Name: 使用电子 von Frey 装置测量小鼠后爪触觉敏感性的变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学习使用电子von Frey装置测量小鼠后爪机械性痛觉敏感性的方法。该技术可快速精确评估炎症干预前后的缩足阈值变化，为研究疼痛机制和治疗效果提供可靠基础。

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NIH R15 NS067536-01A1（资助 DC）和 Macalester 学院 Wallace 研究基金（资助 DC）为本研究提供了支持。Macalester 学院图书馆支持了本文的开放获取出版。此外，我们感谢 Chatterjea 实验室现任和前任成员提供的支持。

麦克莱斯特学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准了所有实验方案。实验使用8至12周龄的雄性ND4瑞士小鼠。
1. Bothrops jararaca&#160;蛇毒制备与注射
<ol>
	<li>注意： B. jararaca 毒液具有毒性。处理粉末和配制溶液时应佩戴手套、口罩和护目镜。</li>
	<li>给予 45 µg/kg B. jararaca 毒液（剂量方案由前期剂量-反应实验确定）或0.9%生理盐水对照（10 µl） 通过 使用3/10 ml胰岛素注射器（配29 G × 1/2英寸针头）向双侧后足掌皮内注射。注意：根据实验设计，可将处理溶液与对照溶液分别注射至每只后足掌，以在每个个体内部设立对照。</li>
</ol>
2. 电子 von Frey 装置的设置与操作
<ol>
	<li>将电子 von Frey 仪器放置在探针架上。确保探针和电缆已正确连接至显示单元，然后打开仪器电源。在设置模式下将读数调至零（0.00 g），并将配套的测试砝码（5.00 g）轻轻放在 von Frey 探针的锥形端上。</li>
	<li>在实验记录本中记录读数，并在测试结束后重复此步骤。如果测试前后对测试砝码的读数差异超过 0.20 g，或在施加测试砝码后读数出现波动，则可能需要由制造商对设备进行重新校准。</li>
	<li>为评估小鼠后足的缩足阈值，请从探针配套提供的聚丙烯探头中选择合适的型号。探头的选择取决于待测组织类型。对于敏感度较低、质地较坚韧的后足组织，宜使用刚性探头；而对于较为敏感的区域（如肛生殖嵴），半柔性探头可能是更合适的选择（Chatterjea，未发表数据）。将刚性探头轻轻安装至探针的锥形端上。</li>
	<li>为记录施加的最大压力，将操作模式从“设置”切换至“操作”模式，此时显示屏将记录所施加的最大压力值。在此模式下，当探针回缩时，显示屏将保留最大压力读数。</li>
</ol>
3. 后肢缩足阈值评估的一般注意事项
<ol>
	<li>理想情况下，使用 EvF 装置测量后肢足底缩足阈值（机械敏感性）需要两名研究人员：一人操作装置并进行测量，另一人记录测量结果并处理小鼠。</li>
	<li>为减少偏差，操作装置的研究人员应对处理分组及记录的缩足阈值保持盲法。此外，为确保测量之间的一致性，应由同一名研究人员完成所有基线和实验缩足阈值的评估。</li>
	<li>所有测量均应在安静、温度受控的环境中进行，并在每天的同一时间完成14。</li>
	<li>负责记录测量结果的研究人员应将每只小鼠放入置于金属网底支架上的多单元聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）饲养箱中。用带孔的 PMMA 盖子盖住饲养箱，并在上面放置重物以防止小鼠逃逸。在支架下方放置吸水材料以吸收或收集排泄物。在进行基线或实验缩足阈值评估前，让小鼠在饲养箱中适应 15 分钟6,7,10。</li>
