Name: 该ChroP方法结合芯片和质谱剖析染色质的基因座特异性蛋白质组学风景 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T21:00:00.000+00:00
Duration: 24 min 2 s
Description: 学习ChroP方法，结合染色质免疫沉淀与高分辨质谱技术，分析组蛋白修饰及非组蛋白在特定染色质区域的蛋白质组构成，揭示基因调控机制。

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本研究最初发表于《分子与细胞蛋白质组学》。Soldi M. 和 Bonaldi T. 关于染色质功能结构域的蛋白质组学研究揭示了不同异染色质组分之间的新型协同作用，《MCP》。2013；12：64-80。© 美国生物化学与分子生物学学会。我们感谢Roberta Noberini（意大利理工学院和IEO，意大利）对本文稿的审阅。TB的研究工作得到了Giovanni Armenise-Harvard基金会职业发展项目、意大利癌症研究协会以及意大利卫生部资助项目的资助。MS的研究工作得到了FIRC博士后奖学金的支持。

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<li>Young, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+characterization+of+combinatorial+histone+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High throughput characterization of combinatorial histone codes.</a> Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

我们近期描述了一种名为ChroP的定量策略，用于大规模表征染色质的蛋白质组分。ChroP结合了表观遗传学领域中两种互补的方法——ChIP和质谱（MS），充分利用了二者的优势并克服了各自的局限性。与深度测序联用的ChIP（ChIP-Seq）能够在少数核小体分辨率下实现组蛋白修饰的全基因组定位35。尽管基于抗体的检测方法具有较高的灵敏度，但其在区分相似修饰以及解析组蛋白密码的组合特性方面存在局限性36。另一方面，质谱能够对组蛋白翻译后修饰（hPTMs）进行全面且无偏倚的分析，无论单个修饰还是组合修饰均可检测9，但迄今为止该技术主要用于整体染色质的分析，因而缺乏关于位点特异性翻译后修饰模式的信息。我们采用一种改良的ChIP方法来分离功能上不同的染色质区域，并结合质谱技术对组蛋白PTM模式以及特异性共富集的非组蛋白进行表征。
通过使用N-ChroP，对与H3K9me3共定位的组蛋白翻译后修饰（hPTMs）进行分析，结果显示与沉默染色质相关的标记物显著富集，而与活性染色质相关的修饰则显著减少。这些结果与先前研究37<...

染色质是一种高度动态的核蛋白复合物，作为所有DNA介导过程的主要模板。核小体是染色质的基本重复单位，由包含两种分子的典型组蛋白H2A、H2B、H3和H4组成的蛋白质八聚体核心构成，其周围缠绕着147 bp的DNA1,2所有核心组蛋白均具有球状结构域和柔性末端 N-末端“尾部”向外突出于核小体之外。调控染色质结构与动态的主要机制之一是基于共价翻译后修饰（PTMs），这些修饰主要发生在组蛋白的N末端尾部 N组蛋白的末端3,4组蛋白修饰可通过改变染色质的高级结构，或改变组蛋白-DNA之间以及核小体之间的相互作用，从而调控DNA结合蛋白对DNA的可及性顺式 机制），或作为调控蛋白的停泊位点，无论是以单体形式存在，还是嵌入多聚复合物中。这些调控蛋白可通过多种方式发挥其功能：通过直接调节基因表达（即 TAF蛋白），或通过改变核小体定位（即 染色质重塑复合物）或通过修饰其他组蛋白残基（即 具有甲基转移酶或乙酰转移酶活性的蛋白质）（转 机制5观察到不同的翻译后修饰模式在特定染色质位点上聚集，由此提出了一个假说：不同位点上的修饰可能协同作用，形成一种分子编码，从而介导其下方DNA的功能状态。 &#34;组蛋白密码假说&#34; 多年来已获得广泛共识，但其实验验证因技术限制而进展缓慢6,7.
基于质谱（MS）的蛋白质组学已成为绘制组蛋白修饰模式和表征染色质结合蛋白的有力工具8。质谱通过检测肽段的实验质量与理论质量之间的特定质量差（Δmass）来识别修饰。在单个组蛋白水平上，质谱提供了一种无偏倚且全面的翻译后修饰（PTM）定位方法，能够检测新的修饰类型，并揭示修饰之间的相互作用9-14。
近年来，已开发出多种策略用于解析染色质的蛋白质组组成，包括对完整有丝分裂染色体的表征15可溶性hPTM结合蛋白的鉴定16-18 以及特异性染色质区域的分离与分析（即 端粒19,20然而，针对组蛋白PTMs、变体与染色质相关蛋白之间在特定基因座上的协同作用的研究仍不完善。本文介绍了一种名为ChroP的新方法（Chro早晨 P蛋白质组学)21我们已开发出一种高效表征功能各异染色质区域的方法。该方法基于染色质免疫沉淀（ChIP）技术——一种表观遗传学研究中广泛应用的成熟实验流程——并将其优化用于富集样本的质谱（MS）蛋白质组学分析。根据输入染色质的类型及质谱分析所针对的科学问题，我们建立了两种不同的实验流程：1）对未交联的天然染色质进行MNase消化后开展ChIP，用于纯化单核小体并解析其共定位的组蛋白翻译后修饰（N-ChroP）；2）对交联后经超声破碎的染色质进行ChIP，并结合基于SILAC的互作蛋白质组学策略，以全面鉴定共富集的染色质结合蛋白（X-ChroP）。本文以H3K9me3作为免疫沉淀的靶标，示范了N-ChroP与X-ChroP联合用于异染色质的富集与研究。ChroP技术可进一步拓展应用于染色质上不同区域的研究，或用于分析同一区域在功能状态转变过程中染色质组成的变化，从而为表观遗传学的多种研究提供新途径。

