体外光动力疗法对骨肉瘤细胞的细胞毒性疗效 In Vitro

以下实验的总体目标是展示光动力疗法在骨肉瘤细胞中的细胞毒性效果。首先通过测定骨肉瘤细胞对光敏剂M-T-H-P-C的细胞内摄取量来实现该目标。在第二步中，对细胞施加激光照射，以激活M-T-H-P-C并产生活性氧自由基。

最后，通过水溶性四唑盐一（WST-1）检测法测定细胞代谢活性和细胞数量。最终，WST-1检测法结合直接细胞计数可用于评估光动力疗法对骨肉瘤细胞的细胞毒性作用。该技术的应用意义在于骨肉瘤治疗领域，因其可在体外评估光动力疗法的疗效，并且其检测原理与目前临床患者中使用的技术相似。

为比较不同骨肉瘤细胞系对M-T-H-P-C的摄取情况，首先将每孔0.2 × 10⁶个Hoss细胞和143B细胞接种于6孔板中，每组设三个复孔。让细胞在培养箱中贴壁过夜，至融合度达到80%～90%。次日，在避光条件下，用固定浓度的M-T-H-P-C处理细胞，分别孵育不同时间，以评估光敏剂在细胞内的时间依赖性摄取。孵育结束后，吸除培养基，用PBS洗涤细胞3次，随后加入0.5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞并收集，进行细胞计数。

接下来，在室温下以400 × g离心5分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于PBS中，调整细胞终浓度为每毫升2 × 10⁵个细胞。取100 µL细胞悬液加入96孔板的每个孔中。

将细胞接种于孔板中，并使用荧光分光光度计测定其荧光值，仪器设置为激发波长417纳米，发射波长652纳米。随后，制备标准曲线：在96孔板中，每组浓度设三个复孔，分别加入100微升浓度为0至4毫克/毫升的M-T-H-P-C溶液。按照上述相同方法测定荧光值，以生成标准曲线，用于计算先前测定孔板中各含细胞孔的相对荧光单位。

为测定光敏剂的光毒性，首先在96孔板中每孔接种3000个细胞，每种M-T-H-P-C浓度设三个复孔，并为每种光敏剂浓度设置暗毒性对照组细胞。将细胞置于培养箱中过夜，使其贴壁并达到50%至60%的汇合度。次日，在避光条件下用一系列浓度的M-T-H-P-C孵育细胞5小时，随后进行光照处理。

吸去培养基，用 PBS 洗涤细胞两次，加入不含 M-T-H-P-C 的新鲜培养基，然后针对 M-T-H-P-C 的吸收光谱进行操作，佩戴适当的护目装备。将 652 纳米的半导体激光器设置在距离细胞 13.5 厘米的高度，功率为 21.88 毫瓦/平方厘米，以获得 5 焦耳/平方厘米的能量剂量。

随后，除暗毒性对照组细胞外，将细胞照射230秒。照射后，将细胞置于37摄氏度黑暗环境中培养24小时。之后，在每100微升培养基中加入10微升WST-1试剂，加入试剂3小时后，在415纳米波长下测定各孔的吸光度。

最后，除了WST-1检测外，还需计算存活细胞的数量。直接计数细胞是测定细胞毒性的第二种方法。为计算活细胞百分比，将每孔2 × 10⁴个细胞接种于两块24孔板中，每孔接种一次，过夜培养使其贴壁。

第二天，在避光条件下用 M-T-H-P-C 与细胞共孵育 5 小时，并如前所述进行光照。24 小时后，将避光对照组细胞继续保持在避光环境中，收集上清液，用 PBS 洗涤细胞一次，胰蛋白酶消化后，最终离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于 200 µL 新鲜培养基中用于计数。本图结果中，上方图示显示了 M-T-H-P-C 摄取随时间变化的情况，细胞悬液的荧光强度代表细胞内 M-T-H-P-C 的水平。

在下方图示中，可通过荧光分光光度计检测 M-T-H-P-C 的荧光强度，评估其剂量依赖性的细胞摄取情况。该图展示了在固定浓度 M-T-H-P-C 条件下，细胞悬液的荧光强度随时间变化的情况，荧光强度反映了细胞内 M-T-H-P-C 的含量水平。

在此图中，展示了Haass细胞和143 B细胞在孵育五小时后对M-T-H-P-C的剂量依赖性摄取情况。高转移性细胞系143 B中的摄取量显著高于低转移性的亲本宿主细胞系。同时展示了骨肉瘤细胞的剂量依赖性暗毒性。

将143 B细胞用不同剂量的M-T-H-P-C处理，并与未处理细胞进行比较，通过WST-1实验检测发现，细胞代谢活性和细胞数量随药物剂量增加而降低。当M-T-H-P-C浓度达到或高于2.5 微克/毫升时，即可观察到细胞活力下降。下图展示了M-T-H-P-C的剂量依赖性毒性效应。

细胞经不同剂量的M-T-H-P-C处理后，以每平方厘米五焦耳的光照进行照射，观察到细胞代谢活性显著降低，同时细胞数量减少。该技术的建立为癌症生物学领域的研究人员将此方法应用于骨肉瘤的体内模型及其他临床前研究铺平了道路。