Name: 自下而上和猎枪蛋白质组学鉴定一个全面的蛋白质组耳蜗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 学习使用自下而上和猎枪蛋白质组学技术鉴定小鼠耳蜗感觉上皮中的膜蛋白和可溶性蛋白。该方法结合多种消化策略与高效液相色谱分离，显著提高了蛋白质鉴定数量，为听觉机制研究提供了全面的蛋白质组数据。

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作者感谢南佛罗里达大学药物发现与创新中心（CDDI）蛋白质组学核心设施主任 Kent Seeley 博士提供该设施的使用支持。本研究由美国国立卫生研究院/国家耳聋与其他沟通障碍研究所（NIH/NIDCD）资助项目 R01 DC004295（资助对象：B.H.A.S.）支持。

伦理声明
使用小鼠组织的实验已获得南佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（批准编号：3931R、3482R）的批准，该批准依据美国国立卫生研究院指南制定。
1. 蛋白质提取
<ol>
	<li>从16只30日龄（P30）的CBA/J小鼠中分离耳蜗感觉上皮组织，并于-80 °C保存。</li>
	<li>实验当天，用500 µl 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤组织，1,000 × g离心3分钟，弃去上清液。重复洗涤共三次。</li>
	<li>将组织置于冰上，加入100 μl裂解缓冲液（含50 mM Tris-HCl，pH 8.0，120 mM NaCl，50 mM NaF，5 mM EDTA，500 μg/ml AEBSF，10 μg/ml亮抑酶肽，100 μg/ml胃蛋白酶抑制剂，2 μg/ml抑肽酶，0.5 μg/ml微囊藻毒素），使用超声破碎仪（Model 100；Thermo Fisher）超声处理30秒。每次超声后在冰上冷却1分钟，共重复超声3次。</li>
	<li>将裂解物在4 °C、750 × g条件下离心2分钟，将上清液转移至新的微量离心管中。向沉淀中加入50 μl裂解缓冲液，在冰上超声处理30秒进行再次提取。再次于4 °C、750 × g离心2分钟。合并两次获得的上清液，在4 °C、28,600 × g条件下离心60分钟。将上清液转移至新的微量离心管中，向沉淀中加入含0.1% ASB-14的20 μl裂解缓冲液，涡旋混匀1分钟，4 °C孵育60分钟。</li>
	<li>将样品于95 °C加热5分钟，随后在4 °C冷却60分钟。接着在25 °C、16,000 × g条件下离心10分钟。收集上清液并转移至新管中。</li>
	<li>将悬液在4 °C、16,000 × g条件下离心5分钟，保留上清液用于后续消化。</li>
</ol>
2. 采用FASP法对全裂解液进行双重胰蛋白酶蛋白质消化
<ol>
	<li>将30 μl等分试样（≤400 μg）耳蜗蛋白提取物（含4%十二烷基硫酸钠（SDS）、100 mM Tris-HCl（pH 7.6）和0.1 M二硫苏糖醇（DTT））直接加入30K离心过滤管中，并与200 μl含8 M尿素的Tris-HCl溶液混合。在14,000 × g条件下离心15分钟。</li>
	<li>用200 μl 8 M尿素溶液稀释浓缩物，并在14,000 × g条件下离心15分钟。</li>
	<li>向滤膜中的浓缩物加入10 µl 10倍浓度的碘乙酰胺（IAA）8 M尿素溶液，涡旋混匀1分钟。将离心过滤管置于室温（RT）避光孵育20分钟，随后在14,000 × g条件下离心10分钟。</li>
	<li>向滤膜装置中加入100 µl 8 M尿素溶液，并在14,000 × g条件下离心15分钟。重复此步骤2次。向滤膜装置中加入100 μl 50 mM碳酸氢铵（ABC）溶液，并在14,000 × g条件下离心10分钟。重复此步骤2次。</li>
	<li>按1:100（w/w）的酶与蛋白比例加入0.4 μg/μl胰蛋白酶，于37 °C过夜（O/N）孵育。</li>
	<li>孵育结束后，向滤膜装置中加入40 μl 50 mM ABC溶液，并在14,000 × g条件下离心10分钟。重复此步骤1次。</li>
	<li>向离心过滤管中加入50 μl 0.5 M NaCl溶液，并在14,000 × g条件下离心10分钟。将含有胰蛋白酶肽段的滤液转移至新的微量离心管中，并用甲酸（FA）酸化至终浓度1.0%，以终止消化反应。</li>
	<li>用40 µl 8 M尿素洗涤滤膜装置，随后用40 µl 18 MΩ水洗涤2次。</li>
	<li>用100 μl 50 mM ABC溶液洗涤滤膜装置3次。最后一次洗涤后，按1:100（w/w）的酶与蛋白比例加入0.4 μg/μl胰蛋白酶，于37 °C过夜（O/N）孵育。</li>
	<li>通过向滤膜装置中加入40 μl 50 mM ABC溶液并以14,000 × g离心10分钟，洗脱第二次消化产生的胰蛋白酶肽段。重复此步骤1次。</li>
	<li>向滤膜装置中加入50 μl 0.5 M NaCl溶液，并在14,000 × g条件下离心10分钟。将含有胰蛋白酶肽段的滤液转移至新的微量离心管中，并用FA酸化至1.0%。</li>
	<li>可使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准品，通过微孔板比色法对样品进行定量。</li>
</ol>
3. 使用 FASP 法对全裂解液进行内切蛋白酶 LysC 和胰蛋白酶消化
<ol>
	<li>将30 μl（≤400 μg）含有4% SDS、100 mM Tris-HCl（pH 7.6）和0.1 M DTT的耳蜗蛋白提取物直接加入30K离心过滤管中，并与200 μl含8 M尿素的Tris-HCl溶液混合。在14,000 × g条件下离心15分钟。</li>
	<li>用200 μl 8 M尿素溶液稀释浓缩物，并在14,000 × g条件下离心15分钟。</li>
	<li>向滤膜上的浓缩物中加入10 μl溶于8 M尿素溶液中的10倍浓度IAA，涡旋混匀1分钟。将离心过滤管置于室温避光条件下孵育20分钟，然后在14,000 × g条件下离心10分钟。</li>
	<li>向滤膜装置中加入100 μl 8 M尿素溶液，并在14,000 × g条件下离心15分钟。重复此步骤两次。向滤膜装置中加入100 μl 100 mM ABC溶液，并在14,000 × g条件下离心10分钟。重复此步骤两次。</li>
	<li>按1:50（w/w）的酶与蛋白比例加入终浓度为0.1 μg/μl的内切蛋白酶LysC，并在30 °C下过夜孵育。</li>
	<li>孵育结束后，向滤膜装置中加入40 μl 100 mM ABC溶液，并在14,000 × g条件下离心10分钟。重复此步骤一次。</li>
	<li>向离心过滤管中加入50 μl 0.5 M NaCl溶液，并在14,000 × g条件下离心10分钟。将含有LysC肽段的滤液转移至新的微量离心管中，并用甲酸（FA）酸化至终浓度1.0%，以终止消化反应。</li>
	<li>用40 μl 8 M尿素溶液洗涤滤膜装置，随后用40 μl 18 MΩ水洗涤两次。</li>
	<li>用100 μl 50 mM ABC溶液洗涤滤膜装置三次。最后一次洗涤后，按1:100的酶与蛋白比例加入终浓度为0.4 μg/μl的胰蛋白酶，在37 °C下过夜孵育。</li>
	<li>向滤膜装置中加入40 μl 50 mM ABC溶液，以洗脱胰蛋白酶肽段，并在14,000 × g条件下离心10分钟。重复此步骤一次。</li>
	<li>向滤膜装置中加入50 μl 0.5 M NaCl溶液，并在14,000 × g条件下离心10分钟。将含有胰蛋白酶肽段的滤液转移至新的微量离心管中，并用1.0%甲酸（FA）酸化。</li>
	<li>可使用以BSA为标准品的微孔板比色法对样品进行定量。</li>
</ol>
4. 使用离心柱对肽段进行脱盐
<ol>
	<li>激活 C18 MacroSpin 柱&#160;加入500 µl乙腈（ACN），在1,100 x g条件下离心1分钟。离心后弃去滤液。</li>
	<li>用 500 μl 的 0.1% FA 平衡柱子，在 1,100 x g 条件下离心 1 分钟。弃去穿流液，重复此步骤 1 次。</li>
	<li>加入最多 500 μl 肽段消化液至柱中，于 1,100 × g 离心 1 分钟。若样品体积超过 500 μl，则重复此步骤。</li>
	<li>用500 μl的0.1% FA洗涤柱子，在1,100 × g下离心1分钟，弃去穿流液。重复此步骤1次。</li>