<table><tbody><tr><td>DMEM&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>SILAC DMEM</td><td>M-Medical</td><td>FA30E15086</td><td></td></tr><tr><td>透析FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>赖氨酸0（12C6 14N2 L-赖氨酸）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>精氨酸0（12C6 14N4 L-精氨酸）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6969</td><td></td></tr><tr><td>赖氨酸8（13C6 15N2 L-赖氨酸）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68041</td><td></td></tr><tr><td>精氨酸10（13C6 15N4 L-精氨酸）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>微球菌核酸酶</td><td>Roche</td><td>10 107 921 001</td><td></td></tr><tr><td>完全型无EDTA蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 3透析管，3.5K分子量截留值，18 mm平展宽度，50英尺长度</td><td>Spectrumlabs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>抗组蛋白H3三甲基化K9（ChIP级）</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>组蛋白H3三甲基化K9肽段&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab1773</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12%&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Bis-Tris凝胶&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>胶体蓝染色试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>LDS上样缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175641-1G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺 &amp;ge;99%（HPLC），结晶态</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>测序级修饰胰蛋白酶，冷冻保存，100 &amp;mu;g（5 &amp;times; 20 &amp;mu;g）</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Nanospray OD 360&amp;mu;m × ID 75&amp;mu;m，尖端ID 8 &amp;mu;m，未涂层 Pk 5</td><td>Microcolumn Srl</td><td>FS360-75-8-N-5-C15</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ，3 &amp;micro;m&amp;nbsp;&amp;nbsp; 15% C</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.aq.</td><td></td></tr><tr><td>碳萃取盘，47 mm</td><td>Agilent Technologies</td><td>12145040</td><td></td></tr><tr><td>阳离子萃取盘</td><td>Agilent Technologies</td><td>66889-U</td><td></td></tr></tbody></table>

chrop 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

染色质是一种高度动态的核蛋白复合物，由DNA和蛋白质组成，可调控多种依赖DNA的生命过程。特定区域的染色质结构与功能受到局部组蛋白翻译后修饰（hPTMs）和组蛋白变体、染色质结合蛋白（包括转录因子）以及DNA甲基化的调控。迄今为止，由于缺乏高效的实验方案来富集足够纯度和数量的特定功能区域染色质，从而限制了通过质谱法（MS）对其进行深入的蛋白质组学表征。本文介绍了一种新设计的染色质蛋白质组学策略，命名为ChroP（Chromatin Proteomics），该方法利用制备型染色质免疫沉淀技术分离特定的染色质区域，并通过质谱分析这些区域在组蛋白翻译后修饰、组蛋白变体及共结合的非组蛋白成分等方面的特征。本文以富含组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化标记的转录沉默异染色质区域为例，详细阐述了ChroP技术的建立及其在富集与分析中的应用。实验结果表明，ChroP 能够全面表征异染色质的蛋白质组，是一种强大的分析策略，有助于揭示染色质中不同蛋白质决定因子如何相互作用并协同作用，从而建立位点特异性的结构与功能构型。

