使用4D共聚焦显微镜分析颅面形态的斑马鱼
January 30th, 2014
时间推移共焦成像是一个强大的技术表征胚胎发育有益。在这里，我们描述的方法和表征颅面形态发生在野生型，以及PDGFRA，Smad5和与SMO突变体胚胎。
该程序的总体目标是观察和表征发育中的斑马鱼头的咽弓运动。这是通过首先将转基因斑马鱼胚胎包埋在麻醉剂 acrost 凝胶中来实现的。第二步是将琼脂糖包埋的胚胎安装在显微镜载玻片上的一滴甲基纤维素中。
接下来，用真空润滑脂将胚胎密封在两个显微镜载玻片之间。最终，延时共聚焦显微镜用于显示野生型和突变斑马鱼之间的差异以及咽弓的形态发生运动。与静态成像方法相比，该技术的主要优点是它可以实时捕获咽弓发育，使研究人员能够直接观察对形态发生至关重要的组织运动。
为了制作桥接盖玻片，请将 A 22 x 22 盖玻片粘在 24 x 60 盖玻片的每一端。让中间自由。为不到一天的胚胎制作单曲。
1 至 4 天大的胚胎为 2 倍，5 天或以上的胚胎为 3 倍。对于每个样品，使用两个桥接的盖玻片。现在用高真空润滑脂填充 10 毫升注射器。
在 0.2% 液体中准备新鲜麻醉剂，并保持在 42 摄氏度的加热块中。要手动涂覆未孵化的转基因胚胎，请慢慢撕开可丽耐，直到胚胎被释放。现在将包被的胚胎转移到含有 MS 2、22 和 aesthetic 的干净培养基中。
为了准备桥接盖玻片，请慢慢将真空润滑脂从注射器中推出，在桥和盖玻片边缘附近和内部形成光滑的连续珠子。在桥的中间铺上一圈 4% 甲基纤维素以盖住衬片。麻醉胚胎后，将其吸入玻璃移液管中。
垂直向上握住移液器，让胚胎沉到移液器中液体的底部。然后将移液管移入 agro 溶液中，让胚胎落入 aros 中而不排出液体。将一些农业溶液和胚胎吸入移液管中。
然后将胚胎排出一滴 aro 溶液中。在甲基纤维素的顶部。将胚胎向下推到甲基纤维素上，并根据需要定向胚胎以进行成像以密封标本。
将一个桥接盖玻片放在安装的盖玻片顶部，面朝下。对夹层盖玻片的两侧施加均匀的压力，直到桥直接接触并且 agros 将密封件落到两个盖玻片上。验证胚胎的方向是否正确。
用木制涂抹器沿着玻璃擦拭，以抚平真空润滑脂速度中的裂缝和缝隙。擦去边缘上多余的油脂。激活共聚焦显微镜和任何外部激光设备。
还要打开连接到共聚焦显微镜的计算机，然后选择启动系统和共聚焦成像软件。接下来，降低共聚焦显微镜的舞台平台并将物镜移出位置。将默认载物台替换为电子加热载物台。
打开加热台的控制器，并将温度设置为 29.5 摄氏度。将镶固的标本放在加热的载物台上。将 20 x 物镜移动到位并升高舞台平台。
然后激活可见光发射器，使胚胎的头部在视野中居中。要激活荧光通道，请选择要检测的荧光波长，并为每个通道选择颜色查找表。对于每个荧光通道，将激光强度设置为 10.0，并将光电倍增器电压设置为 600 到 700 之间。
要减少背景并增加收集的荧光信息，请将平均设置为 2 或 4，将位深度设置为 16 位。激活 ZS 堆栈和时间序列模块。如有必要，调整针孔。
设置实验的时间间隔和长度。将摄像机转到实时模式。如有必要，调整焦距并增加激光强度。
查看荧光。将数字缩放设置为 0.6 以获得更宽的视图。如果需要。
放置载物台，使所有感兴趣的结构都可见，并且视野中有增长空间。背侧和前侧通过胚胎聚焦到荧光的上限和下限。将第一个和最后一个 Zack 切片位置设置为至少超出这些限制 100 微米或更大。
接下来，将显示查找表设置为范围指示器，使荧光结构显示为灰色阴影，字段的其余部分应为蓝色或黑色。如果需要，将照片倍增器电压提高到刚好低于饱和红色像素出现的水平。如果荧光结构显示为红色，请降低激光强度和/或增益，直到它们变为灰色阴影。
如有必要，请调整偏移量。因此，样本外部的区域为蓝色。将 设置为允许及时收集图像的最小直径。
Z 间隔应始终设置为针孔直径建议的最佳距离，执行短扫描以测试设置，始终使用尽可能低的激光强度。现在，将实验运行所需的时间长度。之后，从加热台中取出胚胎，慢慢分离盖玻片，将盖子、玻片和胚胎浸入 30 毫米培养皿中。
使用玻璃移液管，轻轻地将胚胎从盖玻片上洗掉，然后从培养皿中取出盖玻片。将胚胎放入 28.5 摄氏度的培养箱中以继续发育。在实验结束时，拍摄 agros 安装的兄弟姐妹胚胎的单个 Zack 图像，这些胚胎在实验开始时与标本相似，但在 EM 和 28.5 摄氏度的培养箱中升高。
在野生型胚胎中，根据需要使用共聚焦软件或其他成像处理软件测量咽弓。在神经嵴群之后，咽弓沿前、后和背腹侧 AE 伸长，同时沿喙部方向移动。在其前端，第一咽弓形成上颌和下颌结构域，由口腔外胚层关键形态发生运动分开，在平滑的突变体中被大大破坏。
在这里，第 7 咽弓在受精后 48 小时未能迁移 roly 以与更多的前弓重叠。斑马鱼 SM 5 突变体有许多颅面部缺陷。在这些静态共聚焦图像中。
受精后 32 小时，第二和第三弓腹侧区域的融合很明显。使用延时共聚焦显微镜，我们分析了咽弓的形态发生。在 Smad 中，第五和第三弓之间的五种突变体融合在受精后 32 小时首先出现。
与静态分析一致。虽然 PDGF 家族成员的表达表明它可能广泛参与咽弓形态发生，但后弓的运动似乎是正常的。在 P-D-G-F-R-A 突变体中，第一咽弓的形态发生似乎特别被破坏。
该程序适用于其他常用的斑马鱼技术，例如morpho injection或遗传镶嵌的生成。延时分析允许直接分析这些作的后果。观看本视频后，您应该对如何通过正确麻醉和安装标本并为共聚焦显微镜设置理想参数来对转基因斑马鱼胚胎进行延时体内成像有一个很好的了解。
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概述
本文描述了一种用于时间序列共聚焦成像的方法，以表征斑马鱼胚胎中的颅面发育。该技术允许实时观察咽弓的运动，提供了对野生型和突变型胚胎之间差异的洞察。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 成像技术
背景
- 时间序列共聚焦成像是发育生物学中的一个强大工具。
- 理解颅面发育对于洞察发育障碍至关重要。
- 斑马鱼是研究胚胎发育的优秀模式生物。
- 突变株可以揭示形态变化的遗传基础。
研究目的
- 观察并表征斑马鱼的咽弓运动。
- 比较野生型和突变型胚胎之间的发育运动。
- 增强对颅面发育的理解。
使用的方法
- 将转基因斑马鱼胚胎嵌入麻醉性丙烯酸凝胶中。
- 将胚胎固定在显微镜载玻片上的甲基纤维素中。
- 用真空油封住显微镜载玻片之间的胚胎。
- 利用时间序列共聚焦显微镜进行实时成像。
主要结果
- 实时成像捕捉了发育过程中关键的组织运动。
- 在野生型和突变型胚胎之间观察到咽弓发育的差异。
- 该技术提供了对颅面发育动态的洞察。
- 时间序列成像比静态方法更适合研究发育过程。
结论
- 时间序列共聚焦成像对于研究胚胎发育是有效的。
- 该方法可以应用于斑马鱼的各种遗传背景。
- 获得的洞察可以为发育障碍的研究提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Time-lapse confocal imaging enables direct observation of dynamic tissue movements in living embryos, providing critical insights into morphogenetic processes that underlie craniofacial development. This approach supports target validation by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system, enhancing predictive confidence in early discovery. The methodology facilitates mechanistic de-risking by allowing real-time comparison of wild-type and mutant phenotypes, informing go/no-go decisions in preclinical target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing how genetic mutations disrupt pharyngeal arch morphogenesis in zebrafish.