	<li>小鼠的后肢需能通过金属网底的孔隙方便接触；因此，应将金属网底支架放置在带刹车的推车或稳固的实验台面上，高度应便于操作，并可从各个方向接近。</li>
	<li>在测量过程中，可在测量开始前（但不可在测量期间）通过在测量箱外放置食物颗粒15，或轻敲、用笔划过箱体底部金属网产生轻微噪音来分散小鼠注意力。这有助于诱导小鼠保持静止，便于研究人员更顺利地开始测量。</li>
</ol>
4. 基线后爪缩足阈值评估
<ol>
	<li>首次基线测量应在给药治疗前 48 小时进行。安装刚性探头后，应先将探针归零。用双手缓慢抬起探针，刺激左侧或右侧后足的中部（足垫区域）（如果双侧后足接受了相同的处理）。</li>
	<li>逐渐增加压力，直至观察到明确的伤害性反应行为，例如后足回缩、后足舔舐或四肢跳跃6,10。指示另一位研究人员记录引发上述行为时的压力值。</li>
	<li>测量相邻隔间中小鼠的缩足阈值。持续操作，直到每只小鼠均完成一次缩足阈值评估。再重复四次，使每只小鼠共测量 5 次，方法如前所述10。</li>
	<li>对每只小鼠，计算 5 次测量值的中位数，然后计算每个测量值与中位数的偏差。选择偏差最小的 3 个值，取其平均值作为基线缩足阈值，方法如前所述10。在本演示中，测量标准化为采用 5 个值中的 3 个；尽管具体测量次数可根据实验设计调整，但必须确保所有小鼠在基线评估中被刺激的次数相等。</li>
	<li>24 小时后重复基线测量。每只小鼠测量 5 次，取最接近中位数的 3 个值求平均，获得基线缩足阈值。</li>
	<li>为计算单只小鼠的平均基线缩足阈值，取其在治疗前 48 小时和 24 小时测得的基线缩足阈值的平均值。若该平均基线缩足阈值低于 3.50 g，或两次基线阈值相差 2.00 g 及以上，则将该小鼠排除出实验。这些标准可确保实验中所有小鼠具有稳定的基线反应，且基线缩足阈值足够高，以便在治疗后观察到阈值的下降。</li>
	<li>注意：排除阈值取决于被探测组织的类型、所用动物品系以及探头类型。例如，我们发现 3.5 g 对于 ND4 品系小鼠的后足组织是一个有效的参考标准，但对于更敏感的区域（如肛生殖嵴），则需要设定更低的排除阈值（Chatterjea，未发表数据）。</li>
	<li>将小鼠分配至各治疗组时，应确保各实验组在给药前的平均缩足基线阈值尽可能相近。</li>
</ol>
注意：可在实验开始前 48 小时之前进行基线测量。但应在处理开始前，以固定时间间隔完成至少两组基线测量。
5. 实验性后爪缩足阈值评估
<ol>
	<li>根据实验设计确定的适当时间点，在处理后评估后肢缩足阈值（机械敏感性）。测量完成后，立即将小鼠放回笼中，并提供食物和饮水。</li>
	<li>按照上述步骤操作，但测量次数改为3次，以减少对（已处理）后肢组织过度刺激的可能性，尤其是在需要在多个时间点评估敏感性时。如果三次测量中任意两次结果相差超过2.00 g，则需进行第四次测量。</li>
	<li>取3次测量值的平均值，作为每只小鼠的实验缩足阈值。对于进行了4次测量的小鼠，计算其中与中位数偏差最小的三个值的平均值，以获得实验缩足阈值。</li>
	<li>为获得每只小鼠在特定时间点的Δ缩足阈值，需从实验缩足阈值中减去基线值。对所有小鼠及所有实验时间点重复此步骤9。</li>
	<li>对收集的数据进行适当的统计分析。本研究使用JMP 9.0（SAS, Cary, NC）进行单因素方差分析（One-way ANOVA）及Tukey HSD post hoc 检验。</li>
</ol>

