Name: 高效的生产和纯化重组小鼠Kindlin-3从昆虫细胞生物物理研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: 学习利用杆状病毒感染的昆虫细胞系统高效生产重组小鼠Kindlin-3蛋白的方法。该技术通过快速液相色谱纯化，可获得毫克级高纯度蛋白，产量比细菌表达系统提高十倍，适用于难以表达的蛋白质生物物理研究。

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我们感谢Weixan Lu在Sf9细胞株的培养与维护中提供的技术支持。L.A.Y. 获得了英国医学研究理事会（MRC）研究生奖学金的支持。R.J.C.G. 是英国皇家学会大学研究学者。牛津结构生物学分部隶属于惠康信托人类遗传学中心，惠康信托核心资助项目编号 090532/Z/09/Z。

本实验方案假设小鼠 kindlin-3 基因（FERMT3）已成功克隆至载体中，位于极晚期 p10 启动子的下游，且该载体具有侧翼杆状病毒序列，可与 I.M. Jones 及其同事开发的 bacmid BAC10KO:1629 发生同源重组28。在本方案中，kindlin-3 基因被克隆至 pOPINE 载体29，所用引物及克隆策略详见其他文献12。该质粒经改造，使 FERMT3 基因（kindlin-3）受杆状病毒 p10 启动子调控，载体包含 5′ UTR/ORF603 和 ORF1629，并编码一个C端His6-标签，用于后续纯化29。
1. 昆虫细胞培养与维持
<ol>
	<li>在重组杆状病毒扩增之前， 草地贪夜蛾 应培养并维持适应悬浮培养的细胞（Sf9细胞）。 昆虫细胞应始终在专用的组织培养通风橱中使用无菌技术进行操作。</li>
	<li>昆虫细胞悬浮培养物在添加了补充物的Sf-900 II（SFM）无血清液体培养基中孵育 100 μg/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素在烧瓶中 27 °C 以100 rpm振荡培养。</li>
	<li>保持昆虫细胞培养密度范围在 1 x 106 - 1 × 107 细胞/ml，通过用新鲜的Sf-900 II培养基传代并稀释细胞培养物。 
	注意：健康 细胞应大小均一，呈球形。</li>
	<li>使用血细胞计数板和光学显微镜对样品体积中的细胞进行计数，以计算培养物的细胞密度。</li>
</ol>
2. 重组杆状病毒的制备
<ol>
	<li>使用添加了100 μg/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的Sf-900 II培养基悬浮培养并维持Sf9细胞。用于杆状病毒生成时，昆虫细胞应培养至密度范围为5 × 105 – 1 × 106 个细胞/ml。</li>
	<li>在无菌6孔组织培养板中，每孔接种约1 × 106 个Sf9细胞，加入2 ml添加了100 μg/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的Sf-900 II培养基。将Sf9细胞置于超净台中室温下静置，使其贴附于塑料孔底部，形成单层细胞。</li>
	<li>通过将杆粒DNA与质粒DNA共转染至单层细胞中，进行重组杆状病毒的生成。
	<ol>
		<li>每次转染时，将1–2 μg纯化的含有ORF1629杆状病毒元件的pOPINE-mFERMT3质粒DNA与0.5 μg纯化的BAC10KO:1629在100 μl不含抗生素的Sf-900 II无血清培养基中混合（溶液A）。</li>
		<li>另取一管，每次转染用6 μl Cellfectin II试剂与100 μl不含抗生素的Sf-900 II无血清培养基稀释（溶液B）。若需进行多次转染，可在此配制“主混合液”，以减少液体操作步骤。</li>
		<li>将上述两种溶液（A和B，总体积约200 μl）混合，在室温下孵育20分钟，以形成脂质-DNA复合物。</li>
		<li>用800 μl不含抗生素的Sf-900 II无血清培养基稀释脂质-DNA复合物。小心吸除Sf9单层细胞中的培养基，然后将溶液A/B与培养基轻柔地加至Sf9单层细胞表面。</li>
		<li>将转染后的细胞置于27 °C恒温湿润培养箱中过夜孵育，次日向每孔单层细胞中再添加1 ml不含抗生素的Sf-900 II无血清培养基。继续在27 °C下孵育细胞5天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>直接从培养基中收集重组杆状病毒（总体积约2 ml），转移至洁净的离心管中（例如15 ml Falcon管）。
	<ol>
		<li>在室温下以1,000 × g离心5分钟，去除Sf9细胞碎片。将上清液中的病毒（记为P1代）转移至洁净管中，避光保存于4 °C，待后续使用。此时可利用剩余的Sf9单层细胞，通过检测昆虫细胞中是否存在重组kindlin-3蛋白来评估重组病毒的生成情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用0.5 ml PBS重悬单层细胞，取10 μl样品与等体积的2× SDS-PAGE上样缓冲液混合。在>95 °C加热至少10分钟。
	<ol>
		<li>若样品过于黏稠而不利于凝胶上样，可使用微探头超声仪在10%振幅下超声1秒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 重组杆状病毒的扩增
<ol>
	<li>悬浮培养扩增病毒时，使用 1.4 × 106 个细胞/ml 的细胞密度，培养体积应占总培养瓶体积的 1/20（即 2 L 培养瓶中加入 50 ml 培养液）。</li>
