通过共培养荧光标记菌株监测细菌种群内的种内竞争

该方法通过共培养荧光标记的枯草芽孢杆菌，以实时监测细菌群体中有益和有害突变的快速克隆扩增与淘汰过程。首先，为竞争实验制备细菌的预培养物。将等量的荧光标记菌株混合，并在不同营养条件下共培养细菌。

然后在不同时间点收集样品，适当稀释后将细胞接种至琼脂平板上进行培养。接着通过体视荧光显微镜观察并计数存活的菌株。最终，可根据计数的菌落总数确定存活细菌所占的百分比。

与使用不同抗生素抗性基因盒进行菌株标记以监测种内竞争的方法不同，本方法中，荧光标记的竞争菌株几乎完全等渗，能够在相同的AGA平板上共同培养。该预处理步骤将由我实验室的博士生Lorena演示：从-80摄氏度保存的冷冻菌种中取一微升细菌接种至四毫升LB培养基中，在28摄氏度、220转/分钟条件下过夜培养；随后将0.1毫升菌液转移至含0.9毫升LB培养基的1.5毫升离心管中稀释，并测定其光密度。

然后，为了获得用于竞争实验的混合细胞群体，将含有20毫升CGLC和最低培养基（CGLC与最低培养基按1:1比例混合）的100毫升摇瓶接种，将10毫升培养物转移至15毫升塑料离心管中。在4,000 × g条件下离心10分钟以收集细胞，并弃去上清液。

然后将细胞重悬于 0.5 毫升新鲜 LB 培养基中，并将细胞转移至无菌的 1.5 毫升离心管中，加入 0.5 毫升 50% 无菌甘油。通过剧烈涡旋混合悬液，并将样品置于 -80 °C 冰箱中保存。接下来，将摇瓶中剩余的细菌进行培养。

将摇瓶置于避光环境中，以防止荧光样品发生光漂白。在培养 7 小时和 24 小时后，分别取 0.1 毫升的菌液样品，测定并记录样品 10 倍稀释后的光密度值，并将样品制备成冷冻保存液，于 -80 °C 保存。在收集完所有样品后，将冷冻保存液解冻，并用 0.9% 的生理盐水对各菌株的细胞进行稀释。取 10⁻⁵ 稀释度的菌液 0.1 毫升，接种于 SP 培养基琼脂平板上，并使用无菌玻璃涂布棒均匀涂布细胞。

将平板置于37摄氏度黑暗条件下过夜培养，直至出现单菌落，并用黑色记号笔标记。为便于在体视荧光显微镜下计数存活菌落，将琼脂平板底部划分为四个区域。然后，将平板倒置放置于显微镜下，调节冷光源使菌落清晰对焦。

当菌落在显微镜下聚焦清晰后，切换至适用于CFP Flora four的滤光片组。为观察CFP标记菌株的存活细胞，用记号笔标记该菌株的菌落并计数，记录存活菌落数量。

用乙醇去除标签。然后切换到YFP滤光片组，以观察YFP标记菌株的存活细胞。

用记号笔标记菌落，再次计数存活菌落，并记录数量。打开使用CFP滤光片组和YFP滤光片组拍摄的同一位置的图像。

调整对比度和亮度，以降低培养基产生的背景荧光。打开其中一张图片并全选，复制该图片并粘贴到另一张图片上。

在图层菜单中选择“较亮颜色”来合并图片。本实验中，使用荧光蛋白CFP和YFP标记两种BCI菌株组成的细胞群体，通过将适当稀释的菌液涂布于琼脂平板上，以评估不同氮源对生长的影响。通过计数黄色和蓝色荧光菌落，即可精确确定细胞群体随时间变化的克隆组成。

谷氨酸脱氢酶的酶活性在很大程度上影响 otus 的适合度，具体取决于外源性谷氨酸的可利用性。在缺乏外源性谷氨酸的情况下，高水平的 GDH 活性对细菌不利，因为 G 酶和 B 酶会降解在生物合成中所需的谷氨酸。相反，当存在外源性谷氨酸时，合成两种有功能的 GDH 对细菌有利，因为除了葡萄糖之外，谷氨酸还可作为碳源被利用。

在交换培养实验中也获得了类似结果。同样，在缺乏谷氨酸的培养基中，具有高水平谷氨酸脱氢酶（GDH）活性的细菌被GDH活性降低的细胞所淘汰。相反，仅合成一种有活性GDH的细菌则从培养物中被清除。

当培养基中添加谷氨酸时，混合细胞群体的初始组成在时间过程中几乎保持恒定。无论荧光标记如何。一旦确定了竞争能力，使用 Flora Force 即成为监测细菌细胞群体内物种内竞争的一种强大工具。

如果操作得当，该技术可在五天内完成。