采用造血祖细胞过继转移法评估派伊尔集合淋巴结中鼠源浆细胞样树突状细胞的发育

以下实验方案的总体目标是通过过继性转移，检测纯化的造血祖细胞在肠道派伊尔结中分化为浆细胞样树突状细胞的能力。该目标通过以下步骤实现：首先对派伊尔结浆细胞样树突状细胞缺陷小鼠，进行编码树突状细胞生长因子 FLT3 配体的质粒的水动力基因转移。

第二步，通过磁珠分离和流式分选技术，从野生型骨髓中分离出常见的树突状细胞前体。最后一步，通过静脉注射将前体细胞过继性转移至经水动力基因转移处理的 pyres patch 浆细胞样树突状细胞缺陷型小鼠体内。最终，可通过流式细胞术评估供体造血前体细胞来源的 PI's patch 浆细胞样树突状细胞群体。

该方法有助于解答免疫学领域中的关键问题，例如定位于派伊尔集合淋巴结内的浆细胞样树突状细胞的发育起源是什么。尽管该方法可为派伊尔集合淋巴结中浆细胞样树突状细胞的起源提供见解，还可用于研究浆细胞样树突状细胞如何影响这些组织内的淋巴细胞群体。

在过继转移前两天，在加热灯下使五只CD45.2阳性干扰素α受体敲除型受体小鼠的血管扩张5至10分钟。然后对每只小鼠，将动物放入固定器中，并用70%乙醇对尾部进行消毒。接着，使用27号针头将5微克血浆包被的Flt3配体和2毫升无菌PBS注入每只动物的尾静脉中。

对于对照组，注射五微克的空载体。监测小鼠15至30分钟后，将其送回饲养设施。在实验当天，将10只同源CD45.1阳性C57BL/6小鼠的分离股骨和胫骨放入含有完全培养基的培养皿中。

然后将27号针头插入每根骨骼的一端，用完全培养基冲洗骨髓至培养皿中，每根骨骼冲洗三次。通过观察排出的液体是否呈浑浊状，以确认骨髓细胞已被冲出。在培养皿中轻柔地吹打培养基上下三至五次，制成单细胞悬液。

然后通过40微米细胞筛过滤骨髓细胞以去除碎片，并用无菌注射器活塞末端轻轻压碎任何细胞团块。在筛网上将细胞离心沉淀，弃去上清液，并用2毫升裂解缓冲液裂解每4至6×10⁷个细胞中的红细胞，在室温下作用5分钟。然后向骨髓细胞中加入10毫升FACS缓冲液，于室温下以500×g离心4分钟。

轻轻吸除上清液后，用10毫升fax缓冲液洗涤沉淀。接着，使用识别造血系标记物的抗体对细胞进行染色，随后进行抗体染色与洗涤步骤。将细胞与磁性山羊抗大鼠微珠共同孵育。

在微珠孵育期间，将一个max LD柱安装到MIDI max细胞分选器上，并用2毫升fax缓冲液预冲洗柱子。然后在柱子下方放置一个15毫升锥形管，将最多5 × 10⁸个细胞溶于2.5毫升fax缓冲液中上样至柱子。每次用2毫升fax缓冲液洗涤柱子，共洗涤三次，收集穿过柱子的谱系阴性细胞至15毫升管中。

计数洗脱的细胞。然后使用适当荧光标记的抗体对细胞进行染色，将样品转移至分选管中，根据目标标志物表达谱对共同树突状细胞前体进行分选。将分选纯化的细胞收集至含有5毫升完全培养基的15毫升离心管中，并在分选结束后记录分选细胞的绝对数量。

离心后，将细胞重悬于无菌 PBS 中，每只小鼠接种总体积为 100 µL，其中含纯化的普通树突状细胞前体细胞浓度为 1×10⁵ 个细胞，并将细胞悬液吸入配有 27 号针头的注射器中。随后，将 CD45.1 阳性的前体细胞经尾静脉注射至每只受体 CD45.2 阳性干扰素 α 受体敲除小鼠体内，过继转移后 7 至 10 天进行如上所述操作。从注射了普通树突状细胞前体的小鼠中取出肠道组织，并将其置于 PBS 浸润的纸巾上。