	<li>向柱中加入250 µl体积比为90:10的乙腈-水溶液，在1,100 × g离心1分钟。收集含有脱盐肽段的洗脱液，并转移至新的微量离心管中。重复此步骤1次。</li>
	<li>在真空离心浓缩仪中干燥脱盐后的肽样品，并避免让样品完全干涸。</li>
</ol>
5. 离子交换色谱
<ol>
	<li>将50-100 μg的消化后蛋白样品注入200 x 2.1 mm、5 μm SCX色谱柱（Polysulfoethyl A）以分离肽段。</li>
	<li>使用流动相B在50分钟内从2%线性梯度升至40%，流速为250 μl/min。流动相A为含25%乙腈和75% ddH2O的5 mM甲酸铵溶液（pH 3.0）；流动相B为含25%乙腈和75% ddH2O的500 mM甲酸铵溶液（pH 6.0）。</li>
	<li>在280 nm波长下监测肽段洗脱组分，并使用组分收集器每2分钟收集一次组分。</li>
	<li>在真空浓缩仪中干燥各组分，然后重悬于500 μl含5%甲酸的ddH2O/50%乙腈溶液中，以促进盐分去除。</li>
	<li>再次干燥组分，并在-80 °C保存，直至用于纳米液相色谱-串联质谱（nano LC-MS/MS）分析。</li>
</ol>
6. 丙酮沉淀
在进行GELFrEE分离之前，耳蜗蛋白上清液必须进行脱盐处理。可以采用丙酮沉淀法对蛋白质进行脱盐和浓缩。
<ol>
	<li>向耳蜗上清液中加入三倍体积的预冷丙酮。轻轻涡旋混匀，并在 -20 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 15,000 × g 离心 15 分钟，去除上清液。</li>
	<li>用预冷的丙酮洗涤蛋白沉淀 3 次，每次在 4 °C 条件下以 14,000 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将沉淀空气干燥，并溶于 112 μl 的 18 MΩ 水中。</li>
	<li>使用微孔板比色法测定蛋白浓度。</li>
</ol>
7. 耳蜗感觉上皮的GELFrEE分离技术
<ol>
	<li>向悬浮于 112 μl 18 MΩ 水中的脱盐蛋白中加入 30 μl 5x 上样缓冲液（0.25 M Tris-HCl pH 6.8，10% (w/v) SDS，50% 甘油，0.5% (w/v) 溴酚蓝）。</li>
	<li>加入 8 μl 1 M DTT，在 95 °C 下加热 5 分钟以还原蛋白质二硫键。加热后置于室温冷却。</li>
	<li>向阳极储液槽中加入 8 ml 电泳缓冲液，向样品收集室中加入 150 μl 电泳缓冲液，向阴极储液槽中加入 6 ml 电泳缓冲液。</li>
	<li>使用移液器移除可能流入样品加样室的缓冲液。</li>
	<li>使用分子量范围为 3.5–150 kDa 的 8% Tris-乙酸盐分离柱，将 150 μl（≤1 mg）耳蜗蛋白混合物加入样品加样室。</li>
	<li>放下电极并关闭仪器盖，开始电泳运行。</li>
	<li>当仪器首次暂停时，向阴极储液槽中加入 2 ml 电泳缓冲液，然后继续运行。</li>
	<li>在仪器每次暂停期间，使用移液器从样品收集室中收集样品，并转移至新标记的微量离心管中；用 150 μl 电泳缓冲液清洗收集室两次，并弃去洗液。</li>
	<li>向样品收集室中加入 150 μl 新鲜电泳缓冲液，继续运行。在 2.6 小时内收集蛋白组分，每管收集体积为 150 μl/组分。</li>
</ol>
8. GELFrEE 组分的一维凝胶电泳
在一维凝胶电泳可用于在酶解和质谱分析之前观察GELFrEE分级分离的结果。GELFrEE蛋白质组分可在4-15% Tris-HCl凝胶上进行分离。
<ol>
	<li>取每份GELFrEE组分5 μl，与5 µl样品稀释缓冲液（含350 mM DTT的样品缓冲液）混合。</li>
	<li>将样品在95 °C加热3分钟。</li>
	<li>将样品冷却至室温。</li>
	<li>将每份GELFrEE组分各10 μl加样至凝胶的独立泳道中，并在最后一个未使用的泳道中加入5 μl分子量标准品。</li>
	<li>以125 V电压电泳1.5小时，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。</li>
	<li>小心取出凝胶，使用Silver Stain Plus染色以显示蛋白质分离情况。</li>
</ol>
9. 使用 FASP 对 GELFrEE 组分进行蛋白质消化
采用改良的FASP方法去除去垢剂并消化GELFrEE组分。
<ol>
	<li>将每个单独的组分直接加入一个30K滤膜装置中；加入200 μl含8 M尿素的Tris-HCl溶液混匀，于14,000 × g离心25 min。</li>
	<li>用200 μl尿素溶液稀释浓缩物，于14,000 × g离心12 min。重复此步骤1次。</li>
	<li>向每个滤膜装置中的浓缩物中加入10 μl含10×IAA的尿素溶液，涡旋混匀1 min，并在室温避光孵育30 min。</li>
	<li>向滤膜装置中的浓缩物中加入100 μl尿素溶液，于14,000 × g离心15 min。重复此步骤2次。向滤膜装置中加入100 μl 100 mM ABC溶液，于14,000 × g离心10 min。重复此步骤2次。</li>
	<li>向滤膜装置中加入LysC酶，终浓度为0.1 μg/μl，酶与蛋白质质量比为1:50（w/w），于30 °C过夜孵育。</li>
	<li>孵育结束后，向离心滤膜中加入40 μl 100 mM ABC溶液，于14,000 × g离心10 min。重复此步骤1次。</li>
	<li>向离心滤膜中加入50 μl 0.5 M NaCl溶液，于14,000 × g离心10 min。将含有LysC肽段的滤出液从每个离心滤膜转移至新的微量离心管中，并用三氟乙酸（TFA）酸化。</li>
	<li>用40 μl 8 M尿素溶液洗涤离心滤膜，随后用40 μl 18 MΩ水洗涤2次。</li>
	<li>用100 μl 50 mM ABC溶液洗涤离心滤膜3次。最后一次洗涤后，加入胰蛋白酶，终浓度为0.4 μg/μl，酶与蛋白质质量比为1:100（w/w），于37 °C过夜孵育。</li>
	<li>向每个滤膜装置中加入40 μl 50 mM ABC溶液，以洗脱胰蛋白酶解肽段，于14,000 × g离心10 min。重复此步骤1次。</li>
	<li>向滤膜装置中加入50 μl 0.5 M NaCl溶液，于14,000 × g离心10 min。将含有胰蛋白酶解肽段的滤出液从每个滤膜装置转移至新的微量离心管中，并用TFA酸化。</li>
	<li>将所有酶解产物在真空浓缩仪中干燥。</li>
</ol>
10. LC-MS/MS 样品制备
<ol>
	<li>用 20 µl 含 0.1% 甲酸的溶液重悬干燥的 LysC 和胰蛋白酶肽段消化产物，并涡旋混匀。</li>
	<li>在 20,000 × g 离心 10 分钟，转移上清液的前 95% 至新的样品瓶中。</li>
	<li>将每份肽段样品 5 µl 上样至 100 μm × 25 mm 的捕获柱，以去除盐分和杂质，并在 75 μm × 10 cm 的 C18 柱上进行色谱分离。</li>
	<li>采用流速为 200 nl/min 的流动相梯度洗脱，其中 B 相从 2% 升至 40%，历时 100 分钟。A 相为含 0.1% 甲酸的 95% 去离子水和 5% 乙腈；B 相为含 0.1% 甲酸的 80% 乙腈和 20% 去离子水。</li>
	<li>在高分辨质谱仪上对每次 MS 扫描采集十个串联质谱图。本实验使用了 LTQ Orbitrap 质谱仪。</li>
</ol>
11. 蛋白质鉴定
<ol>
	<li>使用包含正向和反向蛋白质序列以及常见污染物的 UniProt 小鼠数据库鉴定蛋白质。采用 MaxQuant&#160;软件结合 MASCOT 搜索引擎对蛋白质数据库进行搜索。</li>
	<li>可使用的搜索参数包括：半胱氨酸的羧甲基化作为固定修饰，甲硫氨酸的氧化、蛋白质N端乙酰化作为可变修饰，最大漏切位点数为2。用于鉴定的肽段最小长度为6个氨基酸。 输入肽段质量浓度误差为±8 ppm，碎片离子质量容差为1.2 Da（质量误差取决于所使用的质谱仪）。</li>
	<li>在 MaxQuant 软件中，设定肽段和蛋白质鉴定的错误发现率（FDR）为1%。蛋白质鉴定结果将列出匹配的肽段数量、蛋白质序列覆盖百分比以及肽段序列。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

