高效生产与纯化用于生物物理研究的重组小鼠Kindlin-3蛋白（源自昆虫细胞）

以下实验的总体目标是利用昆虫细胞培养系统高效地生产毫克级的Miran Kinlin 3蛋白，该蛋白无法在其他表达宿主中获得。该目标通过共转染实现：将携带KINLIN 3基因的转移载体与经改造的杆状病毒骨架（bao virus bacmid）共同导入细胞，从而构建出含有KINLIN 3基因的重组杆状病毒。第二步，利用昆虫细胞扩增该病毒，以获得足够数量的病毒粒子用于后续实验。

接下来，感染昆虫细胞以大量表达Kinlin三号蛋白，从而通过快速液相色谱法进行纯化。实验结果表明，基于SDS-PAGE分析和尺寸排阻色谱，可获得毫克级产量的高纯度、具有功能活性的Kinlin三号蛋白。该方法相较于现有技术（如在细菌中表达Kinlin三号蛋白）的主要优势在于，杆状病毒感染的昆虫细胞表达系统可使重组蛋白产量提高十倍。

本实验所用的SF九细胞系采用添加了100微克/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的SF 902培养基进行悬浮培养和维持。用于产生bao病毒时，细胞应培养至密度为5×10⁵至1×10⁶个细胞/毫升的范围。为转染准备SF九细胞时，将约1×10⁶个细胞接种至无菌六孔组织培养板的每一孔中，每孔加入2毫升含青霉素和链霉素的SF 902培养基，在生物安全柜中室温静置约20分钟，使SF九细胞贴附于塑料孔底部，形成单层细胞。重组balo病毒的生成是通过将质粒DNA与BMid DNA共转染至单层SF九细胞培养物中实现的。

表达载体 papine 神经元 firm T 三含有小鼠 KINLIN 三基因 firm T 三。该载体在 P 10 BAO 病毒启动子控制下，具有侧翼的 bao 病毒序列，可与 back mid 发生重组，并编码一个 C 端 hiss 六标签，用于后续纯化。每次转染使用 1 至 2 微克纯化的 MFI T 三、0.5 微克纯化的 B mid 以及 100 微升不含抗生素的 SF 902 SFM。此为溶液 A。在另一支试管中，将六微升细胞效应转染试剂用 100 微升不含抗生素的 SF 902 SFM 稀释。

若需进行多次转染，可在此为每组转染反应配制总混合液，以减少液体操作步骤。此为溶液B。每转染反应取约200微升的溶液A与溶液B混合，在室温下孵育20分钟，以形成脂质体-DNA复合物。20分钟后，每转染反应加入800微升不含抗生素的SF 902 SFM培养基稀释脂质体-DNA复合物。随后，小心吸除SF nine细胞单层的培养基，并小心将AB溶液与培养基的混合液滴加至SF nine细胞单层表面。

将转染后的细胞置于27°C、加湿的培养箱中孵育过夜，以创造加湿环境，防止细胞干燥。将六孔板放入塑料容器中，并放置一张湿润的纸巾。次日，向每孔单层培养细胞中加入额外1毫升不含抗生素的SF 900培养基，继续在27°C下孵育5天。

五天后，直接从培养基中收获重组杆状病毒，并转移至洁净的离心管中。在室温下，以1000 ×g离心5分钟，以去除SF9细胞碎片，将上清液转移至新的洁净管中，此上清液记为P1代病毒。可认为P1代病毒的病毒滴度约为1×10⁷ PFU/mL。

如有需要，可进行噬斑SA检测，但应将P病毒储备液在避光条件下于4摄氏度保存，直至使用。用于悬浮培养扩增重组balo病毒的SF九细胞，其密度应为每毫升1.4×10⁶个细胞，培养液体积应占培养瓶总体积的二十分之一，例如，在2升培养瓶中加入50毫升培养液。通常，为获得最佳的vao病毒扩增效果和蛋白表达产量，SF九细胞应大小均一且呈球形。

使用以下公式，以感染复数（MOI）为0.1的P1病毒原液感染SF9细胞培养物。将感染P1病毒的昆虫细胞培养物在27摄氏度、100 RPM振荡条件下孵育72小时。三天后，通过在1000 ×g下离心5分钟，将细胞与培养基分离，收集病毒。

在室温下转移澄清的病毒富集培养基至洁净离心管中。该病毒原液记为P2，预期病毒滴度为2 × 10⁸ PFU/mL。将该病毒原液避光保存于4°C，直至使用；将获得的细胞沉淀物保存于-20°C，用于后续重组病毒产生的验证。

开始此实验步骤时，需在悬浮培养基 SF 902 s fm 中培养足量的 SF nine 细胞，培养基中添加 100 微克/毫升 青霉素和 100 微克/毫升 链霉素。总体积与培养瓶体积的比例应为 1:5。

将悬浮培养物在27摄氏度、100转/分钟振荡条件下培养，直至细胞密度达到2×10⁶个细胞/毫升。当SF9细胞培养物达到2×10⁶个细胞/毫升的密度时，即可用于杆状病毒感染。向培养物中补充胎牛血清至终浓度为1%，随后加入P2代病毒原液。