<ol><li>Meetoo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+diseases%3A+the+silent+global+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nurs%22%5BJournal%5D)">Chronic diseases: the silent global epidemic.</a> Br J Nurs. (21), 17-21 (2008).</li>
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</ol>

作者声明无竞争性财务利益。

测量缩足反应的变化是评估疼痛和炎症啮齿类动物模型中触觉敏感性变化的重要工具。本文展示了使用电子 von Frey 仪器进行此类评估的实用性。该技术具有多项优势：i）可快速检测多只小鼠在多个相近时间点对施加压力的缩足反应；ii）可使用单一探头对组织小区域施加持续且特定的压力；iii）可精确测量引发缩足反应所需的压力值；iv）可方便地设定严格的基线截断值、排除标准和内部对照，以确保行为学评估尽可能精确和客观。
为确保电子 von Frey（EvF）实验获得最佳结果，关键步骤包括仪器的预先校准以及保持一致的测量操作。如实验方案部分所述，仪器在使用前后必须小心操作，并确保正确校准。在进行任何测量之前，必须先确认测试砝码的读数，以保证仪器处于最佳工作状态。如果读数出现显著波动，或测试砝码读数不准确，应立即联系制造商对设备进行校准。鉴于此，建议尽可能准备一台备用的电子 von Frey 仪器，以避免因仪器突发校准需求而影响时间敏感的实验。此外，同一项研究或一系列实验中的所有基线和实验测量，应由一名经过良好培训且对分组处理设盲的研究人员完成。小鼠应在安静、温度恒定的环境中进行评估，并在 EvF 测试舱内适应至少 15 分钟，但不应在舱内束缚过长时间（尤其是在同一天内需进行多次测量时），以最大限度减少因应激和不适引起的行為变异。
与现有的 CvF 技术相比，EvF 测量方法具有显著改进。研究人员可以施加持续的压力，而无需像在 CvF 细丝实验中那样在不同重量的探头之间切换6。这减少了对组织的刺激次数，尤其在组织处于炎症或损伤状态时尤为重要。EvF 能够精确测量引发回撤反应的压力值，而不是依赖于 CvF 测量中受可用细丝重量限制的 50% 回撤阈值测量方法13。由于可以实施合理且统一的排除标准（如上所述），小鼠可被分配至实验组，使得所有组在实验开始时具有相似的平均基线水平。EvF 测量评估的是对特定刺激的行为反应的变化，而非反应本身的绝对值。因此，每只小鼠的伤害感受反应变化通过其个体实验条件下的回撤反应与基线回撤反应之间的差值来衡量，从而为每次测量提供内部对照。
EvF 最显著的局限性可能是，与手动方法类似，同一研究人员必须完成特定系列基线和实验测量中的所有测量步骤。这使得该技术在时间、人员和设备方面难以扩大规模。我们发现，每次可同时测量约 20 只小鼠（取决于检测室的配置），在多次时间点测量中，每次测量可在 30 至 45 分钟或更短时间内完成，前提是各次测量之间至少间隔 45 分钟。与此相关的一个考虑因素是不同实验操作者的熟练过程。在实验者能够开展全面实验之前，必须先建立内部一致性，这需要投入大量时间进行专注练习，反复进行基线反应测量，直至达到所需的一致性水平。此外，使用基线截断值意味着并非所有为实验建立基线的小鼠都能被纳入分析；我们发现，每次实验中通常有 25% 至 30% 的小鼠因未达标而被排除。
在改良与未来应用方面，EvF行为学测量为多种炎症模型增添了强有力的分析维度，可用于研究伴随急性 和/或慢性疼痛的炎症病理过程。在毒液中毒模型中，我们发现ND4雄性小鼠后爪的触觉敏感性出现显著且快速的变化，同时伴随组织肿胀、白细胞募集和肥大细胞脱颗粒等典型病理表现。这些结果印证了既往关于肥大细胞介质参与大鼠热敏感性的研究发现20 由机械敏感性诱导的 B. jararaca 使用CvF测定ND4瑞士小鼠中的毒液21该EvF方案可轻松修改后用于后肢足垫以外的其他组织 例如 腹部7 和肛门生殖嵴8 其中CvF被广泛应用。过敏、伤口愈合、神经病变及其他病理的啮齿类动物模型均可轻松改进，以检测后足及其他组织的机械敏感性指标。
总之，EvF 是一种有用且有效的技术，它改进了啮齿类动物伤害感受测量的经典方法，是研究多种疾病模型中复杂疼痛机制的重要新工具。

