评估的HIV-1感染的CD4的先天传感 +性T细胞浆细胞样树突细胞使用体外共培养体系。

以下程序的总体目标是评估浆细胞样树突状细胞 （PDC） 对 HIV V 一、感染的 CD 四阳性 T 细胞的先天感知。首先通过用 H HIV V 1 感染 CD 4 阳性 T 细胞来实现。在第二步中，将感染的 T 细胞与 PDC 共培养。

18 至 22 小时后，回收共培养物中的上清液，用于定量 PDC 1 型干扰素的产生。最终，1 型干扰素的产生可用于评估人血、分离的 PDC 对 CD 4 阳性 T 细胞 H HIV 1 感染的敏感性。该方法可用于研究控制早期先天免疫反应的病毒和宿主因子以识别病原体，例如浆细胞样裂解细胞识别 HIV 一感染的 CD 四 T 细胞。

尽管这些方案旨在测量 1 型干扰素，但它们可以很容易地修改以检测 PC 在识别受感染的 T 细胞时释放的其他生物活性分子，例如干扰 γ、TNF α 或 kins 对于原发性 CD 的感染，四个阳性 T 细胞首先激活人外周血，用 PHAL 分离 CD 四个阳性 T 细胞 48 小时。在感染前至少三天，将细胞保存在补充有重组 IL Two 的完全培养基中。然后在生物安全三级实验室中，在感染后两天使用不同的感染倍数用 HIV one 病毒感染 T 细胞。

评估细胞培养物中 GFP、BST 2 和 CD 4 的表达。在生物安全 2 级设施中，仅使用 GFP 阳性为 20% 至 50% 的培养物进行共培养实验。接下来，在采血后半小时内通过密度梯度离心从人外周血样品中分离单核细胞。

然后用适当的抗体对细胞进行染色，以确认已按生理比例分离出所需的细胞谱系。快速工作以保持细胞低温。按照制造商的建议，使用 PDC 阴性选择试剂盒富集分离的 PBMC 内的 PDC。

然后通过流感细胞术确认 PDC 特异性表面标志物（如 I LT 7 和 BDCA 2）的富集纯度百分比和相对量。富集的样品应含有至少 40% 的 PDC，现在在 96 孔 U 形底板中每孔共培养 220 μL 传感细胞和 30 μL 感染的 T 细胞 包括仅包含传感细胞或靶细胞的对照孔，用完全培养基将这些孔调节至最终体积为 250 μL。为了评估 PDC 对已知 toll 样受体激动剂的反应，将 TLR 7 或 TLR 9 激动剂添加到适当的孔中，并将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 18 至 22 小时。

共培养结束时，将细胞转移至 96 孔 V 形底板中，并在 400 Gs 和室温下离心板 5 分钟。然后将上清液转移到 96 孔平底板中。Resus 将细胞沉淀悬浮在 2% 多聚甲醛中，并通过流式细胞术使用其大小和颗粒进行分析，以区分前向和侧向散点图中的细胞。

为了使用 hcbl 干扰素 α β 报告细胞测量具有生物活性的 1 型干扰素，首先将报告细胞以每孔 50， 000 个细胞的密度接种在 96 孔平底板中，最终体积为 180 微升。然后向每个孔中加入 20 微升刚刚收获的共培养上清液，一式两份，包括一组内标对照，并将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 18 至 22 小时，以确定在 180 微升量子蓝溶液中从报告细胞释放到新平底板的每个孔中的碱性磷酸酶水平。然后向每个孔中加入 20 微升诱导的 HEC PLU 干扰素 α β 细胞上清液，并在 37 摄氏度下孵育板，直到在标准干扰素对照孔中显色。

在酶存在下，量子蓝溶液从粉红色变为紫蓝色。最后，使用分光光度计评估 620 至 655 纳米处分泌的碱性磷酸酶的水平，并通过从干扰素标准曲线的线性部分外推来确定 1 型干扰素的浓度。由于原代细胞的可变性，重要的是观察到 CD 14 阳性髓细胞和 CD 3 阳性 T 细胞的正常比例，如这些代表性点图所示。

此外，在新鲜分离的 PBMC 培养物中，只有少量由较高的前向散射和 CD 三水平鉴定的活化 T 细胞是可取的。最重要的是，需要确定 PDC 的相对百分比，尽管这个百分比可以从 0.2% 到 1.2% 不等。在该范围的两个极端中也观察到异常的传感表型。使用阴性选择富集 PDC 通常可产生 50% 至 95% 的 PDC 纯度，如来自不同供体的这两个代表性点图所示。

下面的几个图演示了整个实验的原型示例。在这项具有代表性的研究中。MT 4 细胞用 P 和 l 4.3 GFP、IRIS NF 野生型或 delta VPU 感染，在共培养时达到 30% 的感染。

如前所述，只有野生型病毒感染导致表面 BST 2 的显着下调。由于它们在大小和粒度上的差异，在共培养后，仅 PBMC 在已知 TLR 7 或 TLR 9 激动剂存在下或 PBMC 与 HIV 1 感染细胞接触后，可以通过流式细胞术轻松区分 MT 4 细胞与 p BMC 释放大量 1 型干扰素。在 Pbmc 与模拟感染的 MT 4 细胞或单独感染的 MT 4 细胞共培养中，单独在 pbmc 中未检测到干扰素，在此处介绍的示例中，发现 PBMC 对 HIV 1 感染的 MT 4 细胞的先天感应在 VPU 存在下显着降低。

在尝试此过程时，请务必记住防止所有污染源。始终使用不含内毒素的溶液。请记住定期检查支原体污染，并在不使用任何抗生素的情况下将细胞保存在培养物中，因为即使是受控的细菌感染也可以被 PBM 感应到。

不要忘记 PC 是非常脆弱的细胞。它们的使用寿命有限，如果不及时执行手术，它们的响应能力可能会受到影响。