染色质免疫沉淀是一种强大的技术，用于分析蛋白质或组蛋白修饰在基因组上的定位。在蛋白质组学的等效应用中，染色质免疫沉淀（ChIP）后接基于质谱（MS）的蛋白质组学分析，以定性和定量地鉴定与作为“诱饵”的目标修饰或蛋白质共同免疫沉淀的组蛋白翻译后修饰（hPTMs）、组蛋白变体以及染色质结合蛋白。在如图1A所示的N-ChroP方法中，采用天然染色质免疫沉淀（native ChIP）作为起始材料，其中染色质经MNase酶解（图1B），用于从总染色质中纯化出特定的功能结构域。将富含单核小体的酶解染色质与特异性抗体孵育，然后通过SDS-PAGE分离免疫纯化的蛋白质。在本示例中，选用沉默染色质的标志物H3K9me332,33来建立该方法。这一选择基于以下事实：H3K9me3的功能角色及其部分相互作用蛋白已有充分描述。此外，已有针对ChIP优化的高特异性且高效的抗体可供使用34，这一点也通过考马斯亮蓝凝胶的目视检查得到证实，在凝胶中完整核小体的核心组蛋白以正确的化学计量比被富集，并达到适合质谱分析的适量水平（图1D</stro...

通过结合天然染色质免疫沉淀与交联染色质免疫沉淀，并联合高分辨率质谱技术，ChroP 方法能够解析在功能各异的染色质区域中组蛋白修饰、组蛋白变体以及非组蛋白协同作用的复合蛋白质组结构。

ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

染色质是一种高度动态的核蛋白复合物，由DNA和蛋白质组成，可调控多种依赖DNA的生命过程。染色质结构与……

本实验的总体目标是表征功能上不同的染色质区域的蛋白质组组成，以理解不同组分如何协同作用从而决定转录状态。首先从培养的细胞中分离细胞核，并通过酶法或机械方法将染色质切割成适宜长度的片段。第二步是利用针对组蛋白翻译后修饰或特异性标记目标区域的蛋白质的“诱饵”抗体，通过免疫沉淀从大量染色质中纯化出特定的功能区域。接下来，通过 SDS-PAGE 分离免疫纯化的染色质蛋白，并在凝胶内进行酶解，随后进行质谱分析。下一步是在高分辨率仪器上进行液相色谱-质谱分析。最终，利用专门软件分析质谱原始数据，再通过人工检查质谱图，根据免疫沉淀材料相对于输入样本的相对丰度计算，或基于 SLAC 比值及使用可溶性肽段作为诱饵竞争物的竞争实验，分别鉴定和定量组蛋白修饰及共富集蛋白。通过 Crop 技术，我们可以深入了解组蛋白修饰模式与变异之间的相互作用，以及这些修饰如何影响特定染色质区域和由此招募的核内相互作用，这些过程共同协调发挥作用。为了定义对基因表达具有调控作用的特定染色质结构，Crop 方法相较于基于体外筛选可溶性互作因子或组蛋白修饰（例如 pull-down）的现有方法，其主要优势在于能够利用组蛋白肽段或重建的染色质模板，在更接近天然、更少人为干扰的条件下研究特定基因座的染色质组成。Crop 方法的应用还可拓展至其他模式系统或时间依赖性研究。例如，我们可以使用一种对特定扰动产生全局转录响应的细胞系进行实验。本实验操作将由我实验室的博士后 Monica Sodi 演示。用于 N 芯片实验的细胞核由未标记的细胞制备。He A S3 细胞在每次实验中使用一到两乘以十的八次方个细胞。收集细胞时，将五个乘以十的七次方个细胞分装到四个 50 毫升离心管中，在 4 摄氏度下以 340 × g 离心 10 分钟。用预冷的 PBS 洗涤细胞，弃去上清液并重悬。将每份细胞沉淀重悬于8 mL裂解缓冲液中，转移至15 mL离心管。在4°C下于旋转仪上孵育10分钟。随后，小心地将每份细胞裂解液铺加到蔗糖垫上，于摆动转子中在4°C下以3,270 × g离心20分钟，以分离细胞核与细胞质。弃去上清液，并用预冷的 PBS 将细胞核沉淀在冰上洗涤两次，第二次洗涤使用预冷的 PBS。第二次洗涤弃去上清液后，将所有细胞核收集至一个 50 毫升离心管中。将核沉淀重悬于1毫升消化缓冲液中。将每个样品分为两份，每份500微升，并置于冰上。向每份样品中加入5微升MNA，使终浓度为每微升核悬液含0.005单位酶。轻轻混匀，37摄氏度孵育60分钟。加入1毫摩尔EDTA终止反应，并置于冰上。在4摄氏度下以7,800 ×g离心10分钟，沉淀消化后的细胞核。将上清液转移至两个离心管中，并在4°C下保存。此为S1组分，含有染色质的第一个可溶性组分，包括单核小体。小心地将沉淀重悬于1毫升透析缓冲液中，并在3升透析缓冲液中于4°C下透析过夜