然后使用精细镊子和剪刀收集小肠壁上所有可见的派伊尔结（Peyer's patches）。需要注意的是，即使在同一小鼠体内，派伊尔结的结构也常常存在差异，因此应仔细确认并分离出所有的派伊尔结。用镊子将分离的派伊尔结置于含有PBS的培养皿中，清洗三次，以去除粪便残留物。

然后，在50毫升锥形瓶中，将P'S补片与10毫升HBSS中的1毫克/毫升胶原酶4混合，于37摄氏度剧烈搅拌消化1小时。消化结束后，将消化后的PIs补片倒入40微米细胞筛中，使用无菌注射器活塞将细胞压入15毫升锥形管中。将过滤后的细胞悬液离心后，将沉淀重悬于6毫升37% per call溶液中，并转移至15毫升离心管中。

然后在下方轻轻加入6 mL 70% percoll溶液，形成percoll梯度。在室温下以800 × g离心20分钟，关闭刹车。随后收集界面处的单个核细胞层。

收集细胞离心成团后，用50毫升完全培养基洗涤两次。然后使用适当的抗体对CD45阳性PYS细胞团进行染色，以检测由过继转移的CD41阳性前体细胞衍生的浆细胞样树突状细胞。

通过流式细胞术分析细胞。浆细胞样树突状细胞可通过其CD11c+ ClecH+ PDCA-1+ B220+ CD11b-表型进行鉴定。最后，利用以下公式计算浆细胞样树突状细胞的绝对数量。

这些点图显示了用于分离共同树突状细胞前体的设门策略。如前所述，小鼠骨髓细胞中的共同树突状细胞前体约占总骨髓细胞的0.1%，大约为每只小鼠可分离出四至六乘以10的4次方个细胞，可用于通过流式细胞术鉴定PI染色的浆细胞样树突状细胞。

首先采用前向散射和侧向散射的设门策略，随后对 CD11c 阳性 clec4c 阳性细胞进行设门。干扰素α受体敲除小鼠中的浆细胞样树突状细胞数量相较于野生型小鼠显著减少。共同树突状细胞前体也可分化为传统树突状细胞。

与野生型小鼠和基因敲除小鼠中数量相似的CD11c阳性、ClecH阴性经典树突状细胞相反，浆细胞样树突状细胞在两者之间存在差异。因此，干扰素α受体基因敲除小鼠为研究PS斑块状浆细胞样树突状细胞的重建提供了机会，且无需使用致死剂量照射。如前所示，将野生型共同树突状细胞前体细胞过继转移至干扰素α受体基因敲除小鼠体内，可促进PIs斑块状浆细胞样树突状细胞数量的增加。

此外，使用FL3配体进行水动力基因转移预处理可进一步增强PIs补片中浆细胞样树突状细胞的扩增，表明转导的共同树突状前体细胞以及可能存在的内源性FL3阳性前体细胞通过响应FL3配体，诱导生成PYS补片中的浆细胞样树突状细胞。这两种条件均可促进CD11c阳性、ClecH阴性的经典树突状细胞生成，这与经典树突状细胞的发育起源一致。PYS补片中的浆细胞样树突状细胞表达典型的浆细胞样树突状细胞标志物，包括ClecH、PDCA-1、B220和LAC CD11b。此外，对接受FL3配体水动力基因转移及共同树突状前体细胞移植的干扰素α受体敲除小鼠的PYS补片进行分析显示，约70%的浆细胞样树突状细胞来源于供体CD45.1阳性的共同树突状前体细胞。

总体而言，这些数据表明，在体内，共同树突状细胞前体的过继转移可响应 Fms 样酪氨酸激酶 3 配体（FL）介导的信号，诱导 PIs 疱样浆细胞样树突状细胞群体的产生。观看本视频后，您应能够充分理解如何分离和鉴定疱样浆细胞样树突状细胞。