利用4D共聚焦显微镜分析斑马鱼颅面形态发生

本实验的总体目标是观察并表征斑马鱼胚胎头部发育过程中咽弓的运动。首先，将转基因斑马鱼胚胎包埋于含有麻醉剂的琼脂糖凝胶中；第二步，将包埋在琼脂糖中的胚胎置于载玻片上的一滴甲基纤维素液滴中，完成装片。

接下来，将胚胎用真空油脂密封在两张载玻片之间。最终通过延时共聚焦显微镜观察野生型与突变型斑马鱼之间的差异，以及咽弓的形态发生运动。该技术相较于静态成像方法的主要优势在于，能够实时捕捉咽弓的发育过程，使研究者可以直接观察对形态发生至关重要的组织运动。

制作桥式盖玻片时，将一块 22 × 22 的盖玻片用超级胶水粘在一块 24 × 60 盖玻片的两端，中间部分保持空置。对于年龄不足一天的胚胎，应制作用于单个样本的盖玻片。

对于1至4日龄的胚胎使用双桥盖玻片，5日龄或更老的胚胎则使用三桥盖玻片。每个样本使用两个桥接的盖玻片。现在用高真空油脂填充一支10毫升注射器。

在0.2%液体Aros中配制新鲜麻醉剂，并置于42摄氏度加热块中保温。手动去壳未孵化的转基因胚胎时，缓慢撕开绒毛膜，直至胚胎释放。随后将去壳后的胚胎转移至含有MS 222和麻醉剂的清洁培养基中。

制备桥式盖玻片时，缓慢推动注射器中的真空润滑脂，使其在桥结构内侧及盖玻片边缘形成一条平滑连续的细线。在桥结构中央的盖玻片上涂抹一圈4%甲基纤维素。当胚胎麻醉后，用玻璃移液管将其吸入。

将移液器垂直持起，使胚胎沉降至移液器内液体的底部。然后将移液器插入农杆菌溶液中，让胚胎落入农杆菌溶液中，但不要将液体排出。吸取部分农杆菌溶液和胚胎进入移液器。

然后将胚胎排入一滴aro溶液中，置于甲基纤维素上方。将胚胎向下推至甲基纤维素上，并根据成像需要调整胚胎方向，以封固样本。

将一片带桥接结构的盖玻片朝下放置在已固定的盖玻片上方。均匀按压夹心状的两片盖玻片两侧，直至桥接部分直接接触，且琼脂滴将两片盖玻片密封。确认胚胎方向正确。

用木质涂药棒沿玻璃摩擦，以抹平真空脂中的裂纹和缝隙。擦去边缘多余的油脂。启动共聚焦显微镜及任何外部激光设备。

同时打开连接共聚焦显微镜的计算机，并启动系统和共聚焦成像软件。接下来，降低共聚焦显微镜的载物台平台，并将物镜移出工作位置。用电子加热载物台替换默认的载物台。

打开加热载物台的控制器，将温度设置为29.5摄氏度。将装好的样品放置在加热载物台上。将20倍物镜移至工作位置，并升起载物台平台。

然后启动可见光发射器，并将胚胎头部置于视野中央。要激活荧光通道，请选择待检测的荧光波长，并为每个通道选择相应的颜色查找表。对于每个荧光通道，将激光强度设置为10.0，光电倍增管电压设置在600至700之间。

为了降低背景干扰并增加采集的荧光信号信息，将平均次数设为2或4，位深度设为16位。启用ZS层扫描和时间序列模块。必要时调整针孔大小。

设置实验的时间间隔和持续时间。将相机调至实时模式。根据需要调整焦距并增加激光强度。

观察荧光。如需更宽的视野，可将数字变焦设置为 0.6。

调整载物台位置，使所有感兴趣结构均可见，并在视野内为生长留出空间。从背侧和头侧对胚胎进行调焦，直至到达荧光信号的上下边界。将首层和末层 Zack 切片位置设置在上述边界之外至少 100 微米或更远的位置。

接下来，将显示查找表设置为范围指示器，使荧光结构呈现灰色调，而视野其余部分应为蓝色或黑色。如有需要，将光电倍增电压调高至刚好低于出现饱和红色像素的水平。如果荧光结构呈现红色，应降低激光强度和/或增益，直至其变为灰色调。

如有必要，调整偏移量，使样品外部区域呈现蓝色。设置最小直径，以确保能够及时采集图像。

Z轴间隔应始终设置为针孔直径建议的最佳距离，使用尽可能低的激光强度进行短时间扫描以测试设置参数。随后，按所需时长运行实验。实验结束后，将胚胎从加热载物台上取出，缓慢分离盖玻片，将盖玻片及胚胎一同浸入盛有胚胎培养液的30毫米培养皿中。

使用玻璃移液管轻轻将胚胎从盖玻片上冲洗下来，并将盖玻片从培养皿中移除。将胚胎放入28.5摄氏度的培养箱中继续发育。实验结束时，对与实验开始时处于相似发育阶段、但在胚胎培养液（EM）和28.5摄氏度培养箱中培养的Agros固定同胞胚胎，分别拍摄Zack图像。

根据需要，使用共聚焦软件或其他图像处理软件测量野生型胚胎中的咽弓。在神经嵴细胞迁移过程中，咽弓沿前后轴和背腹轴方向伸长，同时向头侧方向移动。在咽弓的前端，第一咽弓形成由口腔外胚层分隔的上颌和下颌区域；而在smoothened突变体中，这些关键的形态发生运动受到严重破坏。

在此，第七对咽弓在受精后48小时未能正常向前迁移并与更靠前的咽弓重叠。斑马鱼SM五号突变体具有多种颅面缺陷。在这些静态共聚焦图像中。

受精后32小时，第二和第三鳃弓腹侧区域的融合已清晰可见。通过延时共聚焦显微镜，我们分析了咽弓的形态发生过程。在Smad5突变体中，第二和第三鳃弓之间的融合最早出现在受精后32小时。

与静态分析结果一致。尽管血小板源性生长因子（PDGF）家族成员的表达提示其可能广泛参与咽弓形态发生，但后部咽弓的运动似乎正常。在P-D-G-F-R-A突变体中，第一咽弓的形态发生出现特异性破坏。

该操作可与其他常用的斑马鱼实验技术相结合，例如形态发生素注射或遗传嵌合体的构建。通过延时分析，可直接观察这些操作所产生的后果。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对转基因斑马鱼胚胎进行活体延时成像，包括如何正确麻醉和固定样本，以及如何设置共聚焦显微镜的理想参数。