利用表面引发组装技术构建的细胞外基质蛋白纳米纤维与纳米结构

本实验的总体目标是利用表面引发组装技术，由一种或多种细胞外基质蛋白构建自支撑的纳米纤维、纳米结构和二维基质。该过程首先将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物倒入具有拓扑图案的主模具中，固化后制备出PDMS印章。第二步是将固化的PDMS印章切割成所需形状，并将其浸入含有目标细胞外基质蛋白的溶液中进行涂层处理。

接下来，将印章清洗、干燥，并通过微接触印刷技术将其印至涂有聚-N-异丙基丙烯酰胺（poly N-isopropyl acrylamide，简称 pNIPAM）的玻璃盖玻片上。最后一步是用40摄氏度的温热去离子水水合盖玻片，并使其逐渐冷却，从而降低溶液温度。当温度降至约32摄氏度以下时，会触发对温度敏感的 pNIPAM 层溶解，进而释放已组装的蛋白质纳米纤维或纳米结构。

最终，组装形成的纳米纤维和纳米结构在溶液中呈游离状态，可通过相差显微镜和/或荧光显微镜确认，并可用于组织工程支架等进一步应用。与现有的相分离或静电纺丝等方法相比，该技术的主要优势在于能够采用一种真正模拟细胞在体内正常构建细胞外基质（ECM）纤维的方式，来设计ECM蛋白纳米纤维。表面引发的组装技术具有多项独特优势，包括能够调控蛋白质组成、纤维形态以及支架结构。

此外，我们可以利用细胞外基质蛋白（如纤连蛋白和IV型胶原蛋白）来构建ECM蛋白纳米纤维，而使用其他方法实现这一目标已被证明较为困难。该方法有助于回答组织工程领域的关键科学问题，使研究人员能够开发出具有特定且明确定义的物理和化学信号的支架结构，从而调控多种细胞行为，如细胞黏附和分化。如果您初次使用该技术，务必持续检查干细胞的质量以及微接触印刷图案的准确性。

这是获得细胞外基质（ECM）纳米纤维和纳米结构正确组装的关键步骤。开始此操作时，通过将弹性体基础剂与固化剂按10:1的质量比混合，制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物；通常使用80克基础剂和8克固化剂，以确保有足够的PDMS形成厚度为1厘米的覆盖层，完全覆盖母模。使用设定为以下参数的离心混合器混合PDMS：在2000 RPM下混合2分钟，再在2000 RPM下脱气2分钟。混合充分即可。

在此处的母模上涂布PDMS预聚物，形成一厘米厚的层，然后在65摄氏度下烘烤4小时以固化PDMS。固化后，使用手术刀切割出含有图案的区域，制成PDMS印章。为区分PDMS印章的特征面与背面。

在印章背面的一个角上切出一个缺口。开始此操作时，先清洗直径为25毫米的玻璃盖玻片，将盖玻片在95%乙醇中进行超声处理1小时，然后在65°C的烘箱中干燥。接下来，制备聚异丙基丙烯酰胺（piam）溶液：将piam溶于正丁醇中，浓度为10%。将一块洁净的玻璃盖玻片置于旋涂仪的真空吸盘中央，用移液器吸取200 µL piam溶液滴加到玻璃表面，确保完全覆盖整个表面。

以6,000 RPM转速旋涂盖玻片1分钟。将PDMS印章在50%乙醇中进行超声清洗30分钟，随后在氮气流下干燥。所有后续操作均应在生物安全柜中进行，以确保在细胞将与细胞外基质（ECM）纳米结构共同使用时保持无菌状态。微接触印刷步骤是本实验流程中最困难的部分。

使用前需检查PDMS印章是否存在任何可见缺陷。此外，不要使用存放超过两周的蛋白质溶液。将PIAM包被的盖玻片放入封闭的培养皿中，并通过紫外照射进行灭菌。

在生物安全柜中的紫外灯下照射45分钟即可。将每块PDMS印章的图案面涂覆200微升蛋白溶液。此处使用纤维连接蛋白（Fibronectin或FN），其浓度为50微克/毫升，溶剂为无菌蒸馏水。

室温孵育一小时后，用蒸馏水洗涤PDMS印章以去除多余的蛋白质，并在氮气流下彻底干燥。必须完全去除水分，以避免管道过早溶解，以及盖玻片上的Pam涂层和蛋白质转移不当。

如有需要，将PDMS印章的特征面与涂有PAM的盖玻片管道接触，进行微接触印刷。使用镊子轻轻敲击印章背面，以去除任何气泡，并在五分钟后确保接触均匀。从盖玻片上剥离PDMS印章。

在此阶段，根据研究需要，可对其他细胞外基质（ECM）蛋白进行图案化，以构建更复杂、多组分的结构。ECM图案打印完成后，将带有图案化的PAM涂层盖玻片放入35毫米的培养皿中，并使用相差显微镜检查图案的保真度。

