Name: 从肾脏双重否定αβ性T细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学习从小鼠肾脏中分离高纯度双阴性T细胞的方法，通过胶原酶消化、密度梯度离心和磁珠分选技术实现。该方案为研究肾脏免疫反应和急性肾损伤机制提供了可靠的实验基础。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）项目（R21 AI095484）资助。感谢NHI四聚体核心实验室提供CD1d四聚体。

1. 仪器、培养基和试剂的准备
<ol>
	<li>仪器：在无菌条件下准备试剂，并在超净工作台内操作。</li>
	<li>准备 1 L RPMI 组织培养基，加入 5% 胎牛血清、2.1 g 碳酸氢盐、10 ml 100 倍谷氨酰胺、10 mg HEPES、1 mg 丙酮酸钠以及 10 ml 100 倍青霉素/链霉素。 
	注意：推荐使用的组织培养基 RPMI 可与 DMEM 互换使用。</li>
	<li>制备 5% 胶原酶“D”溶液（将 5 ml 胶原酶“D”加入 9 ml 组织培养基中）。</li>
	<li>配制三种不同浓度的 Percoll 溶液：100%、80% 和 40%。以下浓度按 1 个样本计算。将溶液置于室温保存。
	<ol>
		<li>Percoll 溶液：加入 9 ml 未稀释的 Percoll（来自储存液）；加入 1 ml 10 倍 PBS。</li>
		<li>Percoll 溶液：加入 8 ml 100% Percoll；加入 2 ml 1 倍 PBS。</li>
		<li>Percoll 溶液：加入 4 ml 80% Percoll；加入 4 ml 1 倍 PBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 1 L 荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液：加入 5 ml 10% BSA（终浓度 0.1% BSA）、1 ml 10% 叠氮化钠（终浓度 0.1%）、2 ml EDTA 溶液，用 1 倍 PBS 定容至 1,000 ml。</li>
</ol>
2. 肾脏消化的制备
<ol>
	<li>在获得必要的机构批准后，按照现行法规和动物护理指南，采用标准方法处死小鼠并放血。
	<ol>
		<li>用戊巴比妥钠（0.07 mg/kg）对小鼠进行麻醉。</li>
		<li>进行放血操作。</li>
		<li>将小鼠仰卧位固定于手术台上。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒腹部区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向培养皿中加入10 ml胶原酶D溶液。</li>
	<li>从每只小鼠体内取出双侧肾脏并去包膜。
	<ol>
		<li>从胸骨至耻骨沿中线切开腹壁皮肤和腹膜，以打开腹腔。</li>
		<li>将肠管向侧方移开，暴露左肾。</li>
		<li>用镊子仔细分离左侧囊膜。 
		注意：肾包膜呈透明层状，环绕肾脏，部分被肾周脂肪组织覆盖。</li>
		<li>使用手术剪剪断肾蒂血管，切除左侧肾脏。</li>
		<li>对右肾重复相同的步骤。 
		注意：右肾位置更靠 cranial 且更接近中线（肾蒂较短）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将肾脏放入培养皿中。</li>
	<li>使用普通金属切割刀片将肾组织切成小块（尺寸为1-2 mm），并将组织块放入胶原酶溶液中，在37 °C培养箱中孵育30-45分钟（图1).</li>
</ol>
3. 从肾脏消化物中制备肾脏单个核细胞（KMNC）
<ol>
	<li>通过使用70 µm细胞筛对组织进行机械性解离，获得肾脏消化后的细胞悬液，并将其重悬于25 ml组织培养基中并混匀。</li>
	<li>在4 °C条件下，以400 × g离心10分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>将沉淀物重悬于4 ml 40% Percoll溶液中，然后用塑料移液管缓慢而小心地将其轻轻覆盖于4 ml 80% Percoll溶液上。此操作将形成两相，中间由一层半透明界面清晰分隔，上层为对应脂质的黄色层。</li>
	<li>在室温下以1,500 × g离心30分钟，离心机设置为无刹车模式。</li>
	<li>通过抽吸方式去除上层黄色且黏稠的液体（约1–2 ml）。</li>
	<li>仅用移液管收集两相界面处略带白色半透明的界面层，小心地将此悬液转移至含有2 ml组织培养基的15 ml锥形管中，随后加入13 ml培养基，使总体积达到15 ml。</li>
	<li>在4 °C条件下，以400 × g离心10分钟。</li>
	<li>将样品重悬于1 ml培养基中。</li>
	<li>使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上计数KMNC数量，并以每毫升每肾脏的KMNC数量表示结果。</li>
	<li>按上述方法洗涤一次。</li>
</ol>
4. 从 KMNC 中分离造血细胞（CD45+）（步骤 I）
<ol>
	<li>将细胞重悬于90 µl运行缓冲液中，细胞数量最多可达107。</li>
	<li>加入10 µl CD45磁珠，4 °C孵育15分钟。</li>
	<li>加入1 ml运行缓冲液以终止反应。在4 °C下以400 × g离心10分钟，并将沉淀重悬于500 µl运行缓冲液中。</li>
	<li>将磁性分离柱置于磁铁上，用3 ml运行缓冲液冲洗，以进行准备。</li>
	<li>将细胞悬液通过磁性分离柱，收集未标记的穿柱细胞。</li>
	<li>用3 ml运行缓冲液洗涤细胞三次，然后收集流出液。</li>
	<li>从磁性分离装置上取下分离柱，用移液器加入5 ml运行缓冲液至柱上，立即冲洗出标记的细胞组分。此组分为CD45+细胞。对细胞进行计数。</li>
	<li>为计算肾脏中不同T细胞亚群的绝对数量，将肾单个核细胞（KMNC）总数乘以流式细胞术测定的阳性细胞百分比（图2）。</li>
</ol>
5. 通过阴性选择法从 CD45+ 制备物中分离 DN T 细胞（第二步）
<ol>
	<li>加入以下每种生物素标记抗体各 2.5 µl（0.5 mg/ml，1.25 µg）：抗-CD4、抗-CD8、抗-Fc 受体（CD16/32）、抗-MHC II 类分子（I-A b）、抗-CD1d PBS-57 四聚体，每 107 造血细胞</li>
	<li>在低温室中孵育细胞 30 分钟。</li>
	<li>加入1 ml抗生物素微珠。</li>
	<li>在低温室中孵育30分钟。</li>
	<li>将试管置于磁铁中，进行去除非目标细胞。</li>
	<li>使用血细胞计数板对活细胞进行计数，以确定阴性组分中DN T细胞的总数。</li>
	<li>通过流式细胞术按照以下设门策略检测DN T细胞纯度：首先设门CD45+，其次设门TCRαβ+，排除CD1d+细胞，绘制CD4+与CD8+的点图以鉴定DN T细胞（双阴性T细胞）图3).</li>
	<li>将总数乘以纯度测定的百分比。 
	注意：使用本方案可获得纯度超过90%的DN T细胞群体。</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+previously+unknown+antigen-specific+regulatory+T+cell+and+its+mechanism+of+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression.</a> Nat Med. 6, 782-789 (2000).</li>
<li>Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+regulatory+function+of+lymphoproliferative+double+negative+T+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo.</a> J Exp Med. 196, 261-267 (2002).</li>