	<li>通过以感染复数（MOI）为 0.1 的 P1 病毒原液感染昆虫细胞培养物来实现重组病毒的扩增，计算公式如下： 
	<img alt="细胞培养实验中病毒滴度的接种量计算公式示意图" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51206/51206eq1.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000"> 
	注意：可假设 P1 病毒的预期病毒滴度为 1 × 107 pfu/ml。但在此步骤前也可进行空斑实验以测定实际滴度。</li>
	<li>将接种 P1 病毒的昆虫细胞培养物在 27 °C、100 rpm 振荡条件下培养 3 天（72 小时）。</li>
	<li>通过在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟，将细胞与培养基分离，收集病毒。此步骤中保留的细胞沉淀可用于后续通过 SDS-PAGE 和蛋白质印迹法检测 kindlin-3 蛋白表达，以确认重组病毒的产生。</li>
	<li>将澄清后的富集病毒培养基转移至洁净离心管中，避光保存于 4 °C，待后续使用。此病毒原液记为 P2。 
	注意：预期病毒滴度可达 2 × 108 pfu/ml（或扩增效率为 100 pfu/细胞）。</li>
</ol>
4. 杆状病毒感染Sf9细胞中kindlin-3的表达
<ol>
	<li>在补充有 Sf-900 II SFM 的悬浮培养基中培养足量的 Sf9 细胞 100 μg/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素，用于大规模重组kindlin-3表达纯化前。将悬浮培养物置于 27 °C 以100 rpm振荡培养，总体积与摇瓶体积比为1:5。</li>
	<li>以 2 x 10⁶ 个细胞/mL 的密度感染 Sf9 悬浮培养物6 cells/ml</li>
	<li>向Sf9细胞培养物中添加胎牛血清（FBS），使其终浓度为1%（v/v），随后加入扩增后的重组病毒（P2代病毒原液），使感染复数（MOI）为1。将感染后的培养物在 27 °C 以100 rpm振荡培养。</li>
	<li>收获重组 kindlin-3-CHIS6感染后72小时，通过1,000 × g离心收集表达Sf9细胞 -20°C 冻存所得的细胞沉淀20 °C 直至使用，或 -80 °C 用于长期储存。</li>
</ol>
5. 重组Kindlin-3的纯化
<ol>
	<li>在冰上解冻表达重组kindlin-3的冻存杆状病毒感染昆虫细胞（Sf9）沉淀。</li>
	<li>用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，500 mM NaCl，1% (v/v) Tween-20）重悬解冻后的细胞沉淀，并加入无EDTA蛋白酶抑制剂混合物以及1,000–2,000 U的DNase1。 
	注意：也可使用改良的磷酸盐缓冲液（PBS），其中NaCl浓度调整至500 mM，以防止内源性Sf9细胞蛋白与下游纯化所用的固定化金属亲和柱之间发生非特异性相互作用（见下文）。</li>
	<li>通过将重悬细胞与去污剂混合并涡旋振荡来裂解细胞。在冰浴中进行超声处理（40% 振幅，10秒脉冲后冷却10秒，重复10个循环）以进一步破碎细胞，或 alternatively 使用Dounce匀浆器。</li>
	<li>在4 °C条件下以48,000 × g离心1小时澄清裂解物。将上清液以1 ml/min的流速加载至预先用裂解缓冲液平衡的HisTrap柱（5 ml柱体积），并在4 °C下进行纯化。 
	注意： alternatively，可将澄清裂解物与1–5 ml预平衡的镍-Sepharose珠（e.g. Ni Sepharose 6 fast flow）在4 °C下孵育1–2小时。结合步骤后可通过重力流柱形成Ni-Sepharose柱。</li>
	<li>用洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，500 mM NaCl，10 mM咪唑）洗涤柱子10个柱体积，以去除未结合的蛋白质。</li>
	<li>使用Äkta FPLC以10 mM/ml（或在10个柱体积内）的速率建立10–500 mM咪唑线性梯度，洗脱结合的重组kindlin-3-CHIS6。</li>
	<li>使用Äkta FPLC将洗脱液分部收集为0.5–1 ml的组分，含kindlin-3-CHIS6的组分通常在咪唑浓度为300 mM时洗脱。</li>
	<li>通过SDS-PAGE分析洗脱液中的蛋白质组成，并在首次纯化时使用抗-His6抗体或抗小鼠kindlin-3抗体通过Western blotting进行确认。</li>
	<li>合并含kindlin-3的组分，并通过一系列缓冲液稀释和使用截留分子量为50 kDa（MWCO）的离心式蛋白浓缩器在4 °C下进行样品浓缩，置换缓冲液至20 mM Tris-HCl，pH 7.5，200 mM NaCl。 
	注意： alternatively，可使用截留分子量为30 kDa的Slide-A-lyzer透析盒在4 °C下对蛋白溶液进行透析，持续4小时至过夜，缓冲液为20 mM Tris-HCl，pH 7.5，200 mM NaCl。 
	注意：对于离子交换（见下文），此步骤可使用较低浓度的NaCl，i.e. 50 mM。</li>
	<li>将缓冲液置换后的蛋白溶液以0.5 ml/min的流速通过Äkta FPLC加载至预先平衡的HiTrap肝素HP柱（5 ml柱体积）。 