根据图案的不同，可能需要使用CCD相机来分辨图案的特征。如果细胞外基质蛋白带有荧光标记，也可使用荧光显微镜检查图案。在确认图案保真度后，向培养皿中加入3 mL 40°C的蒸馏水，并让水逐渐冷却以溶解凝胶管。

可以使用相差显微镜监测PAM层以及细胞外基质（ECM）蛋白图案的释放。通常，为了确保ECM蛋白纳米结构已被释放，需将水冷却至远低于PAM的低临界溶解温度（32摄氏度）的室温。如果应用条件不允许使用光学技术，则可通过测量溶液温度来监测释放过程。

在释放管状 PAM 层后，纳米纤维和其他纳米结构将悬浮于水中。对于进一步的应用，需要对纳米织物和其他纳米结构进行操控，但具体方法将取决于实验目的。本文展示了代表性结果，以证明表面引发组装（SIA）能够精确调控细胞外基质（ECM）蛋白纳米纤维的纤维尺寸，实现纳米纤维的可编程构建。

将长度为 50 微米、宽度为 20 微米的纤维连接蛋白矩形阵列图案化于 PIAm 涂层的盖玻片上，加入 40 摄氏度的去离子水，随后冷却至 PIAm 的低临界溶解温度以下。温度降低触发了 PIAm 的溶解，从而释放出丝素蛋白纳米纤维。纤维在释放后因自身固有的预应力而发生收缩。

当将纤维连接蛋白纳米纤维图案化到piam表面时，释放前对其进行Alice分析显示，这些纳米纤维呈单一分散状态，平均长度为50.19 ± 0.49微米，平均宽度为19.98 ± 0.17微米。释放后，纳米纤维显著收缩，但仍保持单一分散状态，平均长度为14.15 ± 0.92微米，平均宽度为2.65 ± 0.32微米。原子力显微镜为与SIA释放过程相关的纤维尺寸变化提供了更高分辨率的观察视角。

值得注意的是，释放前的纤维具有约五纳米的均匀厚度，而释放后的纤维厚度达到数百纳米量级，同时长度和宽度减小。利用SIA工艺，可制备多种具有可调尺寸、形状和成分的ECM蛋白纳米结构。例如，可将初始宽度为20微米、长度为1厘米的纤连蛋白纳米纤维图案化至管道表面。

冷却并拔出PAM包被的盖玻片后，PAM溶解，纳米纤维被释放，形成宽度减小至约三微米的长丝。此外，由于图案由用于微接触印刷的PDMS印章的表面形貌决定，因此可构建复杂的细胞外基质蛋白纳米结构，以验证该方法的可行性。

制备了多臂状丝素蛋白星形结构。热释放导致臂部收缩，但星形中心区域（即臂连接处）未发生收缩。SIA 技术也可用于其他细胞外基质蛋白（如层粘连蛋白或 LN），并且可将多种细胞外基质蛋白整合到同一结构中。

在此示例中，红色显示的20微米宽纤连蛋白正交互连线条与绿色显示的50微米宽层粘连蛋白线条被整合到二维纳米织物中，形成图案。释放后，两类纳米纤维均发生收缩，但整体互连性及方形晶格结构得以保持。这些结果表明，SIA可用于构建具有多种成分和结构的细胞外基质（ECM）材料。最后，展示了一些ECM纳米纤维SIA失败的实例。

其中一个原因是由于细胞外基质蛋白向PAM表面转移不充分，导致不完整图案的错误释放。在微接触印刷过程中，孔洞、不规则边缘及其他缺陷的出现会产生不完整且易于在释放时断裂和碎裂的纳米纤维和纳米结构。PAM的快速溶解也可能导致释放后图案保真度降低。

例如，使用20摄氏度的水（该温度已低于piam的低临界溶解温度），将导致piam迅速溶胀并溶解。这会使纳米纤维如第32秒图像所示发生回缩和断裂，并如第52秒图像所示形成随机且无序的结构。

在开始此操作之前，需检查PDMS茎是否存在缺陷，并确保所有表面无灰尘。否则，将会影响蛋白质的正常转移，并导致ACM结构组装不良。完成此操作后，所获得的纳米纤维或纳米结构可用于多种用途，例如分析蛋白质纤维的力学性能，或作为组织工程中的支架材料。

观看本视频后，您应充分了解如何制备具有可调控成分、几何形状和结构的细胞外基质（ECM）蛋白纳米纤维及纳米结构。具体而言，您将掌握如何将细胞外基质蛋白微接触印刷到涂有聚苯乙烯的玻璃盖玻片上，随后通过热诱导使表面溶解，从而组装形成细胞外基质结构。