从耳蜗感觉上皮中最大化蛋白质鉴定的关键步骤包括：1）使用多种内切蛋白酶进行消化，2）采用多种分离技术，3）利用高分辨率质谱仪。应用多种酶可增加肽段数量并提高蛋白质序列覆盖度，从而提升从耳蜗组织中鉴定出的蛋白质数量。胰蛋白酶是最常用的蛋白酶，能够高效且特异性地切割蛋白质，生成适合质谱电离和碎裂的肽段。然而，在胰蛋白酶消化之前使用另一种酶（如同样切割赖氨酸残基的LysC），可实现更高效的肽段切割。研究发现，与胰蛋白酶/胰蛋白酶消化相比，LysC/胰蛋白酶消化所产生的蛋白质序列覆盖度有所提高。
在质谱分析前采用多维分离方法，降低了 shotgun 蛋白质组学方法中耳蜗样本的高度复杂性。这使得能够鉴定出更多蛋白质，包括通常难以鉴定的膜蛋白。与自下而上（bottom-up）方法相比，shotgun 方法鉴定出的膜蛋白数量更多。然而，采用 GELFrEE 的自下而上方法能够鉴定出更多低丰度蛋白质，这归因于高丰度蛋白质（如来自耳蜗的 cochlin）被分离到各个组分中而得以富集。
本方案中采用高分辨率质谱仪（如LTQ-Orbitrap）所获...