	注意：结合的kindlin-3使用相同缓冲液中的线性NaCl梯度（0.2 M NaCl至1 M NaCl）洗脱，梯度上升速率为10 mM/ml。预计kindlin-3-CHIS6在约0.6 M NaCl时洗脱。</li>
	<li>将洗脱液分部收集为0.5–1 ml组分，并通过SDS-PAGE和Western blotting分析蛋白组成（如适用）。 
	注意：通过SDS-PAGE评估，预计蛋白纯度接近95%。</li>
	<li>合并含kindlin-3的组分，并使用截留分子量为50 kDa的离心式蛋白浓缩器浓缩至终体积0.5–2 ml。</li>
	<li>最后一步，通过尺寸排阻色谱（SEC）对浓缩蛋白进行精制并置换缓冲液。
	<ol>
		<li>将纯化后的蛋白以1 ml/min或0.5 ml/min的流速（取决于所用柱尺寸）加载至预先在20 mM Tris-HCl，pH 7.5，200 mM NaCl，1 mM DTT中平衡的Superdex S200（16/60）或（10/30）柱。 
		注意：如需要，尺寸排阻色谱也可在磷酸盐缓冲液（PBS）中进行。</li>
		<li>根据所用柱尺寸，以1 ml/min或0.5 ml/min的流速将缓冲液加载至柱子，按分子大小分离蛋白。 
		注意：通过280 nm处的吸光度监测从柱中洗脱的蛋白，并进行分部收集。</li>
		<li>SEC应出现单一吸光峰，将其分部收集并通过SDS-PAGE评估均一性，此步骤后蛋白纯度通常&gt;95%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用截留分子量为50 kDa的离心式蛋白浓缩器将纯化的kindlin-3-CHIS6浓缩至约15 mg/ml，通过分光光度法测定，使用计算的消光系数（ε）109,320 M-1 cm-1（假设所有半胱氨酸残基均处于还原状态）。</li>
	<li>为在-20 °C储存及长期保存于-80 °C，将蛋白分装至PCR管中并在液氮中速冻。 alternatively，蛋白可直接用于多种生物化学和生物物理技术的研究。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

杆状病毒表达系统正变得越来越流行，成为利用生物物理研究（包括X射线晶体学）进行蛋白质表征时生产毫克级重组蛋白的重要工具。尽管杆状病毒表达系统的实验操作更为复杂，但与大肠杆菌（E. coli）系统相比具有多项优势，其中之一是为真核来源的蛋白质提供了接近天然的表达环境，例如存在适当的分子伴侣以及进行翻译后修饰的可能性。例如，在我们尝试表达kindlin-3的过程中，曾使用过其他表达宿主，包括哺乳动物细胞系和细菌表达菌株（未发表观察结果）。通常，测试的多种E. coli菌株产生的重组kindlin-3量极低（约0.5 mg/L培养液；未发表观察结果）。然而，利用杆状病毒在昆虫细胞中驱动的表达效果尤为显著，与哺乳动物细胞的瞬时表达相比，更易于获得大量生物量，从而分离出毫克级的重组胞质蛋白（未发表观察结果）。我们推测，真核分子伴侣的存在可能有助于高效生产kindlin-3。
杆状病毒科（baculoviridae）可感染昆虫细胞，本研究中用于重组蛋白表达的杆状病毒基于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV）。在自然界中，AcNPV感染苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica，即苜蓿夜蛾）的幼虫，依赖多角体蛋白形成包涵体，使病毒粒子被包裹在结晶状的蛋白质基质中，从而在释放过程中获得必要的保护。在培养细胞中，包涵体的形成并非病毒复制所必需，因此该功能是可有可无的。在表达外源蛋白的情况下，可在重组AcNPV中用目标蛋白的基因替换多角体蛋白基因。AcNPV还可感染其他鳞翅目昆虫，为实现重组蛋白表达，通常使用草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）蛹期卵巢细胞。在本文所述的方法中，AcNPV杆状病毒基因组（bacmid，BAC10）经过基因工程改造，使一个关键的病毒基因ORF1629因插入氯霉素乙酰转移酶基因而失活，从而获得敲除型杆粒（knock-out bacmid，BAC10:KO1629），使其无法形成具有感染性的杆状病毒粒子28。将线性化的BAC10:KO1629与含有FERMT3基因的转移载体共同转染Sf9细胞后，通过转座作用修复失活的ORF1629基因，从而产生具有复制能力的完整基因组，同时将FERMT3基因插入并在多角体蛋白启动子的调控下实现表达28。
我们描述了一种通过三步层析法纯化高纯度重组小鼠kindlin-3的纯化方案。此处使用的方法可轻松应用于其他带有His标签的蛋白质。我们采用离子交换步骤对kindlin-3进行进一步纯化，但我们认为这实际上是一种伪亲和层析步骤，因为kindlin-3含有大量碱性残基，包括其F1结构域内的多聚赖氨酸片段。此外，kindlin-3被认为可结合并相互作用于其发挥功能的质膜胞质面，因此我们推测这些碱性残基的聚集将使该蛋白质能够中和带负电荷的膜。
纯化方案中所述的缓冲液被视为标准缓冲液，常用于结构生物学。热移位分析（thermofluor assay）图&#160;5) 表明kindlin-3在其中是稳定的&#160;pH 6.0 以上的大多数缓冲条件。这在研究 kinldin-3:β1 时对指导我们的实验尤其有用且重要A 通过核磁共振（NMR）研究尾部相互作用，在 pH 6.1 且低浓度 NaCl 条件下获得了优质的谱图12.
