一种适用于cGMP的扩增方法，用于由多能干细胞或胎儿脑组织衍生的人类神经干细胞与前体细胞聚集体

以下实验的总体目标是高效传代神经球，以在整个培养细胞的生命周期中维持细胞间的接触。该技术可为人类神经前体细胞创造所需的扩增条件。具体方法是将最多两个相同细胞的T175培养瓶合并，转移至锥形管中，随后将神经球转移至培养皿，作为第二步，将悬浮的神经球浓缩为培养皿上易于操作的团块，从而便于刀片将人类神经前体细胞（HNPCs）切割成小的细胞簇。

接下来，将传代或切碎的神经球重新悬浮，以从培养皿中分离细胞并接种至新的培养瓶中。实验结果表明，与采用标准酶法传代的细胞相比，切碎法可实现长期对数生长，是一种基于扩增曲线所证实的长期生长策略。该技术的可视化演示至关重要，尤其对于神经球的培养而言。

缩合步骤在文字描述上较为困难，且该过程存在若干操作技巧。若未将培养皿中多余的培养基完全移除，类球体将会在培养基中被推动移动，而无法分裂成更小的细胞簇。

开始此操作时，首先观察 H NPCs 培养瓶中培养基的颜色。在显微镜下扫描培养瓶以观察细胞。如有可能，使用测径工具检测多个细胞球的大小。

如果大量球状体的直径达到300微米或更大，则进行切碎操作，每7至10天将细胞切碎一次。然后将培养瓶放回培养箱中，并安装切碎装置。打开切碎装置的电源开关。

在生物安全柜中，将切片厚度设置为 200 微米，刀片力度设置为 180 度或九点钟位置。接着，确认自动速度旋钮已逆时针旋转至最远位置。然后将载物台释放旋钮尽可能向右旋转，并确认载片夹稳固。

顺时针旋转手动臂操作器，将臂升至最高位置。随后，无菌转移一把无菌双刃切碎刀至切碎器臂的螺栓上。使用镊子，用镊子将卡扣固定在刀片上。

卡扣的弯曲部分必须覆盖在臂的上边缘。接下来，将卡扣固定在臂上，并将螺母拧到螺栓上。使用无菌螺母起子，使螺母留出四分之一圈的松动余量。

在此步骤中，将推荐量的维持培养基转移至新的培养瓶中。随后，将细胞从培养箱无菌转移至生物安全柜。将培养瓶倾斜放置在试管架上，使细胞球在培养瓶中沉降。

静置后，吸取最多12毫升上清液。使用10毫升血清移液管，将烧瓶表面所有松散附着的球状物冲洗下来。

根据需要重复操作，并在传代之间让类球体自然沉降。然后，将推荐体积的条件培养基转移至新的培养瓶中。接着，将所有剩余的条件培养基和类球体转移至一个新的15毫升圆锥形离心管中。

让细胞球自然沉降，弃去已使用的烧瓶。随后，将15毫升锥形管中的细胞以尽可能低的体积缓慢转移至60毫米培养皿或垫片上。保留剩余的条件培养基，因其将在后续切碎操作后用于冲洗培养皿中的细胞。

尽量减少培养基和类球体在培养皿上覆盖的表面积。接着，通过将上清液转移回15毫升锥形管中，开始浓缩类球体悬液。使用带气溶胶屏障的微量移液器，尽可能吸除培养基-细胞悬液顶部的多余培养基。

直到无法在不带走类球体的情况下移除培养基时，再将液体铺开。使用移液枪头的侧面以增大接触面积，轻轻倾斜培养皿，并用移液枪头的侧面将所有类球体轻柔地推至液滴的一侧。待所有细胞完成重新分布后，缓慢将培养皿向相反方向倾斜，使培养基与类球体分离。

随后，将澄清的培养基转移回15毫升锥形管中。用移液器吸头的侧面轻轻推动，将所有球体滑回培养皿的中央，使液滴的直径保持在0.5至2.4厘米之间。

保持球状体培养池的深度较浅非常重要。如果池过深，在切碎过程中球状体会被推到旁边。现在，将培养皿转移至板架上，并用板架上的挂钩固定。

使用表格释放旋钮将培养皿架向左滑动，使刀片远离球体并锁定在齿轮中。接下来，顺时针旋转手动操作旋钮，降低切碎臂，直到刀片迅速向下并平整地贴合在培养皿上。在拧紧螺母的同时，向下按压臂架固定装置。

然后按下复位按钮。用一只手稳住培养皿，同时顺时针旋转自动臂操纵旋钮至90度或12点钟位置，当所有球体均被切碎后开始切片。将培养皿支架旋转90度。

然后松开螺栓，放下机械臂，重新拧紧螺母。重复切碎操作。随后在无菌条件下，将培养皿从平板架转移至生物安全柜内的工作区域。

将一毫升条件培养基转移至切碎的球体上。然后轻轻重悬，并将切碎的球体转移至新的15毫升锥形管中。尽量避免产生气泡，并根据需要重复多次，以收集全部切碎的球体。

测量条件培养基和切碎的类球体的体积。加入适量的维持培养基，使体积达到表二 E 列建议的体积。然后，将类球体悬液逐个转移至每个新的培养瓶中，每次仅将类球体悬液转移至一个培养瓶，并在转移之间重新悬浮类球体。每个培养瓶中的最终体积应等于表二 F 列建议的体积。将切碎的人神经前体细胞（h NPCs）放入培养箱中培养。

该图显示了在第19代冻存的人神经前体细胞（H NPCs），解冻后通过酶消化法以贴壁单层培养方式扩增，其细胞数量的预期情况，与采用切碎法传代的神经球进行比较。以下是切碎前和切碎后神经球在10倍放大下的代表性图像。该图像显示了解冻后第29代H NPCs接种一天后，经nestin染色检测其表达情况；而该图像显示了解冻后第29代H NPCs在无生长因子条件下接种七天后，经GFAP和βIII微管蛋白（beta three tubulin）染色的结果。

观看本视频后，您应能够充分理解如何使用自动化切碎技术传代人脑细胞（HBCs），该方法可在细胞及其培养的整个生命周期中维持细胞间的接触。此操作步骤可适用于多种细胞类型，例如由多能细胞衍生的神经干细胞或心球细胞。