在硅橡胶膜拉伸微图案细胞
January 22nd, 2014
这个手稿提出了一种技术，使用单向拉伸应用或释放力对粘附细胞或组织中。
该程序的总体目标是在聚二甲基 suboxane 或 PDMS 的弹性膜上拉伸图案细胞。这是通过A-P-D-M-S片材的化，然后在PDMS上应用微图案来实现的。然后将微图案 PDMS 片材安装在拉伸装置上，并在顶部放置一个中等固定池。
接下来，将细胞接种在微图案 PDMS 片材的表面上，并在冲洗前将其附着在图案上，以去除未附着的细胞。最后一步是对含有 PDMS 的细胞施加伸长以拉伸细胞。最终，视频显微镜用于显示，在细胞拉伸中对有丝分裂哺乳动物细胞的回缩纤维施加力会导致细胞变形。
这种方法可以帮助回答生物力学领域的关键问题，例如外力对分裂等细胞过程有什么影响？我们最初想到这种方法是在我们想对分界单元施加力，开始从预制片材上切割一块大约 35 x 20 毫米的 PDMS 时。这里使用了市售的薄 PDMS 片材，因为与定制片材相比，它更具可重复性并且不太可能断裂。PDMS 的。
去除塑料的顶部和底部保护层，并使用镊子将 PDMS 放入塑料培养皿中。然后在旋转器上用 70% 乙醇以每分钟 30 次振荡的速度洗涤 PDMS 5 分钟。洗涤后，通过在其上流动空气来干燥表面。
接下来，用深紫外线照射 PDMS 五分钟，距离紫外线灯泡约 5 厘米。同时，按照文本协议中的说明准备 E-D-C-N-H-S 解决方案。溶液必须在使用前制备，因为溶液的反应性会在几个小时内衰减。
将 PDMS 片材从培养皿转移到培养皿的盖子上，培养皿的盖子尚未亮起。这将确保 PDMS 的周围环境非常疏水且便于使用。下一步。
将 E-D-C-N-H-S 溶液移液到 PDMS 上，并在室温下孵育 15 分钟。孵化后。用水冲洗掉多余的 E-D-C-N-H-S。
接下来，加入 PLL 接枝的 PEG 溶液，并在孵育后在室温下孵育 3 小时至过夜，用水冲洗 PDMS 上多余的 PLL 接枝钉子。PDMS 现在用 PLL 接枝 PEG 钝化或功能化，并且可以在 4 摄氏度下储存数天。为了对 PDMS 位置进行图案化，A-P-D-M-S 片材位于合成石英光掩模上，该光掩模具有用于图案化的微特征。
将带有 PLL 接枝 PEG 的 PDMS 面朝向光掩模的镀铬面。然后通过光面镜在距离紫外线灯泡约 5 厘米处照射 7 分钟。照明后。
在面罩和 PDMS 上加水，然后将 PDMS 从面罩上慢慢剥离，将先前钝化的 PDMS 安装到拉伸设备上。将 PDMS 的一侧连接到担架的固定部分。将另一侧固定在担架的移动部分，不要夹住太多的 PDMS 片材。
如果 PDMS 夹紧得太多，它会变短，这可能会导致制动，因为在相同的拉伸距离下，张力会更大。确保螺钉拧紧，否则 PDMS 片材会在拉伸开始时或稍后在实验期间滑动。接下来，将 PDMS 与纤连蛋白溶液孵育 1 小时。
在室温下，可以使用其他细胞外基质蛋白，但这些尚未使用该方案进行测试。作为最后一步，用磷酸盐缓冲盐水冲洗 PDMS。接下来，在厚的 PDMS 板中切割一个矩形的 PDMS。
然后在里面切另一个矩形。为了获得一个能够保留细胞和培养基的池，请在矩形切割的 PDMS 下添加硅脂，并将其放在 PDMS 板材的顶部，以形成一个中等保留池。在拉伸过程中，润滑脂将允许池在 PDMS 片材上滑动，以形成单元图案。
首先，以 50% 的 co flulysis 从培养瓶中分离细胞。细胞悬浮后，用 200 μL 吸头移液数次以分解聚集体，这将确保单个细胞与模式结合。接下来，将 1 毫升细胞悬液加入池中。
让细胞与图案结合 10 到 30 分钟，具体取决于细胞。在 37 摄氏度的培养箱中输入。细胞附着到图案上后，用平衡培养基轻轻冲洗漂浮的细胞以冲洗细胞。
用吸液管去除培养基，同时添加培养基。保持足够的通量以洗去未贴壁的细胞，同时保持细胞浸没在培养基中至关重要。接下来，在池顶部添加盖玻片，以避免蒸发和介质泄漏，以防 PDMS 破裂，并让细胞在图案上扩散几个小时。
然后将设备放在倒置显微镜上并开始成像。避免使用油浸物镜，因为它们会因聚焦问题而无法正常工作。为了拉伸微图案单元，转动测微螺钉，同时校正 x、y 和 z 轴上的载物台位置。
需要校正载物台位置，以抵消 PDMS 的加宽和焦点丢失。该视频方案中介绍的技术允许在中期开始时拉伸底物，从而对有丝分裂哺乳动物细胞的回缩纤维施加力。其中一些回缩纤维从细胞体中拉出，导致在拉伸之前施加在有丝分裂细胞皮层上的机械力，细胞被电镀在椭圆形图案上以实现这一点。
图案化是通过在通过照片掩模绘制圆形图案期间拉伸 PDMS 来完成的。拉伸后，基材被拉伸，使图案变成一个圆。观看此视频后，您应该对如何在宏观图案上电镀细胞，然后对基材施加拉伸力有很好的了解。
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概述
本手稿介绍了一种使用单向拉伸对粘附细胞或组织施加或释放力的技术。该方法涉及在聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性膜上拉伸图案化细胞。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 组织工程
- 生物力学
背景
- 粘附细胞可以受机械力影响。
- 拉伸细胞可以影响其行为和特性。
- PDMS常用于创建柔性基底。
- 了解细胞对机械刺激的反应对各种应用至关重要。
研究目的
- 开发一种施加机械力到细胞的方法。
- 研究拉伸对细胞行为的影响。
- 利用视频显微镜观察细胞反应。
使用的方法
- 准备微型图案化PDMS片。
- 将PDMS安装在拉伸装置上。
- 在微型图案化表面上铺设细胞。
- 施加拉伸以拉伸细胞。
主要结果
- 细胞成功附着在微型图案化PDMS上。
- 施加力导致有丝分裂哺乳动物细胞变形。
- 视频显微镜有效地捕捉了拉伸过程。
- 该方法提供了关于有丝分裂期间细胞力学的洞察。
结论
- 该技术允许对细胞进行受控的机械刺激。
- 它可以用于研究细胞对机械力的反应。
- 这种方法在组织工程和再生医学中具有潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Mechanical stimulation of adherent cells enables interrogation of force-dependent signaling pathways critical for target validation in mechanobiology. This method supports phenotypic screening by applying controlled, reproducible stretch to micropatterned cells, facilitating de-risking of hypotheses linking cellular mechanics to disease mechanisms. The approach provides quantitative, imaging-compatible readouts that enhance predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how external forces influence mitotic progression and cortical dynamics in mammalian cells.