在开展任何生物物理研究之前，必须证明所纯化的目标蛋白确实正确折叠且具有功能活性。在之前的一项研究中，我们证明了通过本方法表达和纯化的重组kindlin-3在溶液中为单体且单分散，这一结论基于尺寸排阻色谱、动态光散射、分析型超速离心以及小角X射线散射的结果；此外，该蛋白还能够结合并识别β1A胞内尾部的膜远端NPxY基序及其上游的丝氨酸/苏氨酸簇14，从而证实其行为与天然蛋白一致，这与先前的细胞和生理学研究结果相符14,20,22。使用热稳定性检测是另一种用于推断目标蛋白是否正确折叠的方法&#160;，因为错误折叠的蛋白会因暴露出疏水残基而导致荧光背景升高。
kindlin 蛋白家族因其作为整合素必需共激活因子的意外作用而受到广泛关注 体内 被发现。这促使人们投入大量努力以重组方式表达这些蛋白并解析其结构。迄今为止，关于表达毫克量级全长重组蛋白的成功报道仍十分有限，但本文中我们描述了一种杆状病毒系统，可实现大规模表达，表达量足以支持结构研究的开展。通过大量制备重组小鼠kindlin-3，我们预期这将有助于对该蛋白的进一步研究。本文所述的由杆状病毒驱动的表达方法及纯化流程也可用于表达和纯化其他kindlin亚型，这些亚型同样难以表达且含有多个赖氨酸序列；此外，该系统还可进一步改造用于表达在细菌菌株中无法表达的其他胞质蛋白，例如核酸结合蛋白。

kindlin 家族蛋白是黏着斑组装的关键组分，因此对复杂生命至关重要。在哺乳动物中，kindlin 有三种亚型（kindlin-1、kindlin-2 和 kindlin-3），与 talin 一起被认为是细胞外受体整合素的共激活因子1。在高等真核生物中，整合素介导的细胞黏附将细胞表面与细胞外基质（ECM）连接起来。这一过程在多种生理现象中起着关键且普遍的作用，包括组织完整性、胚胎发生、骨代谢、止血和免疫。整合素介导的细胞黏附通过“由内而外”信号转导被激活，该过程依赖于 talin 和 kindlin 与整合素 β 亚基胞质尾区（CTs）上保守的 NPxY 模序结合。然而，kindlin 蛋白的生物医学重要性甚至延伸至细胞核，近年来多项研究已表明 kindlin-2 参与了转录调控2,3。
Kindlin 是一类多结构域蛋白，分子量约为 75 kDa，其特征是具有一个被中断的双部分 C 末端 FERM（4.1 蛋白、ezrin、radixin、moesin）结构域，该结构域在其 F2 亚结构域中央被一个 Pleckstrin 同源（PH）结构域所插入&#160;4,5。对 Kindlin-2 和 Kindlin-3 的 PH 结构域研究表明，它们可结合脂质第二信使磷脂酰肌醇-(3,4,5)-三磷酸和磷脂酰肌醇-(4,5)-二磷酸6-8。然而，对 Kindlin-1 PH 结构域的研究显示，其与 PtdIns(3,4,5)P3 的结合亲和力显著较低，这一现象可通过 Kindlin-1 中一种亚型特异性的盐桥结构来解释，该盐桥阻碍了脂质的结合9。此外，Kindlin 蛋白的 F1 结构域中插入了一个约 100 个氨基酸长度的环状区域，预测该区域处于未折叠状态，但能够结合质膜内小叶中的磷脂酰丝氨酸10,11。Kindlin 的 FERM 结构域被认为与 Talin 的 FERM 结构域同源，尽管 Talin 的 FERM 结构域不含有 Pleckstrin 同源结构域。Kindlin 和 Talin 均通过其 FERM 结构域中的 F3 区域与整合素 β 尾部的 NPxY 模体相互作用，但 Kindlin 结合的是远离膜的模体，而 Talin 则靶向靠近膜的模体12-16。此外，Kindlin 和 Talin 均具有一个位于 N 末端的 F0 结构域，该结构域具有类泛素折叠结构，而这一结构在其他 FERM 蛋白中并不存在11,17。对 Kindlin-2 的 F0 结构域研究显示，该结构域能够独立地结合富含磷脂酰肌醇-(4,5)-二磷酸的膜结构17。
Kindlin 蛋白家族表现出旁系同源物特异性的组织表达模式和非冗余的生理功能。Kindlin-1 主要在表皮中表达，但在结肠、胃和肾脏中也有一定程度的表达；Kindlin-2 广泛表达，但在横纹肌和平滑肌中富集，且是胚胎发育过程中唯一表达的 Kindlin 蛋白4；Kindlin-3 则在造血组织中表达，其中在巨核细胞中的浓度最高18。然而，最近的研究表明，功能性 Kindlin-3 蛋白在内皮组织中也有表达19。
Kindlin-3 因其在血液中的重要生理作用而受到医学界的广泛关注。它在血栓形成过程中对血小板的聚集和铺展至关重要20，在感染和炎症反应中影响白细胞的滚动21,22，并在骨吸收过程中参与破骨细胞足突的形成23。此外，人类 Kindlin-3 的缺失会导致白细胞黏附缺陷症 III 型——一种以危及生命的出血性疾病和反复细菌感染为特征的疾病20,24,25。在小鼠中进行的 Kindlin-3 基因敲除研究表明该蛋白在细胞黏附中的关键作用。KIND3-/- 小鼠表现出明显的表型，例如由于血小板整联蛋白失活导致的严重出血、严重的骨硬化症以及白细胞黏附功能受损20,22，这些症状与缺乏 Kindlin-3 的人类患者表现相似。
迄今为止，关于kindlin蛋白的高分辨率结构数据仅限于个别亚结构域，例如kindlin-19和kindlin-226,27的pleckstrin同源（PH）结构域，以及kindlin-111和kindlin-217的F0结构域。然而，每种kindlin多肽的大多数亚结构域在克隆和结构分析方面均存在困难（Yates和Gilbert未发表的观察结果），而全长蛋白的研究也因难以利用E. coli表达并纯化出足够量的蛋白而受到阻碍（未发表的观察结果及Harburger&#160;et al.14）。目前医学界对kindlin-3及其功能，以及该家族其他两个成员的功能具有广泛兴趣。近期，我们通过杆状病毒介导的Spodoptera frugiperda细胞重组表达，成功获得了毫克级的kindlin-3蛋白12。因此，本文描述了在昆虫细胞培养体系中生产毫克级重组小鼠kindlin-3的方法，适用于深入的结构研究和生物化学分析。
在本方案中，我们使用了一种经基因工程改造的敲除型杆状病毒基因组（BAC10KO:1629) 即单独存在时，无法产生具有感染性的病毒颗粒28因此，病毒DNA通过与转移载体发生重组而被拯救，该转移载体在此情况下还包含kindlin-3基因（FERMT3）并导致结果 FERMT3 基因替换病毒的极晚期基因，该基因高度表达但具有冗余性，从而获得一种重组病毒，其在病毒生命周期中表达小鼠kindlin-328. 我们采用此方法生产kindlin-3，是由于此前尝试在其他表达宿主中表达并纯化该蛋白均遇到难以克服的困难（未发表观察结果），同时也得益于pOPIN载体系列的多功能性。我们使用该载体进行克隆，其可应用于多种表达宿主。29.