蛋白质组学是通过分析蛋白质的表达、功能、修饰及相互作用来研究复杂生物系统的学科1。已有多种方法被用于内耳的蛋白质组分析，包括抗体微阵列2、二维凝胶电泳3-5和差异凝胶电泳（DIGE）6。然而，与在内耳中已鉴定出的超过10,000个基因和表达序列标签（ESTs）相比11,12，已被识别和表征的蛋白质数量仍然有限2,7-10。质谱（MS）是蛋白质组学中用于蛋白质表征最常用且最全面的技术。对复杂的蛋白质组样本（如耳蜗）进行分析具有挑战性。然而，将多种分离技术与质谱联用，可因提高动态浓度范围和峰容量而实现更多肽段和蛋白质的鉴定13。多维色谱通过采用不同的吸附机制，可降低高度复杂蛋白混合物的复杂性。目前常用的质谱蛋白质组分析方法主要有两种：鸟枪法（shotgun）和自下而上法（bottom-up）蛋白质组学。在鸟枪法蛋白质组学中，将完整的蛋白质混合物进行酶解消化，随后利用多维色谱进行分离，通常先采用强阳离子交换色谱（SCX），再进行反相液相色谱（RPLC）14,15。分离后的肽段经串联质谱分析并进行数据库搜索15。该技术的主要优势在于单次分析即可鉴定数千种蛋白质，且更适用于膜蛋白的研究。
在自下而上的方法中，通常通过一维或二维电泳分离蛋白质混合物，然后将单个蛋白质条带或斑点切下，并用胰蛋白酶等酶进行消化，通常产生多个肽段。然而，近年来在自下而上蛋白质组学中发展出另一种电泳方法——GELFrEE。该技术在液相中对蛋白质样品进行分级分离，从而在分析前降低其复杂性。该方法具有良好的可重复性、较高的蛋白质回收率，并能减少复杂蛋白质样品中高丰度蛋白质的分布16。由分离后的蛋白质产生的肽段通过质谱（MS）进行分析，采用肽质量指纹图谱或串联质谱（MS/MS）生成用于数据库搜索的序列标签17-19。采用自下而上方法的一些主要优势在于能够实现高分辨率分离和全面的蛋白质覆盖。自下而上蛋白质组学是目前蛋白质组学研究中最广泛使用的技术20，因此已有多种生物信息学工具可供使用。此外，在消化前可对复杂混合物中的蛋白质进行分离，从而提高蛋白质鉴定的概率。
利用内耳进行蛋白质组学分析的主要挑战之一在于其体积微小、获取困难以及细胞类型的多样性21。此外，决定其功能的关键蛋白质（如离子通道、转运蛋白和受体）属于膜蛋白，而这类蛋白的分离通常较为困难22。因此，滤膜辅助样品制备法（FASP）在蛋白质提取量有限且需要使用去垢剂溶解膜结构的组织蛋白质组学分析中具有显著优势23。该过滤技术可实现膜蛋白和可溶性蛋白的质谱分析，并能将肽段与低分子量污染物有效分离23,24。
本方案描述了常用的蛋白质组学方法，这些方法经过组合和改进，用于分析耳蜗感觉上皮中的可溶性蛋白和膜蛋白，并最大限度地增加蛋白质鉴定数量。我们将介绍采用 shotgun 蛋白质组学结合 FASP 多酶消化、离子交换色谱、高分辨率质谱及数据分析的方法。此外，我们还将介绍基于 GELFrEE、FASP 多酶消化、高分辨率质谱及数据分析的自下而上（bottom-up）蛋白质组学方法。

