人类神经的聚集体cGMP的适用展开法干细胞和祖细胞来源从多能干细胞或胎儿脑组织

以下实验的总体目标是有效地传代神经球，以便在培养细胞的整个生命周期内保持细胞间接触。该技术创造了人类神经祖细胞所需的扩增条件。这是通过组合最多两个相同细胞的 T 1 75 培养瓶并转移到锥形管中来实现的，允许将球体转移到培养皿中，作为第二步浓缩到悬浮的神经球中，在培养皿上形成可管理的团块，这允许刀片将 H NPC 切割成小簇。

接下来，将传代或切碎的神经球重悬，以便从培养皿中取出细胞并季铵到新培养瓶中。获得的结果表明，切碎技术提供了一种基于扩增曲线的长期生长策略，与通过标准酶法传代的细胞相比，该曲线表明长期对数生长速率。这种技术的视觉演示作为一个球体至关重要。

冷凝步骤很难用书面形式描述。还有一些技巧可以帮助完成这个过程。如果多余的培养基没有从培养皿中完全去除，球体将简单地在培养基中被推来推去，而不是分成更小的簇。

通过处理 H NPC 培养瓶的培养基颜色来开始此过程。在显微镜下扫描培养瓶以观察细胞。如果可能，使用根式检查几个球体的大小。

如果许多球体的直径为 300 微米或更大，请继续进行切碎过程，每 7 到 10 天切碎一次细胞。然后将培养瓶放回培养箱中并设置切碎机。打开斩波器的电源开关。

在 BSC 中，将切碎厚度设置为 200 微米，将刀片力设置为 180 度或 9 点钟位置。接下来，确认自动速度旋钮尽可能逆时针旋转。然后将工作台释放旋钮尽可能向右移动，并确认板架稳定。

顺时针旋转手动机械臂纵器，将机械臂提升到其最大高度。然后，将无菌双刃切碎刀片转移到切碎臂螺栓上。使用一对镊子，使用镊子将扣子放在刀片上。

扣环的弯曲部分必须超过手臂的顶部边缘。接下来，将扣环固定在臂上并将螺母固定在螺栓上。使用无菌螺母起子，将螺母松动四分之一圈。

在此过程中，将建议量的维护培养基转移到新培养瓶中。之后，在无菌条件下将细胞从培养箱转移到 BSC。将培养瓶靠在试管架上，让球体在培养瓶中沉淀。

一个和解了。吸出多达 12 mL 的上清液。用 10 mL血清移液管冲洗培养瓶表面所有松散粘附的球体。

根据需要重复，让球体在 Rens 之间稳定下来。接下来，将建议体积的条件培养基转移到新培养瓶中。然后将所有剩余的条件培养基和球体转移到新的 15 毫升锥形管中。

让球体沉淀并丢弃用过的烧瓶。之后，以尽可能小的体积将细胞从 15 mL 锥形管缓慢转移到 60 mm 培养皿或垫片盘上。保留剩余的条件培养基，因为它将用于在切碎后冲洗培养皿中的细胞。

尽量减小培养皿上介质和球体所覆盖的表面积。接下来，通过将超级 natin 转移回 15 ml 锥形管中，开始冷凝球池。使用气溶胶屏障尖端的微量移液器从培养基池顶部去除尽可能多的培养基。

直到无法删除没有球体的介质，然后将池展开。使用移液器吸头的侧面增加表面积，轻轻倾斜培养皿，然后使用移液器吸头的侧面将所有球体轻轻滑到池的一侧。重新定位所有细胞后，慢慢地将培养皿向相反方向倾斜，以使培养基与球体分离。

然后，将澄清的培养基转移回 15 毫升锥形管中。使用移液器吸头的侧面将所有球体轻轻滑回培养皿的中心。所以水池的直径为 0.5 到 2.4 厘米。

保持球池的深度较浅很重要。如果池子太深，在切碎过程中球体会被推到一边。现在，将培养皿转移到板架上，并将其固定在板架挂钩下。

使用工作台释放旋钮将板架向左滑动，使刀片远离球体并锁定在齿轮中。接下来，顺时针旋转手动机械手旋钮，直到刀片平放在培养皿上，以降低切碎臂。在拧紧螺母的同时按下臂架。

然后按下重置按钮。用一只手稳定培养皿，同时将自动机械臂机械手旋钮顺时针旋转至 90 度或 12 点钟位置，并在所有球体都被切碎后开始切碎。将板架旋转 90 度。

然后松开螺栓，降低臂并重新拧紧螺母。重复切碎过程。之后，在无菌条件下，将培养皿从培养皿转移到 BSC 中的工作空间。

将 1 毫升条件培养基转移到切碎的球体上。然后轻轻重悬并将切碎的球体转移到新的 15 mL 锥形管中。尽量避免形成气泡，并根据需要重复多次以收集切碎的球体。

测量调节培养基和切碎球体的体积。添加适量的维持培养基以达到表第二列 E 中建议的体积，之后，将球形悬浮液放入每个新培养瓶中，一次仅将球形悬浮液转移到一个培养瓶中，并在两次转移之间重悬球体。每个烧瓶中的最终体积应等于表 2 列 F 中的建议体积，将切碎的 h NPC 放入培养箱中。

该图显示了在第 19 次传代时冻结的 H NPC 的预计细胞数，然后与通过切碎方法传代的神经球相比，使用酶解离解冻并扩增为贴壁单层。以下是 10 倍放大倍率下预切球体和后切球体的代表性图像。该图显示了已铺板 1 天并对巢和表达进行染色的解冻代 29 H NPC，而该图显示了在没有生长因子的情况下已铺板 7 天并进行 GFAP 和 β 3 微管蛋白染色的解冻代 29 H NPC。

观看此视频后，您应该对如何使用自动切碎技术传代 HBC 有很好的了解，该技术可在细胞和培养的整个生命周期中保持细胞间接触。该程序可适用于多种细胞类型，例如源自多能细胞或心球的神经干细胞。