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for functional target validation through longitudinal imaging of tissue behaviors in cranial neural crest.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by detecting varied tissue behaviors that cause craniofacial abnormalities, linking genotype to phenotype.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements of pharyngeal arch elongation and movement along anterior-posterior and dorsal-ventral axes.
- Operational Value: Enables assay standardization through consistent embryo mounting, anesthesia, and imaging parameters across experimental conditions.
- Scalability: Compatible with increasing abundance of transgenic zebrafish lines, supporting high-content screening of mutant and microinjected embryos.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses a disease-relevant system to model craniofacial morphogenesis, with observations in smoothened and SMAD5 mutants reflecting human developmental disorder mechanisms.
- Preclinical Model: Zebrafish embryos serve as a predictive system for assessing morphogenetic disruptions prior to mammalian studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Time-lapse imaging allows detection of early phenotypic defects, such as failed rostral migration of the seventh pharyngeal arch at 48 hpf, informing early-stage de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, enabling real-time analysis of morphogenetic consequences of genetic manipulations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by directly observing tissue movements critical to morphogenesis in wild-type and mutant embryos.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via time-lapse capture of pharyngeal arch dynamics in developing zebrafish heads.
- Analytics: Enables measurement of pharyngeal arch elongation and movement using confocal software, providing statistical outputs for comparing conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through analysis of mutant phenotypes that mirror human craniofacial disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to various genetic backgrounds and commonly used zebrafish techniques like morpholino injection.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in craniofacial development through direct in vivo observation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined embryo preparation, mounting, and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of morphogenetic disruptions, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by linking genetic perturbations to quantifiable phenotypic outcomes in a scalable model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, transgenic handling, and confocal microscopy operation.
- Dependent on instrumentation including confocal microscope with Z-stack and time-series capabilities, heated stage, and laser systems.
- Necessitates cross-team standardization of anesthesia protocols, mounting media (agarose, methylcellulose), and sealing techniques (vacuum grease, bridged cover slips).
- Involves adaptation considerations across model systems, particularly in adjusting embryo age-specific mounting (single/double/triple bridged slips) and imaging parameters for developmental stage.
- Includes practical limitations such as potential developmental delays from anesthesia and mounting, though reported as minimal in the source.
