Name: 人类神经的聚集体cGMP的适用展开法干细胞和祖细胞来源从多能干细胞或胎儿脑组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学习机械切割法扩增人神经祖细胞球状体，无需酶解即可维持细胞间接触，实现超过40代的长期稳定对数生长。该方法为神经干细胞研究提供高效替代方案。

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感谢 Soshana Svendsen 博士对本报告的审阅与编辑。&#160; 本工作由美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所（NIH/NINDS）1U24NS078370-01 项目和加州再生医学研究所（CIRM）DR2A-05320 项目资助。

作者无任何利益冲突需要披露。

<img alt="神经干细胞培养过程示意图；胎儿皮层分离、聚团、培养基传代步骤。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 切割示意图。通过机械切割法在培养中扩增球形干细胞/前体细胞。
关键步骤
图6展示了切碎扩增方法的概览。图6中的人神经前体细胞（hNPC）球体大小是传代神经球前需要观察的重要标准之一。尽管球体大小存在较大差异，但至少应有30%的球体直径大于300 µm。如果球体过小而不适合传代，只需将培养基（CM）更换为新鲜的维持培养基（MM），更换比例为25%-50%，并在1-4天后重新评估。若在球体直径过小时进行传代，会导...

A correction was made to <a href="/video/51219">A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue</a>. The corresponding author was changed from:
Brandon C. Shelley 
to:
Clive Svendsen

A correction was made to <a href="/video/51219">A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue</a>. The corresponding author was changed.

Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

长期以来，啮齿类动物的神经干细胞在体外培养中被扩增为单层细胞1-3或聚集体形式的神经球4-7。此外，从发育中的中枢神经系统不同区域分离得到的人类神经前体细胞（hNPCs）8-17也已在体外成功扩增。in vitro。这些细胞具有双潜能性，能够分化为星形胶质细胞和神经元，在研究神经发育18,19及疾病机制20,21方面发挥了重要作用。hNPCs还被移植到多种中枢神经系统疾病的动物模型中，在不同模型中表现出程度不一的整合能力、存活率及功能效应22-24。
传统上，啮齿类或人源胎儿神经前体细胞（NPCs）需暴露于生长因子——通常是表皮生长因子（EGF）和/或成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）25-28——并且贴壁29以及三维球状体系统通常通过酶消化法解离为单细胞悬液进行传代30-34。由于操作简便，用于科研或临床用途的细胞扩增标准方法是采用贴壁单层培养。然而，我们已证明，使用酶或化学溶液对单层培养及神经球形式的人神经前体细胞（hNPCs）进行传代会导致早期衰老35。此外，根据胚胎干细胞的研究数据，酶消化法可能导致分化水平升高以及核型异常36-38。尽管标准的hNPCs传代方法已生产出符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）要求的产品，并已进入I期临床试验（Stem Cells Inc.， Neuralstem Inc.），但该方法仅允许有限次数的细胞扩增，限制了细胞库的建立潜力。
显然，大规模科研实验及未来的临床试验将受益于能够大规模扩增细胞并延缓细胞衰老的技术，从而实现细胞的大量培养与储存。为满足这一需求，我们开发了一种新颖且自动化的机械传代方法，通过将完整的神经球“切碎”成小细胞簇，以维持细胞间的相互接触。该方法显著延长了神经球的生命周期39 悬浮培养相比单层培养能更高效地利用培养箱空间，这一点在另一种三维生物反应器培养方法中已得到证实40所提供的切碎传代方法能够从一份胎体样本中大规模建立超过第10代的细胞库，而使用标准传代方法几乎无法实现这一目标。尽管这种人源神经前体细胞（hNPCs）传代方法较为非常规，但其应用正日益普及，并已近期与其他细胞类型共同发表，例如源自人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的神经干细胞，从而实现了大规模扩增，适用于多种应用领域 体外 疾病建模41-46重要的是，已采用切碎法成功制备了符合cGMP标准的人神经前体细胞（hNPC）细胞库，表明该技术可应用于未来的临床实践。