<table><tbody><tr><td>8% Tris-乙酸胶条&amp;nbsp;</td><td>蛋白质发现</td><td>42103</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>霍尼韦尔</td><td>015-1L</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF</td><td>Calbiochem</td><td>101500</td><td></td></tr><tr><td>甲酸铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC16861</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Calbiochem</td><td>616370</td><td></td></tr><tr><td>ASB-14&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>182750-5GM</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; 柱&amp;nbsp;</td><td>新目标</td><td>A25112</td><td>75 &amp;mu;m × 10 cm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DC蛋白质定量测定</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>500-0116</td><td>微孔板检测实验方案</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>内肽酶 Lys-C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3428</td><td></td></tr><tr><td>FASP蛋白质消化试剂盒</td><td>蛋白质发现</td><td>44250</td><td></td></tr><tr><td>甲酸&amp;nbsp;</td><td>Fluka</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>GELFrEE 分离系统</td><td>蛋白质发现</td><td>42001</td><td>GELFrEE 8100</td></tr><tr><td>亮抑酶肽</td><td>Calbiochem</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>MacroSpin 柱</td><td>The Nest Group</td><td>SMM SS18V</td><td>硅胶C18</td></tr><tr><td>微囊藻毒素</td><td>Calbiochem</td><td>475815</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>多磺乙基A柱</td><td>The Nest Group</td><td>202SE0503</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15-338-53</td><td>Model 100</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6567</td><td>蛋白质组学级</td></tr></tbody></table>