慢性非传染性疾病造成了不成比例的人类死亡率和发病率负担1。慢性疼痛日益被视为全球疾病负担中的重要组成部分2。这极大地推动了疼痛预防、管理和治疗方面的创新。与此同时，大量证据表明疼痛的潜在生物学机制十分复杂3。介导保护性疼痛以及适应不良性和慢性疼痛的机制，提示免疫系统与神经系统之间存在复杂的相互作用3,4。阐明这些机制需要从分子解析到行为分析的严格定量、可重复的实验方法。
啮齿类动物模型在炎症性和神经性疼痛相关分子机制的研究中具有不可估量的价值5。由于啮齿类实验动物无法主动报告疼痛感受，因此通常通过检测其对有害刺激的反应时间与强度是否降低，来评估其疼痛状态6。在由感染7,8、化学物质暴露6,9,10、手术切口11以及神经结扎引起的神经性疼痛12等所致的炎症性伤害感受啮齿类模型中，对温度和压力反应的改变常被用作组织敏感性的评估指标。
机械敏感性，或对压力刺激的反应，通常使用经典冯弗雷细丝（CvF）进行测量——一系列例如 0.4-15 g13使用加权探针或探针毛，以连续递增的力度手动施加于测试组织，直至对照组与实验组个体出现痛觉相关行为反应。目前存在多种利用此类探针或探针毛评估机械敏感性的方法。6,13；最常用的方法如下。在系列中施加一定压力的尖端（ 例如0.2 克13) 作为起点，通过根据先前规定的行为反应显示来调整探针重量，测定大鼠或小鼠的50%缩足阈值（即探针施加于组织时引发反应所需刺激强度的50%）。13随后将各治疗组在治疗前基线水平与治疗后时间点的绝对50%缩足阈值进行比较。该手动方法相当耗时。除了受试动物在冯·弗雷（von Frey）检测箱中停留时间延长外，还需多次将不同重量的测试尖端施加于炎症组织，从而导致实验啮齿类动物的不适感增加。此外，50%缩足阈值通常在啮齿类动物组间进行计算和比较；据我们所知，除了一项研究外，实验个体的反应通常未以其自身未经治疗的基线反应为参照进行标准化归一化处理。6因此，通常不会根据预先确定范围内的一致基线反应来分配啮齿类动物至治疗组，也不会依据一套始终如一的排除标准对个体受试对象进行评估，从而无法针对任何特定研究和检测体系将基线反应标准化。
此处，我们介绍一种在暴露后测量小鼠后爪触觉敏感性的替代方法 Bothrops jararaca 使用电子冯·弗雷装置（EvF）进行毒液测试。Cunha 及其同事6 在啮齿类动物中率先开创了EvF技术的应用，并系统比较了CvF与EvF的疗效，证明EvF具有 &#34;更敏感、客观且定量的&#34; 在炎症性疼痛的啮齿类动物模型中，用于评估触觉敏感性的测量方法。简言之，在电子 von Frey（EvF）测量中，将一根非吸湿性的聚丙烯 von Frey 探针（直径均一，0.8 mm），根据待测组织的特性选择适当刚性的探针头，连接至电子探头和读数装置，该装置可显示动物对探针刺激产生回缩反应时所受的力/重量。EvF 与传统 von Frey（CvF）测量方法之间存在若干重要差异。首先，使用 EvF 测量基线和实验反应的过程更为高效，因可对后肢足底持续施加递增压力直至动物出现反应，无需像 CvF 那样更换不同强度的探针；动物在检测装置中受限时间更短，因此在实验过程中应激更小，更为舒适。其次，EvF 可简便地实施合理的排除标准，即通过设定可接受的基线阈值范围来筛选研究对象，从而实现处理组内及组间基线反应的标准化。第三，每个受试动物在实验处理后的反应均与其自身基线反应进行比较，为测量提供了重要的内部对照。第四，由于压力可连续施加而非依赖手动纤维丝所提供的离散重量增量，因此回缩阈值的记录具有更高的分辨率。与设计良好的 CvF 检测类似，EvF 实验也由同一名研究者（对处理分组设盲）施加刺激并记录动物的行为反应。需注意的是，该技术要求研究者投入时间和精力以建立测量的内部一致性，并要求在实验设计时充分考虑可能因基线反应不一致而需排除的小鼠样本。
一种易于实施、效果显著且控制良好的机械敏感性评估方法，有助于将行为学评估引入炎症事件模型中，例如毒液中毒——本文即以这一实例说明EvF测量在触觉敏感性变化检测中的能力与优势。我们发现，雄性ND4瑞士小鼠在后爪注射来自南美响尾蛇Bothrops jararaca的毒液后，机械敏感性增强。该行为反应伴随局部组织水肿、中性粒细胞浸润以及肥大细胞脱颗粒现象。