为了达到感染复数（MOI）为1的条件，将感染后的培养物在27摄氏度、100 RPM振荡条件下继续培养。感染后72小时，通过在室温下以1000 ×g离心20分钟，收获表达重组多聚组氨酸标签Lin3的SF9细胞。将获得的细胞沉淀在-20摄氏度下保存备用，或在-80摄氏度下长期保存。该操作程序从冰上解冻开始。

将感染了vao病毒并表达重组kinlin three的SF九细胞的冷冻沉淀用裂解缓冲液重悬。将重悬的细胞与裂解缓冲液在5至10分钟内孵育，涡旋振荡直至形成均匀的重悬液，以进一步破坏细胞。在冰浴中对样品进行超声处理。

在 4°C 条件下，以 48,000 ×g 离心一小时，澄清裂解液。将所得上清液以每分钟 1 毫升的流速上样至预先用 4°C 裂解缓冲液平衡的 5 毫升体积组蛋白捕获柱（hist trap column）中。后续的蛋白洗脱、缓冲液置换及蛋白浓缩步骤在此不作展示，详见随附的手稿。

获得缓冲液置换后的蛋白质溶液后，使用 ACTA FPLC 以每分钟 0.5 毫升的流速，将其上样至预先平衡的 5 毫升体积 High Trap Heparin HP 柱。使用相同缓冲液中线性递增的氯化钠梯度洗脱结合的 KINLIN 3，氯化钠浓度梯度上升速率为每毫升 10 毫摩尔，重组组蛋白标签蛋白。预计 KINLIN 3 在约 0.6 摩尔氯化钠浓度下被洗脱。蛋白质浓缩后，最后一步是通过尺寸排阻色谱进行缓冲液置换：将纯化的蛋白质上样至 SUEx S 210 30 柱，以每分钟 0.5 毫升的流速将缓冲液注入柱中，根据蛋白质分子大小进行分离纯化。

从层析柱洗脱的蛋白质通过在280纳米波长下检测吸光度进行分段收集和监测。通过SDS-PAGE和Western印迹分析检测重组KINLIN3蛋白以及共转染的SF9细胞中是否存在目标蛋白，以验证重组病毒的生成是否成功。如本图所示，使用抗His6抗体对六份小规模培养的SF9细胞进行代表性Western印迹分析，结果显示在病毒扩增后用于大规模感染SF9细胞的各样品中，均可见一条对应于75千道尔顿的His标签蛋白的清晰条带。重组KINLIN3蛋白通过固定化金属螯合亲和层析进行部分纯化。

本图中的主凝胶图像显示了在BAO病毒感染的SF九细胞中表达的重组小鼠kinlin三蛋白经镍亲和纯化后的SDS-PAGE结果。凝胶上方所示的蔗糖梯度用于蛋白的梯度离心。MW表示分子量标记物，LYS为全细胞裂解液，FT为流穿组分，WI为洗涤一，WII为洗涤二。此外，还对洗脱组分进行了蛋白质印迹（Western blot）分析，以确认重组蛋白上存在设计的6×His标签。

接下来，将部分纯化的KINLIN三通过肝素柱离子交换色谱进一步纯化至接近均一。该图上部显示了在280纳米处检测到的洗脱曲线（蓝色），呈现为单一的对称峰，在绿色所示的线性氯化钠梯度下洗脱，氯化钠浓度范围为0.05摩尔至1.0摩尔。下部图显示了分段洗脱组分的SDS-PAGE分析结果，证实存在分子量为75千道尔顿的蛋白Kinlin三。

最后一步，通过尺寸排阻色谱对KINLIN三纯度进行精制，以去除聚集体并实现均一性。该代表性凝胶过滤洗脱谱图采用SUEx S 200柱，在Tris HCl pH 7.5、150毫摩尔氯化钠和1毫摩尔DTT、20摄氏度条件下对纯化的KINLIN三进行分析。根据洗脱体积，KINLIN三的迁移行为符合预期的75千道尔顿蛋白，表明其主要以单体形式存在。

下图显示了高浓度纯化的重组小鼠KINLIN3（标记为K3，浓度为14.5 毫克/毫升）在SDS-PAGE中的结果。大量制备高纯度、全长的小鼠KINLIN3蛋白并利用昆虫细胞培养系统，将有助于对该蛋白开展深入的结构研究和生化分析。本研究还进行了基于荧光的热稳定性迁移实验（thermo shift assay），以确定哪些缓冲液对KINLIN3蛋白具有稳定作用。

KINLIN 三号被稀释到多种缓冲液中，构成一个pH值与氯化钠浓度的二维筛选实验。上方图显示了变性温度的三维直方图，下方图显示了相对于计算平均值50.4摄氏度的变性温度变化。柱状图根据其所对应的温度范围进行着色。

在7.0至9.0的PA范围内，KINLIN three在高浓度氯化钠条件下表现出稳定性，其相变温度恒定为55摄氏度。同时观察到，在PA范围为7.0至7.5时，KINLIN three的相变温度也约为55摄氏度，且不受氯化钠浓度的影响。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何制备高纯度的功能性重组引火蛋白，用于深入的生物物理表征及后续研究。对于其他难以制备的蛋白质样品，也可采用类似方法，我们推荐在这些情况下应用该技术。