<li>Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+in+vivo+trogocytosis+as+a+mechanism+of+double+negative+regulatory+T+cell-mediated+antigen-specific+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression.</a> J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).</li>
<li>Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-lymphocyte+infusion+induces+transplantation+tolerance+by+activating+systemic+and+graft-infiltrating+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells.</a> Blood. 100, 3408-3414 (2002).</li>
<li>Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+in+vitro-generated+DN+T+regulatory+cells+induces+permanent+cardiac+allograft+survival+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice.</a> Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).</li>
<li>Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+graft-versus-host+disease+by+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells.</a> J Immunol. 171, 134-141 (2003).</li>
<li>Mohamood, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gld+mutation+of+Fas+ligand+increases+the+frequency+and+up-regulates+cell+survival+genes+in+CD25%2BCD4%2B+TR+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells.</a> Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).</li>
<li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3%2BCD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).</li>
<li>Hamad, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%2B+double-negative+T+cells+suppress+polyclonal+T+cell+activation+by+a+Fas-independent+mechanism+that+involves+inhibition+of+IL-2+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production.</a> J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).</li>
<li>Rabb, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+role+of+T+lymphocytes+in+renal+ischemia-reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Renal%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).</li>
<li>Burne, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+CD4%28%2B%29+T+cell+as+a+major+pathogenic+factor+in+ischemic+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure.</a> J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).</li>
<li>Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+T+cell+depletion+in+murine+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation. 74, 759-763 (2002).</li>
<li>Crispin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+double+negative+T+cells+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+produce+IL-17+and+infiltrate+the+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys.</a> J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).</li>
<li>Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+analyses+on+T-cell+subsets+in+lymph+nodes+of+MRL%2FMp-lpr%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).</li>
<li>Dowdell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+FAS+mutations+are+common+in+patients+with+genetically+undefined+autoimmune+lymphoproliferative+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome.</a> Blood. 115, 5164-5169 (2010).</li>
<li>Juvet, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcRgamma+promotes+T+cell+apoptosis+in+Fas-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice.</a> J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).</li>
<li>Thomson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcR+gamma+presence+in+TCR+complex+of+double-negative+T+cells+is+critical+for+their+regulatory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function.</a> J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突可披露。