<table><tbody><tr><td>50 ml 烧杯</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-100-50</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>II 级生物安全柜</td><td>Baker</td><td>SG-603A</td><td>4 英尺或 6 英尺型号。&amp;nbsp; 推荐使用 6 英尺型号；多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>双刃切片刀，用于样本制备</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td>多个制造商/供应商。&amp;nbsp; 警告：锋利</td></tr><tr><td>无细胞冻存培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6295-50ML</td><td>含 DMSO，无血清</td></tr><tr><td>离心机，带 15 ml 摇摆桶转子</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>15 ml 锥形离心管</td><td>Fisherbrand</td><td>S50712</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>50 ml 锥形离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352074</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>程序降温仪</td><td>Planer</td><td>Kryo 750</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>2 ml 冻存管</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>通气培养瓶，T12.5</td><td>BD Falcon</td><td>353107</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>通气培养瓶，T25</td><td>BD Falcon</td><td>353081</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>通气培养瓶，T175</td><td>BD Falcon</td><td>353045</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>通气培养瓶，T75&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353110</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>滤器，0.22 &amp;micro;m，带接液杯，1 L</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>滤器，0.22 &amp;micro;m，带接液杯，150 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGVU01RE</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>滤器，0.22 &amp;micro;m，带接液杯，500 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>滤器，0.22 &amp;micro;m，带接液杯，50 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>滤纸，直径 8.5 cm 圆形</td><td>Whatman/GE</td><td>1001-085</td><td></td></tr><tr><td>标准齿纹弯头镊子，18 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11001-18</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇冷冻室</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>&quot;Mr. Frosty&quot;</td></tr><tr><td>培养箱，37 &amp;deg;C/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Forma</td><td>370 系列</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>血细胞计数板（相差型）</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>McIlwain 组织切片机</td><td>Lafayette Instruments</td><td>TC752-PD</td><td>&amp;nbsp;需配备培养皿改装装置。&amp;nbsp;&amp;nbsp; 警告：&amp;nbsp; 含运动部件及锋利刀片。</td></tr><tr><td>移液器，1–10 &amp;mu;l</td><td>Gilson</td><td>F144562</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>移液器，100–1,000 &amp;mu;l（起始套装）</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>移液器，2–20 &amp;mu;l（起始套装）</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>移液器，20–200 &amp;mu;l（起始套装）</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>六角扳手，可高压灭菌，5/16&quot;</td><td>Steritool</td><td>10302</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管，带棉塞</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-8B</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>玻璃培养皿，可高压灭菌</td><td>Corning</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>手动移液器（Pipet Aid）</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>垫片</td><td>McMaster-Carr</td><td>VARIABLE</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>带滤芯移液器吸头，10 &amp;mu;l，无菌</td><td>AvantGuard</td><td>AV10R-H</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>带滤芯移液器吸头，1,000 &amp;mu;l，无菌</td><td>AvantGuard</td><td>AV1000</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>带滤芯移液器吸头，20 &amp;mu;l，无菌</td><td>AvantGuard</td><td>AV20-H</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>带滤芯移液器吸头，200 &amp;mu;l，无菌</td><td>AvantGuard</td><td>AV200-H</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>一次性无菌移液管，全塑料包装，10 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10J</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>一次性无菌移液管，全塑料包装，2 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675-3C</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>一次性无菌移液管，全塑料包装，25 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10K</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>一次性无菌移液管，全塑料包装，5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10H</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>灭菌袋，19 × 33 cm</td><td>Crosstex</td><td>SCL</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>细胞筛，40 &amp;micro;m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿，60 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>可互锁式四向试管架</td><td>Fisherbrand</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisherbrand</td><td>S52602Q</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>神经前体细胞特异性处理试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>神经干细胞扩增培养基（Stemline）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3194-500ML</td><td>必须使用 Stemline 品牌</td></tr><tr><td>重组人表皮生长因子（EGF）</td><td>Millipore</td><td>GF316</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>重组人白血病抑制因子（LIF）</td><td>Millipore</td><td>LIF1010</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>台盼蓝（0.4%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>多个制造商/供应商</td></tr><tr><td>TrypLE Select（1×）</td><td>Life Technologies</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

一种适用于cgmp的扩增方法，用于由多能干细胞或胎儿脑组织衍生的人类神经干细胞与前体细胞聚集体

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

一种能够从单个样本中大量扩增细胞以用于科研实验和临床试验的细胞扩增技术，将极大地造福干细胞研究领域。目前许多扩增方法繁琐且成本高昂，而涉及完全解离的方法可能导致多种干细胞和前体细胞发生分化或过早衰老。为克服这些问题，我们开发了一种自动化机械传代方法，称为“切碎法”（chopping），该方法操作简单且成本低廉。该技术避免使用化学或酶解方法将组织解离为单个细胞，而是支持在保持细胞间持续接触的前提下，实现悬浮球状培养物的大规模扩增。该切碎法最初主要用于胎儿脑源性神经前体细胞或神经球，最近已发表用于胚胎干细胞和诱导性多能干细胞来源的神经干细胞。该操作过程包括将神经球接种于组织培养培养皿中，随后用锋利且无菌的刀片穿过细胞团，从而实现对每个神经球的手动机械解离过程的自动化。细胞在悬浮培养中具有有利的表面积与体积比；例如，直径小于0.5 mm的单个神经球内可培养超过50万个细胞。在一只T175培养瓶中，悬浮培养可生长超过5000万细胞，而贴壁培养仅能生长约1500万细胞。尤为重要的是，该切碎法已在现行药品生产质量管理规范（cGMP）条件下应用，可用于生产临床级细胞产品的大量制备。