<table><tbody><tr><td>ND4 瑞士雄性小鼠</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>本实验使用的小鼠年龄为 8–12 周，饲养和使用均遵循麦克莱斯特学院 IACUC 指南。</td></tr><tr><td>3 ml/100 胰岛素注射器，配 29 G 1/2 英寸针头</td><td>BD</td><td>BD309301</td><td>每次使用后应丢弃至适当的容器中。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;B. jararaca&lt;/em&gt; 毒液</td><td>Sigma</td><td>V5625</td><td>注意：有毒物质。请佩戴眼部和皮肤防护装备。用无菌 0.9% 生理盐水溶解。</td></tr><tr><td>电子 von Frey 装置；探头 = 90 g 量程</td><td>IITC</td><td>2394</td><td>操作时动作轻柔，并确保装置始终处于水平状态。探头归零时，按 &quot;Program&quot; 和 &quot;Clear&quot;。从设置模式切换至操作模式时，按 &quot;Function&quot;（用于显示 &quot;MH&quot;）或 &quot;MAX&quot;。</td></tr><tr><td>网格支架 + PMMA 透明舱室</td><td>IITC</td><td>410</td><td>放置在稳固的台面或四轮推车上，以便从各个方向接近。</td></tr><tr><td>仅使用电子 von Frey 装置的刚性探头，90 g 量程</td><td>IITC</td><td>2390</td><td>不适用</td></tr></tbody></table>

使用电子 von frey 仪器测量小鼠后肢触觉敏感性的变化

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

测量炎症诱导的后肢足爪对机械压力回缩阈值的变化，是评估啮齿类动物疼痛感知变化的一种有用技术。可通过在皮肤特定区域施加精确的力，首先测量基础状态下的回缩阈值，随后测量给予药物、毒液、损伤、过敏原&#160;或其他因素诱发炎症后的阈值。电子 von Frey 仪器能够精确评估小鼠后肢足爪的回缩阈值，克服了传统 von Frey 测试中因可用纤维丝尺寸有限而带来的局限性。该方法操作简便、测量快速，可在短时间内进行多次测量，因而适用于急性炎症性疼痛和神经病理性疼痛多种模型中触觉敏感性结果的评估。每个啮齿类实验个体的测量结果可用其自身的基础反应作为内部对照，且易于建立排除标准，以在实验组内及组间标准化基础反应水平。因此，使用电子 von Frey 仪器的测量方法代表了对已确立的传统 von Frey 纤维丝法检测啮齿类机械性异常性疼痛的一种有效改进，也可应用于其他非人哺乳动物模型。