由于DN T细胞被发现参与多种病理状况，如自身免疫性疾病、癌症、移植物耐受以及包括急性肾损伤（AKI）、肾小球肾炎在内的肾脏原发性疾病，目前对其的研究兴趣日益增加8,13因此，有必要更深入地了解和表征双阴性T细胞（DN T细胞）的病理生理功能。然而，目前对这些细胞功能的认识仍远不如对CD4和CD8 T细胞的了解。主要原因在于双阴性T细胞在次级淋巴器官中数量稀少，难以获取足够数量的细胞用于研究 体外 分析和过继转移实验。DN T细胞主要位于肾脏等非淋巴组织中8 但缺乏从实体器官中可靠分离这些细胞的方法，阻碍了对其功能的研究。因此，我们新建立的从肾脏分离DN T细胞的方案有望加速DN T细胞功能的研究。在Fas缺陷（lpr）或FasL缺陷（gld）小鼠中，DN T细胞大量积聚于淋巴结，可轻松从淋巴器官中分离获得 9,14,15，但从其他组织中分离这些细胞仍然是一项挑战。
根...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51192/isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney">Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney</a>.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle

A correction was made to: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney.

Erratum: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

外周αβTCR+CD3+CD4-CD8-双阴性（DN）T细胞可分为多个亚群，各亚群具有不同的表型和功能1-4。DN T细胞目前尚不被充分理解，但在不同疾病模型中的病理生理免疫反应中正日益受到关注4-6。
DN T细胞是一种独特的免疫细胞类型，在调控多种免疫和自身免疫反应以及同种移植耐受性方面的作用日益受到关注4-6,9。这类细胞在外周血和次级淋巴器官（如脾脏和淋巴结）中较为罕见，但在正常的肾脏和肠道上皮组织中却是主要的常驻细胞10-12。目前对于DN T细胞在稳态条件下以及在急性肾损伤（AKI）等病理状态（如肾移植相关疾病）中的肾脏功能仍知之甚少7。
由于不同免疫细胞在调控免疫应答（包括同种异体应答）中具有复杂的作用，明确每种细胞的作用对于理解同种异体应答以及设计新的治疗方法至关重要。鉴于在生理状态及多种疾病条件下肾脏中存在大量双阴性T细胞（DN T细胞），这类细胞很可能在调控小鼠和人类的免疫及自身免疫应答中发挥关键作用，并在移植受者中的同种异体应答中起重要作用。尽管目前已有越来越多但尚显零散的证据表明，DN T细胞兼具致病性和免疫抑制性功能，但我们对其为何及如何表现出特定的有害或抑制性功能，以及微环境如何影响其功能，仍知之甚少。
由于它们在肾脏中含量较低，因此需要改进分离方法。
目前尚无从非淋巴组织中分离双阴性T细胞（DN T细胞）的标准方案。本方案描述了一种从肾脏分离DN T细胞的新型方法；然而，该方法也可适用于多种非淋巴组织。

<table><tbody><tr><td>层流罩&amp;nbsp;</td><td>Baker Company, Inc</td><td></td><td>或同等设备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>或同等设备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>可控气氛培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&amp;nbsp;(37 &amp;deg;C，含5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>分析型流式细胞仪</td><td>LSR II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Media Tech</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Corning Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 叠氮化钠 (NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Mediatech</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>EDTA缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1161</td><td></td></tr><tr><td>LS柱&amp;nbsp;</td><td> MiltenyiBiotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD45+ 微珠</td><td> MiltenyiBiotec</td><td>6.78E-51</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记微珠&amp;nbsp;</td><td> MiltenyiBiotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>抗CD45抗体（克隆：30-F11）&amp;nbsp; PerCP&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>抗CD45抗体（克隆：30-F11）&amp;nbsp; APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>抗TCR Pacific Blue&amp;nbsp;（ab链，克隆：H57-597）</td><td>Invitrogen</td><td>HM3628</td><td></td></tr><tr><td>抗CD4 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0043</td><td></td></tr><tr><td>抗CD8 FITC</td><td>eBioscience</td><td>8011-0087</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗CD4抗体（GK1.5）</td><td>BD</td><td>553728</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗CD8抗体&amp;nbsp;（克隆53-6.7）</td><td>BD</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗MHC II类分子抗体（I-A b）</td><td>BD</td><td>553609</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS运行缓冲液 - MACS分离缓冲液&amp;nbsp;</td><td> Miltenyi I Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J小鼠</td><td>Jackson Labs</td><td>000664</td><td>肾脏 - 淋巴结</td></tr><tr><td>培养皿&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>356517</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;#956;m滤膜&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>推杆&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>或同等设备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GeneMate 50 ml离心管</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-3</td><td>或同等设备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GeneMate 15 ml离心管</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-1</td><td>或同等设备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CD1d &amp;#945;-半乳糖神经酰胺四聚体</td><td>NHI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从肾脏中分离双阴性 αβ t 细胞