<img alt="细胞生长方法比较；细胞形态在切碎前后的图表和显微镜图像；荧光。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 代表性数据。A) 在p19代冻存的人神经前体细胞（hNPCs），解冻后通过酶消化法以贴壁单层方式扩增，其细胞数量变化与通过切碎法传代的神经球进行比较。第0天表示在p20代解冻细胞的时间点。B) 切碎前神经球的代表性图像，10倍放大。C) 切碎后神经球的代表性图像，10倍放大。D) 在可比cGMP条件下用于描述培养基条件化程度的颜色样卡。E) 解冻后p29代hNPCs接种培养1天后的免疫...

本方案描述了一种新型的机械切碎方法，该方法可在无需解离为单细胞悬液的情况下实现球形神经干细胞及祖细胞聚集体的扩增。&#160;维持细胞间的接触可实现超过40代的快速且稳定的生长。

一种适用于cGMP的扩增方法，用于由多能干细胞或胎儿脑组织衍生的人类神经干细胞与前体细胞聚集体

一种用于从单个样本中扩增大量细胞以用于科研实验和临床试验的细胞扩增技术，将极大促进……

以下实验的总体目标是高效传代神经球，以在整个培养细胞的生命周期中维持细胞间的接触。该技术可为人类神经前体细胞创造所需的扩增条件。该方法通过合并最多两瓶相同细胞的T175培养瓶，转移至锥形管中，随后将神经球转移至培养皿，作为第二步，将悬浮的神经球浓缩为培养皿上易于操作的团块，从而便于刀片将hNPCs切割成小细胞簇。接下来，将传代或切碎的神经球重新悬浮，以从培养皿中分离细胞并接种至新的培养瓶中。实验结果表明，与采用标准酶法传代的细胞相比，切碎法可实现长期的对数生长，基于扩增曲线显示出更持久的生长能力。该技术的可视化演示至关重要，尤其对于神经球的培养而言。缩合步骤很难用文字描述清楚，且该过程存在若干技巧。如果未能将培养皿中多余的培养基完全去除，类球体将会在培养基中被推动移动，而不会分裂成更小的细胞簇。开始此操作前，先观察 H NPCs 培养瓶中培养基的颜色。在显微镜下扫描培养瓶以观察细胞。如有可能，使用测径工具检测多个细胞球的大小。如果大量球状体的直径达到300微米或更大，则进行切碎操作，每7至10天切碎一次细胞。然后将培养瓶放回培养箱中，并安装切碎装置。打开切碎装置的电源开关。在生物安全柜中，将切片厚度设置为 200 微米，刀片力度设置为 180 度或九点钟位置。接着，确认自动速度旋钮已逆时针旋转至最末端。然后将载物台释放旋钮尽可能向右移动，并确认载片夹稳固。顺时针旋转手动臂操作器，将臂升至最高位置。随后，无菌转移一把无菌双刃切碎刀至切碎器臂的螺栓上。使用镊子，用镊子将卡扣固定在刀片上。卡扣的弯曲部分必须位于臂部的上边缘之上。接下来，将卡扣固定在臂部上，并将螺母拧到螺栓上。使用无菌螺母起子，使螺母留出四分之一圈的松动余量。在此步骤中，将推荐量的维持培养基转移至新的培养瓶中。随后，将细胞从培养箱无菌转移至生物安全柜。将培养瓶倾斜放置在试管架上，使球状细胞在瓶内自然沉降。取一个已贴壁的培养瓶，用10毫升血清移液管吸取最多12毫升上清液，并将瓶壁表面所有松散附着的细胞球冲洗下来。根据需要重复操作，并在传代之间让类球体自然沉降。然后，将建议体积的条件培养基转移至新的培养瓶中。接着，将所有剩余的条件培养基和类球体转移至一个新的15毫升圆锥形离心管中。让细胞球沉降，弃去已使用的烧瓶。随后，将15毫升锥形管中的细胞以尽可能低的体积缓慢转移至60毫米培养皿或垫片圆盘上。保留剩余的条件培养基，因其将在后续切碎操作后用于冲洗培养皿中的细胞。尽量减少培养基和类球体在培养皿上覆盖的表面积。接着，通过将上清液转移回15毫升锥形管中，开始浓缩类球体悬液。使用带气溶胶屏障的微量移液器，尽可能吸除培养基-细胞悬液顶部的多余培养基。直到无法在不带走类球体的情况下移除培养基时，再将液体铺开。使用移液枪头的侧面以增大接触面积，轻轻倾斜培养皿，并用移液枪头的侧面将所有类球体轻柔地推至液滴的一侧。待所有细胞完成重新分布后，缓慢将培养皿向相反方向倾斜，使培养基与类球体分离。随后，将澄清的培养基转移回15毫升锥形管中。用移液器吸头的侧面轻轻推动，将所有球体滑回培养皿的中央，使液滴的直径保持在0.5至2.4厘米之间。保持球状体培养池的深度较浅非常重要。如果池过深，在切碎过程中球状体会被推到旁边。现在，将培养皿转移至板架上，并用板架上的挂钩固定。使用表格释放旋钮将培养皿架向左滑动，使刀片远离球体并锁定在齿轮中。接着，顺时针旋转手动操作旋纽以降低切碎臂，直到刀片迅速向下并平整地贴合在培养皿上。在拧紧螺母的同时，向下按压臂架固定座。然后按下复位按钮。用一只手稳住培养皿，同时顺时针旋转自动臂操纵旋钮至90度或12点钟位置，当所有球体均被切碎后开始切片。将培养皿支架旋转90度。然后松开螺栓，放下机械臂，重新拧紧螺母。重复切碎操作。随后在无菌条件下，将培养皿从平板架转移至生物安全柜内的工作区域。将一毫升条件培养基转移至切碎的球体上。然后轻轻重悬，并将切碎的球体转移至新的15毫升锥形管中。尽量避免产生气泡，并根据需要重复多次，以收集全部切碎的球体。测量条件培养基和切碎的类球体的体积。加入适量的维持培养基，使总体积达到表二 E 列建议的体积。随后，将类球体悬液接种至每个新的培养瓶中，每次仅将悬液转移至一个培养瓶，并在转移之间重新混悬类球体。每个培养瓶中的最终体积应等于表二 F 列建议的体积。将切碎的人神经前体细胞（h NPCs）放入培养箱中培养。该图显示了在第19代冻存后解冻并以贴壁单层形式通过酶法解离进行扩增的人神经前体细胞（H NPCs）的预期细胞数量，与通过切碎法传代的神经球进行比较。以下是10倍放大下切碎前和切碎后神经球的代表性图像。该图像显示了解冻后第29代H NPCs接种一天后针对nestin染色的表达情况，而该图像显示了解冻后第29代H NPCs在无生长因子条件下接种七天后针对GFAP和βIII微管蛋白（beta three tubulin）的染色结果。观看本视频后，您应能充分理解如何使用自动化切片技术传代人脑细胞（HBCs），该技术可在细胞及其培养的整个生命周期中维持细胞间的接触。此方法可适用于多种细胞类型，例如由多能细胞衍生的神经干细胞或心球细胞。