局部注射B. jararaca 蛇毒可导致ND4瑞士雄性小鼠后肢触觉敏感性改变及组织水肿。
注射45 µg/kg B. jararaca 蛇毒后1.5小时，ND4瑞士雄性小鼠的后肢缩足反应阈值比基线降低了3.0 g（图1A）。所有组别在基线时的缩足反应压力约为4.5 g；经蛇毒处理后，实验组小鼠在1–1.5 g的压力下即出现后肢缩足反应（数据未显示）。与基线相比，生理盐水处理的对照组小鼠在各个时间点对压力的反应几乎无下降。经处理小鼠的反应阈值降低在中毒后3小时和6小时仍明显维持（图1A），至24小时时则与对照组无法区分（数据未显示）。中毒小鼠的后肢表现出典型的炎症性组织水肿。在注射蛇毒后1.5小时，按先前所述方法10测量，处理侧后肢厚度比基线增加1.5 mm；水肿在3小时和6小时仍持续存在（图1B）。相比之下，生理盐水处理组的后肢在整个实验期间未出现肿胀或厚度变化。本代表性实验共使用21只小鼠进行基线测量，其中14只被选入正式实验。分组时确保各组基线平均缩足反应值整体上约为4.5 g。
ND4 昆明雄性小鼠的 B. jararaca 蛇毒引起触觉敏感性改变，同时伴随肥大细胞脱颗粒和中性粒细胞浸润至后足。
除了触觉敏感性增加和组织水肿外，我们还评估了中毒小鼠与生理盐水处理小鼠后肢足垫中的中性粒细胞浸润（图 2A-B）以及肥大细胞脱颗粒情况（图 2C-D）。中性粒细胞是最早从循环系统被募集到损伤部位的炎症细胞，已知可介导炎症性伤害感受反应10,16,17。肥大细胞是组织驻留的哨兵细胞18，其脱颗粒现象已被证实与小鼠后肢足垫10以及大鼠硬脑膜19中的伤害感受反应相关。
本研究发现，与生理盐水处理的后足相比，受蛇毒注射的后足中性粒细胞浸润增加了近1,000倍（图3A），该结果通过计数安乐死小鼠在注射毒液后1.5小时采集的苏木精-伊红染色的4 µm石蜡包埋矢状面足底组织切片得出10。
在生理盐水处理的足垫中，后肢足部组织的足底肥大细胞大部分保持完整，或仅表现出轻度脱颗粒现象（图3B）。相比之下，中毒的后肢足部显示出15–20%的肥大细胞发生中度至重度脱颗粒（图3B）。上述组织切片经甲苯胺蓝染色，并对每个观察到的肥大细胞中可见颗粒的数量进行计数，以确定其脱颗粒状态，方法如先前所述10。
<img alt="B. jararaca venom effect graphs: A) Mechanical threshold, B) Paw width over time. Statistical data.
" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 局部 B. jararaca 毒液注射导致ND4瑞士雄性小鼠后肢机械敏感性改变及组织水肿。 基线撤足阈值和基线足爪宽度分别在足底注射前48小时和24小时进行评估 B. jararaca 毒液（Bjv； 45 µg/kg）或给予溶剂（生理盐水）处理（10 µl。在给药后1.5、3和6小时评估缩足阈值（A). A小鼠左右足掌宽度的平均值（跖部中段的平均宽度） 使用数字卡尺在基线时以及治疗后1.5、3和6小时进行测量，以评估组织水肿，方法如前所述。10 (B）。与Sal处理的小鼠相比，差异具有显著性（* = p &lt; 0.05，** = p &lt; 0.01，*** = p &lt; 0.001）。每组处理组包含 10-11 只小鼠。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig1highres.jpg" target="_blank">单击此处查看大图</a>.
<img alt="Histological comparison of saline and B. jararaca effects, under 400x and 1000x magnification." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. B. jararaca 毒液诱导的机械性敏感性伴随ND4瑞士雄性小鼠后爪肥大细胞脱颗粒及中性粒细胞浸润。 3只小鼠/处理组通过CO处死2 处理后1.5小时 后肢足部被切除，置于10%甲醛中固定24小时，随后转移至70%乙醇，用15% EDTA脱钙1至2周，最后包埋于石蜡中。 4 µm 矢状切面用苏木精-伊红染色（A-B）和甲苯胺蓝（C-D)用于可视化中性粒细胞（A-B）和肥大细胞（C-D），分别如图注所示，在400倍和1,000倍下获取图像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig2highres.jpg" target="_blank">单击此处以查看大图</a>. 
<img alt="Neutrophils and degranulation by B. jararaca venom; bar graph; venom impact analysis." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. B. jararaca 毒液诱导的机械性敏感性伴随ND4瑞士雄性小鼠后爪肥大细胞脱颗粒水平显著升高以及中性粒细胞浸润。 使用 Olympus CX21LED 显微镜对染色组织切片中的中性粒细胞和肥大细胞进行计数。每种处理组选取3只后足，从足跟至脚趾区域，在400倍放大倍数下相邻的视野中计数中性粒细胞 (A）。每种处理条件下计数3个足垫中的肥大细胞，并根据细胞边界外可见颗粒的数量对脱颗粒状态进行评分：完整（0）、轻度（0-10）、中度（10-20）、重度（21+），评分方法如前所述。10 (B).  为避免重复计数，评估后爪切片中中性粒细胞数量和肥大细胞脱颗粒水平的研究人员使用了目镜测微尺上刻有的网格。研究人员对处理分组设盲。s. 显著性与Sal处理小鼠相比（* = p &lt; 0.05，** = p &lt; 0.01，*** = p &lt; 0.001）。每组处理实验小鼠 n=3 只。  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig3highres.jpg" target="_blank">单击此处以查看大图</a>.