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

目前尚无从非淋巴组织中分离双阴性T细胞（DN T细胞）的标准方案，尽管已有越来越多的报道表明其参与了多种免疫反应。DN T细胞是一类独特的免疫细胞，已被证实参与调控免疫反应、自身免疫反应以及对同种异体移植的耐受性1-6。然而，这类细胞在外周血和次级淋巴器官（如脾脏和淋巴结）中极为稀少，却在正常肾脏中大量存在。由于其在外周组织中数量稀少，目前对其病理生理功能知之甚少7。我们近期报道了在稳态及缺血再灌注损伤条件下，对肾脏中该细胞群体进行全面的表型与功能分析8。建立从肾脏中分离DN T细胞的实验方案，将极大促进对其功能的深入研究。
本文介绍一种新颖的实验方案，可从鼠类肾脏中分离出高纯度的αβ CD4+ CD8+ T细胞以及双阴性T细胞（DN T细胞）。简言之，我们使用胶原酶消化肾脏组织，并通过密度梯度离心法分离肾脏单个核细胞（KMNC）。随后进行两个步骤，将KMNC中造血来源的T细胞比例从3%富集至70%。第一步采用CD45+细胞分离试剂盒对造血细胞进行阳性筛选。第二步通过去除非目标细胞，实现DN T细胞的阴性分离，所用试剂包括抗CD4、抗CD8和抗MHC II类分子的单克隆抗体，以及CD1d α-半乳糖基神经酰胺（α-galcer）四聚体。该策略可获得纯度超过90%的DN T细胞群体。使用上述抗体进行表面染色，随后进行流式细胞术（FACs）分析，以确认细胞纯度。

野生型 C57BL/6 (B6) 肾脏每只含有约 1.5–2.1 × 106 个单个核细胞。其中约不到 10% 为造血来源的 CD45+ 细胞。为制备肾脏单个核细胞（KMNC），需将肾脏按 图1 所示切成小块，随后使用 5% 胶原酶进行消化处理。
随后进行密度梯度离心以收集 KMNC 层 (图 2，左图)。然后使用 CD45+ 磁性微珠对 KMNC 进行阳性筛选，操作如第 4 节（步骤 I）所述。将柱上结合的细胞洗脱后，通过流式细胞术（FACS）分析 CD45+ 细胞。流式细胞术分析显示，CD45+ 细胞的富集度可达约 80% 至 95% (图 2，中图)。在富集的造血 CD45+ 细胞中，约 40–60% 为 αβ TCR+ 细胞（数据未显示），约 30–60% 为 DN T 细胞 (图 2，右图)。
<p class="jove...

DNabT 细胞在外周 T 细胞中较为罕见；然而，它们在某些非淋巴组织中含量丰富。尽管 DN T 细胞的病理生理学意义日益受到重视，但由于难以从非淋巴组织中分离这些细胞，阻碍了对其功能的分析。本文介绍了一种从小鼠肾脏中分离高纯度 DN T 细胞的新型方案。