<table><tbody><tr><td>Sf-900 II 无血清培养基（SFM）1× 液体</td><td>Life Technologies</td><td>10902-096</td><td>4 &amp;deg;C 保存，使用前恢复至室温</td></tr><tr><td>Cellfectin II 转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>也可使用 GeneJuice 转染试剂（EMD）</td></tr><tr><td>硫酸链霉素（固体）</td><td>Melford</td><td>S0148</td><td>使用前经 0.22 &amp;mu;m 滤膜过滤除菌</td></tr><tr><td>青霉素 G 钾盐（固体）</td><td>Melford</td><td>P0580</td><td>使用前经 0.22 &amp;mu;m 滤膜过滤除菌</td></tr><tr><td>CELLSTAR 无菌 6 孔培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Life Technologies</td><td>10100-147</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>P8849</td><td>注意：蛋白酶抑制剂溶于 DMSO</td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase）I&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap FF（5 ml）</td><td>GE Heathcare</td><td>17-5286-01</td><td>需使用 &amp;Auml;kta FPLC 仪器</td></tr><tr><td>HiTrap 肝素柱（5 ml）</td><td>GE Heathcare</td><td>17-0407-01</td><td>需使用 &amp;Auml;kta FPLC 仪器</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心过滤装置（含 Ultracel-50 膜）</td><td>Millipore</td><td>UFC905024</td><td>15 ml 容量，截留分子量为 50 kDa 的蛋白浓缩器</td></tr></tbody></table>

高效生产与纯化用于生物物理研究的重组小鼠kindlin-3蛋白（源自昆虫细胞）

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins 是细胞表面受体的重要共激活因子，与 talin 协同作用&#160;整合素还参与整合素的外向内信号传导以及细胞核内基因转录的调控。Kindlin 蛋白是分子量约为 75 kDa 的多结构域蛋白，可结合整合素 β 亚基胞内尾部的 NPxY 基序及其上游的 T/S 富集区。在造血系统中具有重要意义的 kindlin 亚型 kindlin-3，对于血栓形成过程中的血小板聚集、感染和炎症反应中的白细胞滚动以及骨吸收过程中破骨细胞足突的形成均至关重要。kindlin-3 在这些生理过程中的作用已促成了大量细胞和生理学研究。然而，目前仍亟需一种高效的方法以获得高质量、毫克级数量的该蛋白，用于进一步研究。本文中，我们建立了一种高效表达和纯化重组小鼠 kindlin-3 的实验方案，该方法利用杆状病毒表达系统在 Sf9 细胞中进行表达，能够获得足量高纯度的全长蛋白，从而支持其生物物理特性表征。该策略同样适用于其他哺乳动物 kindlin 亚型的研究。

使用杆状病毒感染的 Sf9 细胞大规模表达重组小鼠 kindlin-3 可在不到两周的时间内获得毫克级蛋白，如示意图图 1A所示，且仅需少量来自 QIAprep Miniprep 试剂盒的质粒 DNA。重组杆状病毒的制备通过将含有小鼠 kindlin-3（FERMT3）的质粒与经改造的线性化杆粒（BAC10:KO1629）共转染至 Sf9 细胞中实现，并在转染后 5–7 天收集新形成的病毒颗粒，如图 1A所示。该杆状病毒构建方法可获得 100% 的重组病毒，基本无需进行噬斑纯化28,30。一次典型的微小规模（2 ml 单层培养）可产生含重组病毒的溶液，预期病毒滴度为每毫升 1 × 107 噬斑形成单位（pfu）。可通过噬斑实验测定实际病毒滴度，但当需对大量构建体进行结构研究时，该方法可能过于耗时。病毒生成步骤的成功与否可通过平行使用含 eGFP 的质粒进行验证；或针对该 kindlin-3 构建体，将 Sf9 单层细胞重悬于 PBS 中，通过 SDS-PAGE 和 Western 印迹检测，通常可见一条对应于 75 kDa 带 His 标签蛋白的清晰条带，如图 1B所示。随后将病毒扩增，以获得足够量用于大规模（升液体积）昆虫细胞感染及重组蛋白纯化。第二代病毒（P2）通过以约 0.1 的感染复数（MOI）感染悬浮培养物制备（见实验方案）。至关重要的是，用于扩增的 Sf9 悬浮培养物体积不得超过培养瓶总容积的二十分之一。额外的通气条件可确保在感染后 3 天（72 小时）收获的含病毒培养基能在后续表达培养中产生足量的 kindlin-3。根据扩增过程中细胞密度为 2 × 106 个细胞/ml、每个细胞保守估计释放 100 个 pfu 的推算，扩增后的病毒原液（P2）预期病毒滴度为 2 × 108 pfu/ml31。通常情况下，为实现最佳的杆状病毒扩增和蛋白表达，Sf9 细胞应大小均一且呈球形，如图 1C所示。此外，病毒感染后 72 小时为病毒扩增和蛋白表达的峰值期，而至 96 小时后两者均显著下降。