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人类神经的聚集体cGMP的适用展开法干细胞和祖细胞来源从多能干细胞或胎儿脑组织

在体外操控人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）的能力，使得研究人员能够探索其作为细胞移植用于治疗目的的潜力，并研究人类神经系统的发育过程。本方案介绍了一种培养和传代hNSPCs的方法，旨在提高人类干细胞研究的可重复性。...

人神经干细胞的传代

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从废弃的人类胎儿皮质组织中生成神经干细胞

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在多孔板格式中快速高效地从人类多能干细胞生成神经元

本视频展示了如何从非转基因和转基因的人类多能干细胞（hPSCs）生成神经前体细胞。通过使用神经分化培养基，将hPSCs分化为神经前体细胞。在非转基因细胞中，使用小分子诱导分化；而在转基因hPSCs中，则通过添加抗生素来激活神经分化特异性转录因子的启动子，从而诱导其分化。...

非转基因与转基因人类多能干细胞向神经前体细胞的分化

该实验通过模拟人类发育过程中所经历的类似检查点，获得端脑神经元。细胞首先被允许自发分化，随后暴露于促使其向神经谱系分化的因子中，再经过分离后接种至盖玻片上，以促进其终末分化与成熟。...

从人类多能干细胞诱导端脑谷氨酸能神经元的特化

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成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

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96孔板格式下对人诱导多能干细胞来源神经元进行高速拉伸损伤的方法

在本实验方案中，我们旨在描述一种可重复的方法，用于将解离的人多能干细胞来源的神经元与星形胶质细胞共同组合形成三维球状共培养体系，在悬浮条件下维持这些细胞球的生长，并随后通过免疫分析和多电极阵列记录来检测细胞球中突触环路的活性。...

利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型

本方案描述了一种动态培养系统，用于在化学成分明确且无饲养层的条件下，利用一次性生物反应器生成尺寸可控的人多能干细胞聚集体，并进一步诱导其向小脑类器官分化。...

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