自下而上与鸟枪法蛋白质组学鉴定耳蜗全面蛋白质组

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

蛋白质组学是一种常用的方法，可为复杂生物系统提供深入见解。耳蜗感觉上皮含有将声音的机械能转化为外周和中枢神经系统处理的电化学能的感受器。目前已开发出多种蛋白质组学技术用于研究耳蜗内耳，例如二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）、抗体微阵列和质谱（MS）。质谱是蛋白质组学中最全面且用途最广泛的工具，结合分离方法可对生物样本进行深入的蛋白质组分析。分离方法与质谱联用能够富集蛋白质样本，检测低分子量和疏水性蛋白质，并通过降低蛋白质组动态范围来鉴定低丰度蛋白质。可对全裂解液或分馏后的蛋白质裂解液采用不同的消化策略，以提高肽段和蛋白质序列的覆盖度。在质谱分析前，可应用不同的分离技术（包括强阳离子交换（SCX）、反相（RP）和凝胶洗脱液相分馏电泳（GELFrEE））来降低样本复杂性，从而实现蛋白质鉴定。

为了获得耳蜗感觉上皮最全面的蛋白质组，必须在蛋白质提取和样品制备前快速进行组织解剖。可采用两种蛋白质组学技术：shotgun 蛋白质组学和自下而上（bottom-up）蛋白质组学。为制备 shotgun 蛋白质组学样品，采用如图1所示的 FASP 消化法。FASP 方法可实现蛋白质浓缩、去除去垢剂，并利用多种酶对蛋白质进行消化。本研究采用了两种双重消化程序：第一种为先进行胰蛋白酶（trypsin）消化，随后再次使用胰蛋白酶进行第二次消化，将两次消化产物合并后，通过强阳离子交换（SCX）柱分离为18个组分，并进行纳米液相色谱-串联质谱（nano LC-MS/MS）分析。采用该实验方法进行单次 LC-MS/MS 运行时，在1%错误发现率（FDR）下共鉴定出1,485种蛋白质。在这些已鉴定的蛋白质中，分别有329种和258种被归类于线粒体和质膜（图2A）。第二种双重消化程序包括先使用赖氨酸肽内切酶（LysC）消化，再进行胰蛋白酶消化。每种消化产物分别独立上样，通过 SCX 柱分离为18个组分，并进行 nano LC-MS/MS 分析。LysC 与胰蛋白酶消化的结果在1% FD...

由于耳蜗感觉上皮组织体积微小，且膜蛋白难以分离和鉴定，对其进行蛋白质组分析具有较大挑战性。通过结合多种样品制备方法、分离技术以及高分辨率质谱分析，可实现对膜蛋白和可溶性蛋白的鉴定。

