材料在推进组织工程应用方面具有重大潜力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Engineering extracellular matrix (ECM) protein nanofibers and nanostructures with precise control over composition, geometry, and architecture enables biopharma R&D to recapitulate native tissue microenvironments for predictive modeling. This capability supports target validation and phenotypic screening by providing disease-relevant systems that modulate cellular adhesion, differentiation, and apoptosis. Surface-initiated assembly (SIA) offers a mechanistic de-risking approach to generate tunable ECM materials for preclinical model development and translational biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled presentation of ECM proteins to assess target engagement and pathway modulation.
- Operational Value: Provides reproducible, well-defined nanostructures to reduce biological variability in early-stage target validation assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized ECM nanofiber substrates for quantitative phenotypic screening of compound effects on cell behavior.
- Operational Value: Supports assay standardization and scalability via microcontact printing of defined protein patterns for high-throughput applications.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system engineering by incorporating multi-component ECM proteins (fibronectin, laminin, fibrinogen, collagens I/IV) to mimic tissue-specific microenvironments.
- Operational Value: Enables predictive confidence in preclinical model selection through tunable scaffold architecture that directs cellular responses.
Pipeline & Workflow Integration
Surface-initiated assembly integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical research by providing tunable ECM materials that inform lead identification and risk-adjusted advancement decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise control over ECM protein composition and nanostructure geometry to probe mechanotransduction signaling.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible nanofiber arrays with quantifiable dimensional outputs for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides measurable fiber dimensions (length, width, thickness) and release kinetics as quantitative readouts to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through engineered ECM nanostructures that maintain structural integrity and support longitudinal cellular studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for generating custom ECM nanostructures across multiple projects, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through biomimetic ECM presentation that reduces mechanistic ambiguity in cellular response interpretation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via surface-initiated assembly protocol and microcontact printing fidelity controls.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by enabling early assessment of compound effects on cell adhesion, differentiation, and apoptosis in physiologically relevant contexts.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of leads based on performance in disease-relevant ECM nanostructure models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein surface chemistry, microcontact printing, and thermally responsive polymer handling.
- Depends on instrumentation for PDMS stamp fabrication, spin coating, and environmental control during thermal release.
- Necessitates cross-team standardization of protein solution preparation, stamp cleaning, and pattern inspection to ensure fidelity.
- Involves adaptation considerations when extending to different ECM proteins or multi-component nanostructures.
- Practical limitations include sensitivity to protein solution age, stamp defects, and temperature control during PIPAAm dissolution affecting nanostructure integrity.