一旦病毒经扩增并用于大规模实验中感染Sf9细胞，即可利用其设计的C端His标签对重组kindlin-3进行部分纯化6-标签，通过固定化金属亲和层析实现，如图所示 图2. 纯化步骤必须在 4 °C 并且已添加足够的蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。通过肝素柱离子交换色谱法（IEC）进一步纯化部分纯化的kindlin-3，使其达到接近均一，如图所示 图 3我们采用肝素柱而非传统的离子交换柱，因为我们预测，kindlin-3 F1结构域内含有大量碱性残基，包括一段多聚赖氨酸序列，会与柱材料上带负电荷的硫酸基团发生强烈相互作用。该策略对于含有碱性核酸结合区域的DNA和RNA结合蛋白尤为适用，例如RNA结合性末端尿苷酸转移酶Cid1。32最后，通过尺寸排阻色谱法对kindlin-3纯度进行“精制”，以去除聚集体并实现均一性，如图所示。 图4. 本方案中指定的缓冲液是蛋白质纯化用于结构分析时常用的标准化缓冲液。通常，在用于结构研究（尤其是结晶筛选）的蛋白质纯化过程中，应避免使用磷酸盐类缓冲液，因为其会在结晶液滴中形成磷酸盐晶体（特别是在某些实验条件下尤为明显）。 4 °C）。然而，我们进行了基于Thermofluor的热 shift 测定，以确定哪些缓冲液对kindlin-3具有稳定作用，如图所示 图 5简言之，将纯化的蛋白质溶液稀释至涵盖一系列pH值和氯化钠浓度的缓冲液中，从而形成二维筛选体系。通过检测Sypro Orange染料（Molecular Probes）的荧光信号来测定蛋白质的熔解行为，该染料可结合折叠蛋白质核心中的疏水残基，在20–90 °C的温度范围内监测其荧光变化。95 °C （293-368 K）。蛋白质发生解折叠的温度中点（相变温度，Tm) 使用以下方法计算： Opticon Monitor 软件，其具体描述见其他文献33Kindlin-3 在 pH 7.0–9.0 范围内于高氯化钠浓度（500 mM）下表现出稳定性，且变性温度（Tm) 的 55 °C. 还观察到 Tm Kindlin-3 的表达量约为 55 °C 在 pH 7.0–7.5 范围内，无论氯化钠浓度如何。
我们发现，在纯化过程中 kindlin-3 发生了有限的蛋白水解，但对高浓度蛋白（~15 mg/ml）进行 SDS-PAGE 分析显示，存在两条额外多肽链的污染，其条带强度相等。然而奇怪的是，如图 4所示，尺寸排阻色谱并未显示出其他组分的存在迹象。因此推测，该蛋白可能被蛋白酶切割而产生切口，但仍保持折叠状态，在流体动力学性质上与全长蛋白无法区分。有趣的是，钙蛋白酶（Calpain）是一种已知可切割 kindlin-3 的蛋白酶，其切割位点为 Pleckstrin 同源（PH）结构域 β1-β2 环中的酪氨酸373（Tyrosine373）34，这或许可以解释我们的观察结果。此外，Western 印迹结果显示，其中一条多肽双峰具有 C 末端 His 标签，且该双峰的表观分子量之和为 75 kDa，与天然蛋白的分子量相同。每升 Sf9 细胞（约 2 g 细胞湿重）所获得的纯化重组 kindlin-3 蛋白产量最多为 5 mg。
<img alt="Baculovirus protein production diagram, gel electrophoresis results, and Sf9 cells microscope image." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 杆状病毒感染的昆虫细胞异源蛋白表达概述。 (A杆状病毒在Sf9细胞中生成及kindlin-3表达的示意图。在DNA载体示意图中，5'UTR/ORF603以红色表示，ORF1629以绿色表示，目的蛋白（P.O.I.）基因以蓝色表示。B) Western blot，使用抗 His 抗体6 抗体，来自六种小规模（2 ml 单层）Sf9 细胞培养物（根据培养物标记泳道），这些细胞产生重组杆状病毒和重组小鼠 kindlin-3。 (C) 健康Sf9细胞在添加抗生素的Sf-900 II SFM培养基中悬浮培养后转移至35 mm孔组织培养皿（见实验方案）的明场显微镜图像。图像放大倍数为20倍。
<img alt="SDS-PAGE 蛋白质纯化结果；咪唑洗脱梯度；分子量标记物。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 通过固定化金属亲和层析（IMAC）纯化kindlin-3的代表性结果。 对在杆状病毒感染的Sf9细胞中表达的镍亲和纯化的重组小鼠kindlin-3进行SDS-PAGE分析（细胞湿重约2 g）。吸附的蛋白质使用咪唑梯度进行洗脱（凝胶上方所示）。泳道标注如下：MW，分子量标记物；Lys，全细胞裂解液；FT，流穿组分（未结合）；WI，洗涤1；WII，洗涤2。同时对洗脱组分进行下方所示的蛋白质印迹分析（Western blot），以确认重组蛋白上存在设计的His标签。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="蛋白质纯化层析结果；Abs\(_{280nm}\)，电导率图；SDS-PAGE 分析。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 肝素亲和层析法纯化 kindlin-3 的代表性结果。（A）在280 nm处（蓝色）观察到的洗脱曲线，显示在0.05–1.0 M NaCl浓度范围内，使用线性氯化钠梯度（绿色）洗脱时出现单一的对称峰。