- Operational Value: Uses reproducible PDMS micropatterning to standardize cell geometry and ensure consistent mechanical loading across experiments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates deformation metrics in retraction fibers as a quantitative readout for compound or genetic perturbation effects on mechanotransduction.
- Operational Value: Compatible with video microscopy, allowing real-time, label-free monitoring of cellular responses to stretch without disrupting physiological conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling of tissue morphogenesis and fibrosis by recapitulating dynamic mechanical microenvironments.
- Operational Value: Permits repeated stretch-relaxation cycles to simulate physiological loading, improving translatability to in vivo conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through phenotypic screening to mechanistic validation, particularly for targets implicated in mechanical stress response pathways.
- Discovery Biology: Tests how substrate stretch influences mitotic spindle orientation and cortical tension, clarifying force-sensing mechanisms.
- Screening: Enables standardized assessment of cellular deformability under load, supporting assay reproducibility across screening campaigns.
- Analytics: Provides time-resolved imaging data on fiber retraction and cell shape change, enabling quantitative comparison of mechanical phenotypes.
- Translational Research: Models pathological tissue stretching scenarios, such as in vascular or muscular dystrophy contexts, when supported by disease-relevant cell types.
- Enterprise Reuse: The PDMS stretching platform is adaptable to multiple cell types and pattern designs, supporting reuse across projects without revalidation of core mechanics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces ambiguity in mechanotransduction studies by isolating substrate stretch as the independent variable.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized micropatterning and controlled elongation via micrometric screw.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-based readouts on cytoskeletal integrity under stress.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their sensitivity to mechanical perturbation in relevant cellular contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in soft lithography, cell culture, and live-cell imaging.
- Depends on access to UV patterning equipment, PDMS substrates, and mechanical stretching stages.
- Necessitates standardization of fibronectin coating and micropattern dimensions across labs for data comparability.
- Adaptation to 3D tissue models or alternative ECM proteins may require re-optimization of adhesion and passivation steps.
- Limited by manual actuation; high-frequency or computer-controlled cycling requires integration of motorized stages.