蛋白质组学是一种常用的研究方法，可为复杂生物系统提供深入见解。耳蜗感觉上皮含有感受器，这些感受器……

以下实验的总体目标是利用多种蛋白质组学技术，从成年小鼠耳蜗感觉上皮中获得尽可能多的蛋白质鉴定结果。首先分离耳蜗感觉上皮组织，然后将其在裂解缓冲液中进行超声处理以获取蛋白质。随后，对全裂解液或组分分离后的蛋白裂解液采用不同的消化策略，以提高肽段和蛋白质序列的覆盖度。接下来采用多种不同的分离技术，包括强阳离子交换和反相色谱法，以在质谱分析前降低样品复杂性。结果表明，通过使用多种蛋白质组学方法和高分辨率质谱仪，可鉴定出小鼠耳蜗感觉上皮中大量膜蛋白和可溶性蛋白。该技术相较于现有的抗体微阵列和二维凝胶电泳等方法的主要优势在于，能够同时鉴定出大量可溶性蛋白和膜蛋白，从而扩展了耳蜗蛋白质组的数据。尽管该方法可为与听力和泪液分泌功能障碍相关的生物标志物提供研究线索，但也可应用于其他系统，例如与年龄以及乳腺癌或肺癌相关的生物标志物的鉴定。该方法还可用于研究其他生物样本，如血液。我们最初提出该方法的构想，源于在开展本实验之前，观察到目前可获取的哺乳动物内耳蛋白质组学数据集十分有限，尤其是已鉴定的膜蛋白数量极为有限。从出生后第30天的小鼠中分离耳蜗感觉上皮组织。用一倍浓度的磷酸盐缓冲液清洗组织后，向组织中加入100微升裂解缓冲液，将混合物置于冰上用超声破碎仪超声处理30秒。每次超声后在冰上冷却裂解物1分钟，共重复超声处理三次。在4摄氏度下，以16,000倍重力离心5分钟，使悬浮液融合。完成后，保留上清液用于消化。随后，将30微升耳蜗蛋白提取物直接加入30 K离心过滤器中，并与200微升含8摩尔尿素的Riss HCL离心液混合。在14,000 ×g 条件下离心15分钟。离心结束后，用200 µL 8 mol/L尿素溶液稀释浓缩物，并在相同条件下重复离心。接着，向滤器中的浓缩物加入10 µL 10×碘乙酰胺和90 µL 8 mol/L尿素溶液，涡旋混匀1分钟。将离心滤膜置于微量离心管架中后，在避光条件下室温孵育20分钟，随后在0.1微克/微升内肽酶ly C（酶与蛋白质比例为1:50）存在下，于14,000 × g离心10分钟，并在30摄氏度下过夜孵育混合物。完成后，向滤膜装置中加入40微升100毫摩尔/升碳酸氢铵溶液，并在14,000 × g下离心10分钟。重复上一步操作后，用40微升8摩尔/升尿素洗涤滤膜装置。随后用40微升超纯水洗涤滤膜装置两次。用 100 微升 50 毫摩尔浓度的碳酸氢铵溶液清洗滤器单元三次后，按酶与蛋白质比例为 1:100 加入浓度为 0.4 微克/微升的胰蛋白酶，并在 37 摄氏度下孵育过夜。孵育结束后，向滤器单元中加入 40 微升 50 毫摩尔浓度的碳酸氢铵溶液，洗脱胰蛋白酶解肽段，然后在 14,000 × g 离心 10 分钟。随后重复此步骤一次。此时，将 50 至 100 微克的消化后蛋白质样品注入一根 200 × 2.1 毫米、5 微米强阳离子交换柱。为分离肽段，在 280 纳米处监测肽段组分，并以每 2 分钟为间隔收集组分。使用馏分收集器收集后，将各组分在真空浓缩仪中干燥。完成后，将干燥的组分于 -80 °C 保存，直至用于液相色谱分析。串联质谱分析。另一种方法中，采用无凝胶分馏技术分离蛋白质混合物。待耳蜗蛋白质上清液经丙酮沉淀法去盐后，向先前悬浮于112微升Milli-Q水中的去盐蛋白质中加入30微升5倍上样缓冲液。接下来，加入 8 µL 的 1 摩尔 DTT，并将混合物在 95 °C 下加热 5 分钟，以还原蛋白质的二硫键。加热后，让混合物冷却。向阳极储液槽中加入 8 mL 运行缓冲液，向样品收集室中加入 150 µL 运行缓冲液，向阴极储液槽中加入 6 mL 运行缓冲液。在此上样后，使用8%的Tris醋酸盐分离胶（分离范围为3.5至150千道尔顿），将150 µL耳蜗蛋白混合物加入上样室。运行开始后，利用移液器在仪器每次暂停时从样品收集室收集样品，并加入新标记的微量离心管中。随后用150 µL运行缓冲液清洗收集室两次，并弃去洗液。对胶条免洗组分进行一维凝胶电泳后，将每个单独的组分直接加入30 K滤膜离心管中。然后在每个滤膜离心管中加入200微升含8摩尔尿素的Tris-HCl溶液，混匀后在14,000 ×g条件下离心25分钟。随后向每个滤膜离心管中的浓缩物中加入10微升10倍稀释的碘乙酰胺尿素溶液，并涡旋震荡1分钟。将离心过滤器放入微量离心管架后，将样品在室温避光条件下孵育30分钟。接着，在30摄氏度过夜孵育后，按酶与蛋白质比例为1:50的比例，向过滤单元中加入浓度为0.1微克每微升的LY C；然后向离心过滤器中加入40微升100毫摩尔每升的碳酸氢铵溶液，并在14,000 × g离心10分钟；重复上一步骤一次后，用100微升50毫摩尔每升的碳酸氢铵溶液洗涤离心过滤器三次；最后一次洗涤后，按酶与蛋白质比例为1:100的比例，加入浓度为0.4微克每微升的胰蛋白酶。待样品在37摄氏度孵育过夜后，通过向每个过滤单元中加入40微升50毫摩尔每升的碳酸氢铵溶液洗脱肽段，并在14,000 × g离心10分钟以收集洗脱液。重复此步骤一次后，采用液相色谱-串联质谱法分析样品。共使用了两种双重消化程序。第一种为三重消化，随后进行胰蛋白酶二次消化，将消化产物在强阳离子交换柱上合并并分段为18个组分，再通过纳米液相色谱-串联质谱法进行分析。采用单次运行的液相色谱-串联质谱分析，在1%错误发现率（FDR）条件下共鉴定出1,485种蛋白质。通过该实验方法，在所鉴定的蛋白质中，分别有324种和258种被归类为线粒体和质膜蛋白质。第二次双重消化步骤包括先进行lys C消化，随后进行胰蛋白酶消化。每次消化产物分别上样并采用强阳离子交换柱分离为18个组分，然后通过纳米液相色谱-串联质谱进行分析。lys C和胰蛋白酶消化的结果共鉴定出3,503种蛋白质，错误发现率（FDR）为1%。此外，分别有605种和617种蛋白质被归类至线粒体和质膜。该方法获得了最多数量的膜相关蛋白质鉴定结果。对LY C和胰蛋白酶进行的重复分析。各组分结果显示，鉴定出的蛋白质中有超过65%在各次实验间是共有的。然而，在重复分析中也鉴定出了一些新蛋白质。这些额外的肽段和蛋白质的鉴定源于色谱条件的微小变化，从而导致用于碎裂的肽段有所不同。制备银染凝胶以显示无凝胶分级分离的结果，如图所示。该凝胶显示了各连续组分中蛋白质按分子量递增进行分离。因此，对12个无凝胶的液体组分采用两种不同的多阶段消化方法进行消化，并通过液相色谱-串联质谱法进行分析。第一种消化方法采用双次胰蛋白酶消化，进行单次液相色谱-串联质谱分析后，在1%错误发现率（FDR）条件下鉴定了2,165种蛋白质。本实验中，分别有516种和399种蛋白质被归类至线粒体和质膜。第二种消化方法采用内肽酶ly C消化，随后进行胰蛋白酶消化和单次液相色谱分析。串联质谱分析鉴定了 2,211 种蛋白质，错误发现率（FDR）为 1%。该方法检测到的膜相关蛋白数量与使用胰蛋白酶-胰蛋白酶方法获得的结果相似。质谱蛋白质组学数据已提交至 ProteomeXchange 联盟，数据集标识符为 PXD000231。在执行该实验流程时，需注意每一步均应避免污染，并在进行蛋白质提取时将组织置于冰上，以防止蛋白质降解。

