自下而上和猎枪蛋白质组学鉴定一个全面的蛋白质组耳蜗

以下实验的总体目标是使用各种蛋白质组学技术从耳蜗感觉上皮中实现最大数量的蛋白质鉴定。这是通过从成年小鼠中分离耳蜗、感觉上皮并在裂解缓冲液中超声处理以获得蛋白质作为第二步来实现的。不同的消化策略应用于全裂解物或分级分离的蛋白质裂解物，以增强肽和蛋白质序列的覆盖率。

接下来使用不同的分离技术，包括强阳离子交换和反相色谱，以降低质谱分析前的样品复杂性。结果显示，通过使用多种蛋白质组学方法和高分辨率质谱仪鉴定了小鼠耳蜗感觉上皮的大量膜蛋白和可溶性蛋白。与抗体微阵列和二维凝胶电泳等现有方法相比，该技术的主要优点是可以鉴定出大量可溶性蛋白和膜蛋白，从而增加了耳蜗蛋白质组数据。

虽然这种方法可以深入了解与听力和流泪障碍相关的生物标志物，但它也可以应用于其他系统，例如识别与年龄和乳腺癌或肺癌相关的生物标志物。该方法也可用于研究其他生物样品，例如血液。当我们观察到哺乳动物内耳可用的有限蛋白质组学数据集时，特别是，在开始此过程之前已鉴定的有限数量的膜蛋白时，我们首先想到了这种方法。

从出生后第 30 天的小鼠中分离人工耳蜗感觉上皮。用 1 x 磷酸盐缓冲液洗涤组织后，向组织中加入 100 μL 裂解缓冲液，并使用声波解剖在冰上对混合物进行超声处理 30 秒。在每次超声处理之间，将裂解物在冰上冷却 1 分钟，然后对样品进行总共 3 次超声处理。

Centra 在 4 摄氏度下以 16， 000 倍 G 的浓度熔融悬浮液 5 分钟。完成后，保留上清液进行消化。然后，将 30 微升等分试样的耳蜗蛋白提取物直接加入 30 K 离心过滤器中，并在 Riss HCL 离心机中与 200 微升八摩尔尿素混合。

混合物在 14， 000 倍 G 下反应 15 分钟。完成后，用 200 微升 8 摩尔尿素溶液稀释浓缩液，并使用与之前相同的条件重复离心。接下来，在过滤器中向浓缩液中加入 10 微升 10 XI oto 乙酰胺和 90 微升 8 摩尔尿素溶液，涡旋 1 分钟。

将离心过滤器放入微量离心架中后，在室温下避光孵育 20 分钟，然后以 14， 000 倍 G 离心 0.1 μg/μL 内切蛋白酶 C 以 1 比 50 的酶蛋白比例离心 10 分钟，并将混合物在 30 摄氏度下孵育过夜。完成后，向过滤装置中加入 40 微升 100 毫摩尔碳酸氢铵溶液，并以 14， 000 次 G 离心混合物 10 分钟重复上一步后，用 40 微升八摩尔尿素清洗过滤装置。然后用 40 微升 milli Q 水清洗过滤器单元两次。

过滤装置用 100 μL 50 毫摩尔碳酸氢铵溶液洗涤 3 次后，以 1：100 的酶蛋白比每微升胰蛋白酶添加 0.4 μg，并将混合物在 37 摄氏度下孵育过夜。孵育后，向过滤装置中加入 40 μL 50 毫摩尔碳酸氢铵溶液洗脱三肽，并以 14， 000 倍 G 离心混合物 10 分钟。然后再次重复此步骤。

此时，将 50 至 100 μg 消化的蛋白质样品注入 200 x 2.1 mm 的 5 μm 强阳离子交换柱上 为了分离肽，请监测 280 nm 处的肽馏分，并每隔两分钟收集馏分。使用馏分收集器，然后在真空浓缩器中干燥馏分。完成后，将干燥的馏分储存在零下 80 摄氏度，直到准备好用于液相色谱。

串联质谱分析。在另一种方法中，使用无凝胶分级分离来分离蛋白质混合物。通过丙酮沉淀对耳蜗蛋白上清液进行脱盐后，向先前悬浮在 112 μL Milli Q 水中的脱盐蛋白中加入 30 μL 5 x 样品缓冲液。