电子 von Frey 测量法是对传统 von Frey 单丝法的一种有效且改进的替代方法，它能够在炎症事件前后快速、精确地测量啮齿类动物对持续施加压力刺激的机械缩足阈值的变化。

使用电子 von Frey 仪器测量小鼠后肢触觉敏感性的变化

测量炎症诱导的后肢对机械压力回缩阈值的变化是评估疼痛变化的一种有用技术。

本实验的总体目标是测量小鼠后爪对机械压力的非敏感性反应。首先将动物置于金属丝网地板上，待其适应环境后进行操作。将聚丙烯探头施加于后爪的底面，并逐渐增加压力。当观察到适当的行為反應時，撤除刺激。在收集完基線值後，動物接受實驗性干預，隨後進行進一步測試。最終，比較各治療組之間後肢撤足閾值的變化，以確定特定治療對觸覺壓力敏感性變化的影響。疼痛是炎症的一个主要组成部分。在不同情境下测量和表征疼痛具有重要意义。这种相对简单的疼痛评估方法可应用于多种不同的炎症模型。演示该实验操作的是我实验室的研究技术员 Tiana ov，以及本科期间参与此项工作的 Madison Mack 和目前在我实验室攻读本科学位的 Akila Sykes。我们首先设置测试装置，以便于接触后肢足部。将单个实验腔室放置在网状底板上方。网状底板应处于便于操作的高度，并置于稳固的表面上。随后将电子Von Frey装置放置在实验台面上。确保探头和电缆已正确连接至显示单元，并将仪器置于设置模式下开机。将读数调零，然后将提供的测试砝码轻轻放置在Von Frey探头的锥形端上。记录此时的读数，并在测试结束时再次重复此操作。若两次读数之间存在差异，则可能需要对仪器重新校准。选择合适尺寸的聚丙烯探头，用于待测组织。对于敏感性较低且较坚韧的后足组织，使用刚性探头效果较好。轻轻地将探头安装到探针的锥形接口上。接下来从设置模式切换到操作模式。这将显示探针回缩时施加的最大压力。测量后肢足底撤回阈值需要两名研究人员共同完成。一人操作仪器并进行测量，另一人记录测量结果，以减少偏倚。操作麻醉机的实验人员应对所施加的处理及记录的撤退阈值保持盲态。此外，为确保测量结果的一致性，应由同一人记录所有基线值和撤退阈值。处理前48小时，记录第一组基线测量值。在支架下方放置吸水材料以收集排泄物。安装探针尖端并校准归零后，负责记录测量数据的实验人员应将小鼠分别放入独立的测量舱内。用带孔的盖子盖住实验舱，并在上面放置一个重物。为防止小鼠逃逸，在继续操作前，需让小鼠在实验舱内适应15分钟。通常，初次接触该技术的操作者在逐步增加压力以及在自身测量中建立内部一致性方面会遇到困难，因此练习对于获得可重复的结果至关重要。准备就绪后，用双手缓慢抬起探针，刺激左侧或右侧后肢足垫。逐渐增加压力，直至观察到伤害性感受行为。此类行为表现为后肢回缩、后肢舔舐或后肢跳跃。指示另一位研究人员记录引发观察到行为的压力值。在测量过程中，可通过将食物板放置在舱室外侧，或在测量前发出轻微声响（如轻敲）以鼓励小鼠保持静止，这有助于测量。对每只小鼠依次进行测试，每只仅测试一次，随后重复此过程四次。在采集五次基线值后，计算每只小鼠的平均值。24小时后重复基线测量，并利用这些数值计算另一个平均值。为确保所有小鼠具有稳定的基线反应，应排除平均基线缩足阈值低于3.5克，或基线阈值差异达到或超过2克的小鼠。最后，将小鼠分配到不同的处理组中，使每组的平均撤退阈值基线尽可能相似。在此，测量了后爪给予毒液 ROS raca 后的撤退阈值。经生理盐水处理的对照组小鼠在所有时间点与基线相比变化很小。在治疗后的小鼠中，所检测的时间点的伤害性反应明显持续长达六小时。此外，组织水肿（炎症的特征之一）在毒液处理的后爪中明显存在，而在生理盐水处理组中则无此现象。毒液诱导的触觉敏感性改变伴随着中性粒细胞浸润，其数量增加近1000倍。与生理盐水处理组的后足相比，生理盐水处理后足组织中的足底肥大细胞大部分保持完整或仅显示轻度脱颗粒。相比之下，交配组后足显示15%至20%的肥大细胞出现中度和广泛性脱颗粒。该技术可经调整后用于评估除后足外多种其他组织的机械或触觉敏感性。因此，该技术可应用于多种不同的啮齿类动物炎症与疼痛模型。

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