bottom-up-shotgun-proteomics-to-identify-comprehensive-cochlear

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科研

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生物学

自下而上和猎枪蛋白质组学鉴定一个全面的蛋白质组耳蜗

初级纤毛影响多种信号通路。哺乳动物耳蜗是研究平面细胞极性（PCP）信号通路的理想模型。纤毛功能障碍会影响耳蜗的外向生长、细胞排列模式以及毛细胞的定向，这些均为PCP的表型读数。我们的目标是通过表型分析、免疫组织化学和扫描电子显微镜技术，分析小鼠耳蜗中的PCP信号通路。...

纤毛病小鼠突变体耳蜗中平面细胞极性表型的评估

识别调控突触可塑性和记忆的分子与通路，至今仍是神经科学领域的主要挑战之一。本文描述了一种工作流程，用于在听觉学习范式中，对可能参与学习与记忆巩固过程中突触分子重组的突触蛋白进行相对定量分析。...

小鼠听觉辨别学习后脑区突触蛋白质组的高分辨率定量分析

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

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离体小鼠心脏Langendorff灌注后多聚核糖体的动态蛋白质组学与miRNA分析

本文详细描述了一种利用毛细管区带电泳-电喷雾电离-串联质谱法（CZE-ESI-MS/MS）对蛋白质样品中的蛋白质变体进行分离、鉴定和表征的实验方案。该方案可用于简单蛋白质样品中蛋白质变体的高分辨率表征，以及复杂蛋白质组样品中蛋白质变体的大规模鉴定。...

大规模自上而下蛋白质组学采用毛细管区带电泳串联质谱法

本文描述了一种用于评估正常小鼠带状突触形态特征和功能状态的实验方案。该模型同样适用于噪声诱导和年龄相关性耳蜗突触病变受限模型。文中还讨论了以往小鼠研究的相关结果。...

小鼠耳蜗特定频率区域带状突触的形态学与功能评估

本方案介绍了一种利用两种方法——基于标签和非标签定量——对组织样本进行优化的定量蛋白质组学分析。基于标签的方法在蛋白质定量方面具有更高的准确性优势，而非标签方法则更具成本效益，适用于对大规模队列中的数百个样本进行分析。...

基于质谱的组织样本鸟枪法蛋白质组学综合工作流程

提供详细的实验方案和三个Python脚本，用于操作开源的机器人液体处理系统，以进行质谱实验的半自动化蛋白质样品制备，涵盖去污剂去除、蛋白质消化和肽段脱盐步骤。...

由开源实验室机器人自动完成的霰弹枪蛋白质组学样品处理

本文描述了一种基于质谱的蛋白质组学方法，用于对具有已知组织命运的脊椎动物Xenopus...

基于细胞谱系引导的质谱蛋白质组学在发育中（青蛙）胚胎中的应用

我们已确定胎盘是发育过程中的主要造血器官。研究发现，造血干细胞（HSCs）在胎盘内独特的微环境生态位中生成并扩增。本文描述了从小鼠胎盘中分离和可视化造血干细胞所需的实验技术。...

从胎盘中分离和分析造血干细胞

学习使用自下而上和猎枪蛋白质组学技术鉴定小鼠耳蜗感觉上皮中的膜蛋白和可溶性蛋白。该方法结合多种消化策略与高效液相色谱分离，显著提高了蛋白质鉴定数量，为听觉机制研究提供了全面的蛋白质组数据。

自下而上与鸟枪法蛋白质组学鉴定耳蜗全面蛋白质组

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