接下来，加入 8 微升 1 摩尔 DTT，并在 95 摄氏度下加热混合物 5 分钟，以减少蛋白质二硫键。加热后让混合物冷却。向阳极储液槽中加入 8 毫升电泳缓冲液，向样品收集室中加入 150 微升电泳缓冲液，向阴极储液槽中加入 6 毫升电泳缓冲液。

在此负载之后，使用质量范围为 3.5 至 150 道尔顿的 8%tris 乙酸盐小柱，将 150 μL 耳蜗蛋白混合物放入样品加载室。开始运行后，使用移液管在仪器上的每个暂停间隔从样品收集室收集样品，并添加到新标记的微管中。然后用 150 μL 电泳缓冲液洗涤收集室两次并丢弃。

对无凝胶组分进行 1D 凝胶电泳。将每个单独的馏分直接添加到 30 K 过滤装置中。然后以 14， 000 x G 离心 25 分钟后，将每个馏分与 200 微升 8 摩尔尿素的 tris HCL 溶液混合，向每个过滤装置中的浓缩液中加入 10 微升 10 XI oto 乙酰胺溶液，涡旋 1 分钟。

将离心过滤器放入微量离心架中后，将样品在室温下避光孵育 30 分钟。接下来，在 30 摄氏度下孵育过夜后，以 1：50 的酶蛋白比例向过滤装置中加入每微升 LY C，向离心过滤器中加入 40 微升 100 毫摩尔碳酸氢铵溶液，并在重复上一步一次后，以 14， 000 倍 G 离心样品 10 分钟， 用 100 μL 50 毫摩尔碳酸氢铵溶液洗涤离心过滤器 3 次，最后洗涤后，每 μL 胰蛋白酶添加 0.4 μg，酶蛋白比为 1：100。样品在 37 摄氏度下孵育过夜后，加入 40 微升 50 毫摩尔碳酸氢铵溶液，从每个过滤单元中洗脱三联肽，并以 14， 000 倍 G 离心样品 10 分钟。

重复此作后，步骤一次，通过液相色谱串联质谱分析样品。使用了两种双重消化程序。第一次是三联酶解，然后是第二次胰蛋白酶酶解，在强阳离子交换柱上合并分馏成 18 个馏分，并通过纳米液相色谱串联质谱法进行分析。

在进行单次液相色谱串联质谱分析时，共鉴定出 1， 485 种 FDR 为 1% 的蛋白质。使用这种实验方法。在鉴定的蛋白质中，324 个和 258 个蛋白质分别分为线粒体和质膜。

第二个双重消化程序包括 lys C 消化，然后是胰蛋白酶消化。将每个酶解物单独加载并在强阳离子交换柱上分离成 18 个馏分，并通过纳米液相色谱串联质谱法进行分析。LY C 和胰蛋白酶消化的结果共产生 3， 503 种蛋白质，FDR 为 1%。

此外，605 和 617 个蛋白质分别分类在线粒体和质膜中。这种方法提供了最多的膜相关蛋白 ID。LY C 和胰蛋白酶的重复分析。

馏分显示，超过 65 种鉴定的蛋白质在实验之间共享。然而，在重复分析中也有新鉴定的蛋白质。由于色谱法的微小变化，鉴定出额外的肽和蛋白质，因此导致不同的肽段碎裂。

制备银染凝胶以可视化无凝胶分级分离的结果，如图所示。在这里，凝胶通过增加每个连续组分的分子量来显示蛋白质分离。因此，使用两种不同的多面消解方法消解 12 种无凝胶液体馏分，并通过液相色谱串联质谱法进行分析。

第一种酶解方法是使用双胰蛋白酶酶解进行，在进行单次液相色谱串联质谱分析时，鉴定出 2， 165 种 FDR 为 1% 的蛋白质。在本实验中，线粒体和质膜分别分为 516 个和 399 个蛋白质。第二种消化方法是使用内切蛋白酶 C，然后进行胰蛋白酶消化，单次液相色谱法。

串联质谱分析鉴定了 2， 211 个蛋白质，FDR 为 1%。这种方法显示出与使用胰蛋白酶方法时相似数量的膜相关蛋白，质谱蛋白质组学数据已存入蛋白质组交换联盟，数据集标识符为 PXD 0 0 0 2 3 1。在尝试此过程时，重要的是要记住在每个步骤中都避免污染，并在进行蛋白质提取时将组织保持在冰上，以避免蛋白质降解。