（B）分段洗脱组分的SDS-PAGE分析，显示存在75 kDa的蛋白质kindlin-3（标注为K3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="尺寸排阻色谱结果；吸光度与体积关系图；蛋白质分子量分析。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 典型的凝胶过滤层析及浓缩的kindlin-3。 （A）在20 °C条件下，使用Superdex S200（16/60）柱在Tris-HCl缓冲液（pH 7.5，含150 mM NaCl和1 mM DTT）中纯化的kindlin-3的凝胶过滤洗脱曲线。根据洗脱体积，kindlin-3的迁移行为符合分子量约为75 kDa的蛋白质特征，表明其主要以单体形式存在。（B）高浓度纯化的重组kindlin-3的SDS-PAGE分析，蛋白浓度为14.5 mg/ml。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="热稳定性分析；Tm 与 NaCl、pH 的关系；温度影响；柱状图；科学数据。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 基于Thermofluor的热迁移分析用于缓冲液筛选。 将Kindlin-3稀释至多种缓冲液中，进行pH值与氯化钠浓度的二维筛选。通过疏水结合染料Sypro Orange（Molecular Probes）的荧光变化检测转变温度（温度中点），并使用Opticon Monitor软件进行计算。(A) 转变温度的三维柱状图，与(B) 相对于计算平均值50.4 °C的转变温度变化量一同展示。为便于区分，柱体根据其所对应的温度范围进行着色。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

Kindlin 家族蛋白在整合素介导的细胞黏附中起着基础性作用，但其研究一直受到在细菌宿主中重组表达困难的限制。本文介绍了利用杆状病毒感染的昆虫细胞高效生产 Kindlin 蛋白的方法。

高效生产与纯化用于生物物理研究的重组小鼠Kindlin-3蛋白（源自昆虫细胞）

Kindlins 是细胞表面受体整合素（integrins）的必要共激活因子，与talin协同作用，同时也参与整合素的外向内信号转导，以及……

以下实验的总体目标是利用昆虫细胞培养系统高效地生产毫克级的Miran Kinlin 3蛋白，该蛋白无法在其他表达宿主中获得。该目标通过共转染实现：将携带KINLIN 3基因的转移载体与经改造的杆状病毒骨架（bao virus bacmid）共同导入细胞，从而构建出含有KINLIN 3基因的重组杆状病毒。第二步，利用昆虫细胞扩增该病毒，以获得足够数量的病毒粒子用于后续实验。接下来，感染昆虫细胞以大量表达Kinlin三号蛋白，从而通过快速液相色谱法进行纯化。实验结果表明，基于SDS-PAGE分析和尺寸排阻色谱，可获得毫克级产量的高纯度、具有功能活性的Kinlin三号蛋白。该方法相较于现有技术（如在细菌中表达Kinlin三号蛋白）的主要优势在于，杆状病毒感染的昆虫细胞表达系统可使重组蛋白产量提高十倍。本实验所用的SF九细胞系采用添加了100微克/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的SF 902培养基进行悬浮培养和维持。用于产生bao病毒时，细胞应培养至密度为5×10⁵至1×10⁶个细胞/毫升的范围。为转染准备SF九细胞时，将约1×10⁶个细胞接种至无菌六孔组织培养板的每一孔中，每孔加入2毫升含青霉素和链霉素的SF 902培养基，在生物安全柜中室温静置约20分钟，使SF九细胞贴附于塑料孔底部，形成单层细胞。重组balo病毒的生成是通过将质粒DNA与BMid DNA共转染至单层SF九细胞培养物中实现的。表达载体 papine 神经元 firm T 三含有小鼠 KINLIN 三基因 firm T 三。该载体在 P 10 BAO 病毒启动子控制下，具有侧翼的 bao 病毒序列，可与 back mid 发生重组，并编码一个 C 端 hiss 六标签，用于后续纯化。每次转染使用 1 至 2 微克纯化的 MFI T 三、0.5 微克纯化的 B mid 以及 100 微升不含抗生素的 SF 902 SFM。此为溶液 A。在另一支试管中，将六微升细胞效应转染试剂用 100 微升不含抗生素的 SF 902 SFM 稀释。若需进行多次转染，可在此为每组转染反应配制总混合液，以减少液体操作步骤。此为溶液B。每转染反应取约200微升的溶液A与溶液B混合，在室温下孵育20分钟，以形成脂质体-DNA复合物。20分钟后，每转染反应加入800微升不含抗生素的SF 902 SFM培养基稀释脂质体-DNA复合物。随后，小心吸除SF nine细胞单层的培养基，并小心将AB溶液与培养基的混合液滴加至SF nine细胞单层表面。将转染后的细胞置于27°C、加湿的培养箱中孵育过夜，以创造加湿环境，防止细胞干燥。将六孔板放入塑料容器中，并放置一张湿润的纸巾。次日，向每孔单层培养细胞中加入额外1毫升不含抗生素的SF 900培养基，继续在27°C下孵育5天。五天后，直接从培养基中收获重组杆状病毒，并转移至洁净的离心管中。在室温下，以1000 ×g离心5分钟，以去除SF9细胞碎片，将上清液转移至新的洁净管中，此上清液记为P1代病毒。可认为P1代病毒的病毒滴度约为1×10⁷ PFU/mL。如有需要，可进行噬斑SA检测，但应将P病毒储备液在避光条件下于4摄氏度保存，直至使用。用于悬浮培养扩增重组balo病毒的SF九细胞，其密度应为每毫升1.4×10⁶个细胞，培养液体积应占培养瓶总体积的二十分之一，例如，在2升培养瓶中加入50毫升培养液。