从肾脏中分离双阴性 αβ T 细胞

目前尚无从非淋巴组织中分离DN T细胞的标准方案，尽管已有越来越多的报道涉及其在……中的作用

本实验的总体目标是描述如何从小鼠肾脏中分离出纯净的双阴性T细胞。首先，将肾脏在胶原酶溶液中进行消化处理。随后，通过密度梯度法分离单个核细胞，并通过阳性选择法收集造血来源的CD45阳性细胞。最终，可通过阴性选择分离出双阴性T细胞。1998年，我们的团队发现免疫细胞（尤其是T细胞）与当时的主流观点相反，实际上介导了急性肾损伤。由于在肾脏和心脏中这类细胞数量极少，难以开展研究，因此我们开发了一种技术以更好地对其进行研究。我们惊讶地发现了一群细胞，即不表达 CD4 或 CD8 的双阴性 T 细胞，这类细胞在正常肾脏以及肾脏损伤过程中均大量存在。本视频将详细介绍并改进研究这些细胞及其作用机制的方法。自 2001 年以来，我们一直在研究双阴性 T 细胞，近期我们与 Dr. Rob 实验室合作，优化了该类细胞的分离方法，以获得高纯度的细胞群体，用于开展多种生物学和免疫学功能研究。尽管该方法可深入了解肾脏中的免疫细胞，也可应用于其他系统，例如非淋巴组织。在开始手术之前，首先在用于组织收集的培养皿中加入10毫升胶原酶D。然后用70%乙醇喷洒已处死小鼠的腹部区域。接下来，从胸骨至耻骨沿中线切开腹部皮肤和腹膜，将肠管向侧方移开以暴露左肾。辨认左肾包膜，其表现为围绕肾脏的一层透明结构，部分被肾周脂肪组织覆盖，需用镊子小心地将其与肾脏分离。然后用手术剪剪断肾蒂血管，以切除组织，将肾脏放入培养皿中。然后，在切除右侧肾脏后，使用普通的金属切片刀将肾组织切成大小为一到二毫米的小块。在37摄氏度下，将组织块置于胶原酶溶液中消化30至45分钟，然后通过70微米细胞筛对肾组织匀浆进行机械性破坏，以分离肾脏单个核细胞。将细胞悬液重悬于25毫升组织培养基中。然后轻轻混匀，离心收集细胞，并将沉淀重悬于4毫升40% percoll溶液中。接着，使用塑料移液管将percoll细胞溶液轻柔地覆盖在4毫升80% percoll溶液之上，形成由半透明层清晰分隔的两相。在室温下以1500 × g离心30分钟（不启用刹车），随后小心吸除约1至2毫升浓稠的黄色含脂顶层。使用新的移液管从两相界面处收集略带乳白色的透明层，并转移至含有 2 毫升组织培养基的 15 毫升锥形管中。然后加入 13 毫升培养基，使总体积达到 15 毫升。洗涤并计数后，将细胞用 90 微升运行缓冲液稀释至 1 × 10⁷ 个/mL。然后将细胞在 4 摄氏度下与 10 微升 CD45 微珠孵育。15 分钟后，加入 1 毫升缓冲液以终止反应。随后离心收集细胞并重悬。用500微升新鲜的流洗缓冲液重悬沉淀。接着，将一根色谱柱放入磁珠分离磁铁中，并用3毫升流洗缓冲液冲洗色谱柱。然后将细胞悬液通过磁性色谱柱，收集穿过色谱柱的未标记细胞。用3毫升的运行缓冲液将含有细胞的离心管清洗三次，每次均收集流出液，然后将层析柱从磁铁上取下。用移液器将5毫升运行缓冲液加到层析柱上，并立即冲洗出含有CD45阳性细胞的标记组分。细胞计数后，每1×10⁷个造血细胞加入2.5 µL的每种生物素化抗体，在4°C下孵育。30分钟后，将细胞在4°C条件下，用1毫升抗生物素微珠溶液再孵育半小时。将一个新的分选柱置于磁铁上，然后将细胞上样到分选柱中，此次收集阴性组分。最后，计数活细胞，确定阴性组分中双阴性T细胞的总数，并将该数值乘以流式细胞术分析所确定的纯度百分比。尽管C57黑鼠每只肾脏含有约1.5至2.1 × 10⁶个单个核细胞，但其中造血来源的CD45阳性细胞占比不足10%。通过密度梯度离心法收集肾脏单个核细胞层后，可利用CD45阳性磁珠分选进一步将CD45阳性细胞纯化至约80%至95%。在富集后的造血来源CD45阳性细胞中，约30%至60%为双阴性T细胞。通过去除 CD4 阳性、CD8 阳性、MHC II 类阳性及四聚体阳性的细胞，对 CD45 阳性细胞进行阴性筛选，可获得纯度高达 90% 至 95% 的双阴性 T 细胞。采用本方案，每只小鼠可获得最多 0.5 × 10⁶ 个造血来源的 CD45 阳性磁标记细胞。该方法将有助于更深入地理解双阴性 T 细胞在不同疾病状态中的生物学功能及其作用机制。

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免疫学与感染

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