在PDMS膜上拉伸微图案化细胞

本实验的总体目标是将图案化细胞在聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性膜上进行拉伸。该过程首先对PDMS薄膜进行处理，随后在PDMS表面构建微图案。将带有微图案的PDMS膜片安装至拉伸装置上，并在其上方放置用于容纳培养基的储液池。

接下来，将细胞接种在微图案化的PDMS膜表面，使其附着于图案上，随后冲洗以去除未附着的细胞。最后一步是对含有细胞的PDMS施加拉伸力，以拉伸细胞。最终通过视频显微镜观察显示，在细胞拉伸过程中，对有丝分裂期哺乳动物细胞的回缩纤维施加外力会导致细胞发生形变。

该方法有助于回答生物力学领域的一些关键问题，例如外力对细胞分裂等细胞过程会产生哪些影响？我们最初想到这一方法时，是希望对正在分裂的细胞施加外力，以启动实验。首先，从预先制备的薄片中切割一块约 35 毫米 × 20 毫米的 PDMS。此处使用市售的薄 PDMS 片，因为它比自制 PDMS 具有更好的可重复性，且更不易断裂。

移除PDMS上下两层塑料保护膜，用镊子将其放入塑料培养皿中。随后在旋转仪上用70%乙醇洗涤五分钟，转速为每分钟30次振荡。洗涤完成后，通过吹入空气使PDMS表面干燥。

接下来，将PDMS置于距离紫外灯约五厘米处，用深紫外光照射五分钟。同时，按照文本方案中的描述配制E-D-C-N-H-S溶液。该溶液必须在使用前即刻配制，因为其反应活性在数小时内便会衰减。

将PDMS薄膜从培养皿转移至未被光照的培养皿盖上。这将确保PDMS周围的环境具有高度疏水性，从而有利于下一步操作。

用移液器将 E-D-C-N-H-S 溶液加至 PDMS 表面，室温孵育 15 分钟。孵育结束后，用清水冲洗掉多余的 E-D-C-N-H-S。

接下来，加入PLL接枝的PEG溶液，在室温下孵育三小时至过夜。孵育结束后，用水冲洗PDMS表面以去除多余的PLL接枝PEG。此时PDMS已通过PLL接枝PEG实现钝化或功能化，可在4摄氏度下保存数天。如需对PDMS进行图案化，将PDMS片置于带有微结构图案的合成石英光刻掩模上。

将带有PLL接枝PEG的PDMS面朝向光刻掩模的铬面放置。然后，在距离紫外灯约五厘米处，通过光刻掩模照射七分钟。照射结束后。

将水加到掩模和PDMS上，然后缓慢地将PDMS从掩模上剥离。将先前钝化的PDMS安装到拉伸装置上。将PDMS的一端固定在拉伸器的固定部分，另一端固定在拉伸器的可移动部分，注意不要夹住过多的PDMS片。

如果 PDMS 夹持过紧，其长度会变短，这可能导致撕裂，因为相同拉伸距离下张力会更大。务必确保螺丝已充分拧紧，否则 PDMS 薄膜会在拉伸开始时或实验后续过程中发生滑动。接下来，将 PDMS 与纤连蛋白溶液孵育一小时。

在室温下，可以使用其他细胞外基质蛋白，但这些蛋白尚未在此方案中进行测试。最后一步，用磷酸盐缓冲液冲洗 PDMS。接下来，在一块较厚的 PDMS 块中切割出一个矩形 PDMS 片段。

然后在内部再切割一个矩形。为了形成能够容纳细胞和培养基的腔室，在此矩形切割的PDMS下方涂抹硅脂，并将其放置在PDMS片上，以形成可保留培养基的腔室。在拉伸过程中，硅脂可使腔室在PDMS片上滑动，从而实现对细胞的图案化。

首先，从培养瓶中分离处于50%汇合度的细胞。待细胞悬浮后，使用200微升枪头反复吹打数次，以打散细胞团块，从而确保单个细胞能够结合到图案上。接着，将1毫升细胞悬液加入到储液池中。

根据细胞类型，将细胞置于37摄氏度培养箱中，使其与图案结合10至30分钟。待细胞附着于图案后，用平衡好的培养基轻轻冲洗未贴壁的悬浮细胞。

使用移液管在吸除培养基的同时持续添加新鲜培养基。此步骤的关键在于保持足够的液体流速，以冲洗掉未贴附的细胞，同时确保细胞始终浸没在培养基中。随后，在培养区域上方加盖盖玻片，以防止蒸发以及在PDMS发生破损时培养基泄漏，并让细胞在图案上贴附并铺展数小时。

然后将装置置于倒置显微镜下并开始成像。避免使用油浸物镜，因为它们会因聚焦问题而无法正常工作。为拉伸微图案上的细胞，需转动微米螺旋，同时在 x、y 和 Z 轴上校正载物台的位置。

需要校正载物台位置，以抵消聚二甲基硅氧烷（PDMS）的扩张和失焦现象。本视频方案中介绍的技术，能够在有丝分裂细胞进入中期时，通过拉伸基底对其回缩纤维施加力。部分回缩纤维被从细胞体上拉离，从而在拉伸前对有丝分裂细胞的皮层施加机械力；为实现这一目的，细胞被接种于椭圆形图案上。

通过光掩模压印圆形图案时，对PDMS进行拉伸来实现图案化。拉伸后，基底被进一步拉伸，使图案变为圆形。观看本视频后，您应能充分理解如何在宏观图案上接种细胞，并对基底施加拉伸力。