通常，为获得最佳的vao病毒扩增效果和蛋白表达产量，SF九细胞应大小均一且呈球形。使用以下公式，以感染复数（MOI）为0.1的P1病毒原液感染SF9细胞培养物。将感染P1病毒的昆虫细胞培养物在27摄氏度、100 RPM振荡条件下孵育72小时。三天后，通过在1000 ×g下离心5分钟，将细胞与培养基分离，收集病毒。在室温下转移澄清的病毒富集培养基至洁净离心管中。该病毒原液记为P2，预期病毒滴度为2 × 10⁸ PFU/mL。将该病毒原液避光保存于4°C，直至使用；将获得的细胞沉淀物保存于-20°C，用于后续重组病毒产生的验证。开始此实验步骤时，需在悬浮培养基 SF 902 s fm 中培养足量的 SF nine 细胞，培养基中添加 100 微克/毫升 青霉素和 100 微克/毫升 链霉素。总体积与培养瓶体积的比例应为 1:5。将悬浮培养物在27摄氏度、100转/分钟振荡条件下培养，直至细胞密度达到2×10⁶个细胞/毫升。当SF9细胞培养物达到2×10⁶个细胞/毫升的密度时，即可用于杆状病毒感染。向培养物中补充胎牛血清至终浓度为1%，随后加入P2代病毒原液。为了达到感染复数（MOI）为1的条件，将感染后的培养物在27摄氏度、100 RPM振荡条件下继续培养。感染后72小时，通过在室温下以1000 ×g离心20分钟，收获表达重组多聚组氨酸标签Lin3的SF9细胞。将获得的细胞沉淀在-20摄氏度下保存备用，或在-80摄氏度下长期保存。该操作程序从冰上解冻开始。将感染了vao病毒并表达重组kinlin three的SF九细胞的冷冻沉淀用裂解缓冲液重悬。将重悬的细胞与裂解缓冲液在5至10分钟内孵育，涡旋振荡直至形成均匀的重悬液，以进一步破坏细胞。在冰浴中对样品进行超声处理。在 4°C 条件下，以 48,000 ×g 离心一小时，澄清裂解液。将所得上清液以每分钟 1 毫升的流速上样至预先用 4°C 裂解缓冲液平衡的 5 毫升体积组蛋白捕获柱（hist trap column）中。后续的蛋白洗脱、缓冲液置换及蛋白浓缩步骤在此不作展示，详见随附的手稿。获得缓冲液置换后的蛋白质溶液后，使用 ACTA FPLC 以每分钟 0.5 毫升的流速，将其上样至预先平衡的 5 毫升体积 High Trap Heparin HP 柱。使用相同缓冲液中线性递增的氯化钠梯度洗脱结合的 KINLIN 3，氯化钠浓度梯度上升速率为每毫升 10 毫摩尔，重组组蛋白标签蛋白。预计 KINLIN 3 在约 0.6 摩尔氯化钠浓度下被洗脱。蛋白质浓缩后，最后一步是通过尺寸排阻色谱进行缓冲液置换：将纯化的蛋白质上样至 SUEx S 210 30 柱，以每分钟 0.5 毫升的流速将缓冲液注入柱中，根据蛋白质分子大小进行分离纯化。从层析柱洗脱的蛋白质通过在280纳米波长下检测吸光度进行分段收集和监测。通过SDS-PAGE和Western印迹分析检测重组KINLIN3蛋白以及共转染的SF9细胞中是否存在目标蛋白，以验证重组病毒的生成是否成功。如本图所示，使用抗His6抗体对六份小规模培养的SF9细胞进行代表性Western印迹分析，结果显示在病毒扩增后用于大规模感染SF9细胞的各样品中，均可见一条对应于75千道尔顿的His标签蛋白的清晰条带。重组KINLIN3蛋白通过固定化金属螯合亲和层析进行部分纯化。本图中的主凝胶图像显示了在BAO病毒感染的SF九细胞中表达的重组小鼠kinlin三蛋白经镍亲和纯化后的SDS-PAGE结果。凝胶上方所示的蔗糖梯度用于蛋白的梯度离心。MW表示分子量标记物，LYS为全细胞裂解液，FT为流穿组分，WI为洗涤一，WII为洗涤二。此外，还对洗脱组分进行了蛋白质印迹（Western blot）分析，以确认重组蛋白上存在设计的6×His标签。接下来，将部分纯化的KINLIN三通过肝素柱离子交换色谱进一步纯化至接近均一。该图上部显示了在280纳米处检测到的洗脱曲线（蓝色），呈现为单一的对称峰，在绿色所示的线性氯化钠梯度下洗脱，氯化钠浓度范围为0.05摩尔至1.0摩尔。下部图显示了分段洗脱组分的SDS-PAGE分析结果，证实存在分子量为75千道尔顿的蛋白Kinlin三。最后一步，通过尺寸排阻色谱对KINLIN三纯度进行精制，以去除聚集体并实现均一性。该代表性凝胶过滤洗脱谱图采用SUEx S 200柱，在Tris HCl pH 7.5、150毫摩尔氯化钠和1毫摩尔DTT、20摄氏度条件下对纯化的KINLIN三进行分析。根据洗脱体积，KINLIN三的迁移行为符合预期的75千道尔顿蛋白，表明其主要以单体形式存在。下图显示了高浓度纯化的重组小鼠KINLIN3（标记为K3，浓度为14.5 毫克/毫升）在SDS-PAGE中的结果。大量制备高纯度、全长的小鼠KINLIN3蛋白并利用昆虫细胞培养系统，将有助于对该蛋白开展深入的结构研究和生化分析。本研究还进行了基于荧光的热稳定性迁移实验（thermo shift assay），以确定哪些缓冲液对KINLIN3蛋白具有稳定作用。KINLIN 三号被稀释到多种缓冲液中，构成一个pH值与氯化钠浓度的二维筛选实验。上方图显示了变性温度的三维直方图，下方图显示了相对于计算平均值50.4摄氏度的变性温度变化。柱状图根据其所对应的温度范围进行着色。在7.0至9.0的PA范围内，KINLIN three在高浓度氯化钠条件下表现出稳定性，其相变温度恒定为55摄氏度。同时观察到，在PA范围为7.0至7.5时，KINLIN three的相变温度也约为55摄氏度，且不受氯化钠浓度的影响。观看本视频后，您应该能够充分理解如何制备高纯度的功能性重组引火蛋白，用于深入的生物物理表征及后续研究。对于其他难以制备的蛋白质样品，也可采用类似方法，我们推荐在这些情况下应用该技术。

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