在硅橡胶膜拉伸微图案细胞

该程序的总体目标是在聚二甲基亚甲基硫醚或PDMS的弹性膜上拉伸模式单元。这是通过A-P-D-M-S片的作用实现的，随后在PDMS上应用微模式。然后将微模式PDMS片安装在拉伸装置上，并在顶部放置一个保留介质的池。

接下来，将细胞分散在微模式PDMS片的表面上，并让它们附着到模式上，然后冲洗以去除未附着的细胞。最后一步是对包含PDMS的细胞施加拉伸，以拉伸细胞。最终，使用视频显微镜来显示在细胞拉伸过程中对有丝分裂哺乳动物细胞的收缩纤维施加力的结果是细胞发生变形。

这种方法可以帮助回答生物力学领域的关键问题，例如外部力对细胞过程（如分裂）有什么影响？当我们想要对分裂的细胞施加力以开始切割PDMS的一块约35乘以20毫米的片时，我们首先想到了这种方法。这里使用的是市面上可用的薄PDMS片，因为它更具可重复性，且比定制的PDMS更不容易破裂。

取下塑料顶部和底部保护层，用镊子将PDMS放入塑料培养皿中。然后在旋转器上以每分钟30次摆动将PDMS用70%的乙醇清洗五分钟。清洗后，通过使空气流过来干燥表面。

接下来用深紫外线光在距紫外线灯约五厘米的距离上照射PDMS五分钟。同时，准备E-D-C-N-H-S溶液，如文本协议中所描述。因为溶液的反应性在几个小时内就会衰减，所以必须在使用前才准备溶液。

将PDMS片从培养皿转移到未被照射的培养皿盖上。这将确保PDMS周围环境非常疏水，并促进下一步。

用移液器将E-D-C-N-H-S溶液滴在PDMS上，室温下孵育15分钟。孵育后。用水冲洗掉多余的E-D-C-N-H-S。

接下来，添加PLL嫁接PEG溶液，在室温下孵育三小时到过夜。孵育后，用水冲洗掉多余的PLL嫁接PEG。PDMS现在已被钝化或用PLL嫁接PEG功能化，可以在四摄氏度下存储几天。为了在PDMS上进行模式化，将A-P-D-M-S片放在带有模式化微特征的合成石英光掩模上。

将PDMS的带有PLL嫁接PEG的一侧朝向光掩模的铬面。然后通过光掩模照射七分钟，距离紫外线灯约五厘米。照射后。

在掩模和PDMS上加水，然后缓慢地从掩模上剥离PDMS。将先前钝化的PDMS安装在拉伸装置上。将PDMS的一侧固定在拉伸器的固定部分上。将另一侧固定在拉伸器的移动部分上，但不要夹住太多PDMS片。

如果PDMS被夹得太多，它会变短，这可能会导致断裂，因为相同的拉伸距离下，张力会更大。确保螺钉已经拧紧，否则PDMS片会在开始拉伸或实验过程中滑动。接下来，将PDMS与纤连蛋白溶液孵育一小时。

在室温下，可以使用其他细胞外基质蛋白，但这些还没有与此协议一起测试过。最后一步，用磷酸盐缓冲盐溶液冲洗PDMS。接下来，在厚PDMS板中切一个矩形。

然后在内部切另一个矩形。为了有一个能够保留细胞和介质的池，在这个矩形切割的PDMS下加入硅油脂，并将其放在PDMS片上方，以创建一个保留介质的池。在拉伸过程中，该油脂将允许池在PDMS片上滑动以模式化细胞。

首先，在培养瓶中50%的共培养时从培养瓶中分离细胞。当细胞悬浮后，用200微升吸头的移液器将其吸入几次以打破聚集体，这将确保单个细胞与模式绑定。接下来，将一毫升细胞悬液加入池中。

让细胞在模式上绑定10到30分钟，取决于细胞类型。在37摄氏度的培养箱中放置。当细胞附着在模式上后，用平衡介质轻轻冲洗悬浮细胞以冲洗细胞。

用吸取管移除介质，同时加入介质。保持足够的流量以冲走未附着的细胞，同时保持细胞浸没在介质中是至关重要的。接下来，在池上方放置一个盖玻片以防止蒸发和介质泄漏，以防止PDMS破裂，并允许细胞在模式上扩展几个小时。

然后将装置放在倒置显微镜下并开始成像。避免使用油浸物镜，因为它们由于聚焦问题而无法正常工作。为了拉伸微模式细胞，转动微米螺丝，同时纠正x、y和Z轴的舞台位置。

需要纠正舞台位置以抵消PDMS的扩展和焦点的丢失。这个视频协议中介绍的技术允许通过在中期开始时拉伸基底来对有丝分裂哺乳动物细胞的收缩纤维施加力。这些收缩纤维中的一些被从细胞体中拉开，在拉伸之前，机械力施加到有丝分裂细胞的皮质上，细胞被铺在椭圆形模式上以实现这一点。

模式化是通过在光掩模上印刷圆形模式的同时拉伸PDMS来完成的。拉伸