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

该ChroP方法结合芯片和质谱剖析染色质的基因座特异性蛋白质组学风景

配对末端标签测序法染色质相互作用分析（ChIA-PET）是一种用于 从头合成...

配对末端标签测序染色质相互作用分析（ChIA-PET）用于绘制染色质相互作用图谱及解析转录调控机制

质谱技术的进步使得对多种组织中蛋白质表达和修饰的高通量分析成为可能。结合亚细胞组分分离技术和疾病模型，定量质谱分析与生物信息学方法能够揭示生物系统中的新特性。本文所述方法用于分析心脏疾病背景下与染色质相关的蛋白质，且可轻松适用于其他人类疾病的体内模型。...

疾病中染色质蛋白质组的定量分析

为了理解特定基因组功能区域的调控机制，需要鉴定与这些区域相关的分子。本实验方案描述了利用人工设计的DNA结合分子介导的染色质免疫沉淀（enChIP）技术，来鉴定与特定基因组区域相关的蛋白质和RNA的操作步骤。...

通过enChIP技术分离特定基因组区域及鉴定其相关分子

本文介绍了一种优化的高通量染色质免疫沉淀测序（ChIP-sequencing）实验方案及相应的计算分析流程，用于从冻存的肿瘤组织和细胞系中确定全基因组范围内的染色质状态模式。...

利用高通量ChIP-测序在肿瘤组织中进行全基因组染色质状态作图的整合平台

该方法通过特异性序列捕获交联的染色质，进而进行蛋白质组学分析，从而在特定靶位点鉴定新的DNA相互作用蛋白。该方法无需预先了解潜在的结合蛋白，也无需对细胞进行修饰。该技术最初为酵母开发，现已适用于哺乳动物细胞。...

染色质相关蛋白杂交捕获技术在哺乳动物细胞蛋白质组学中的应用优化

我们描述了一种串联染色质免疫沉淀测序（tChIP-Seq）的逐步实验方案，该方法可用于分析特定细胞类型的全基因组组蛋白修饰。...

TChIP-Seq：细胞类型特异性表观基因组分析

CUT&amp;#38;RUN 及其变体可用于确定蛋白质在染色质上的占据情况。本实验方案描述了如何利用单细胞 uliCUT&amp;#38;RUN...

使用超低输入量靶向切割与核酸酶释放技术进行染色质上单细胞因子定位

本方案描述了染色质捕获结合高通量测序（Capture...

通过捕获式 Hi-C 解析高分辨率 3D 染色质结构 via Capture Hi-C

基因表达受到基因启动子与远端调控元件相互作用的调控。本文介绍了低起始量的捕获染色体构象捕获技术（liCHi-C）如何实现对稀有细胞类型中这些相互作用的鉴定，而这些细胞类型在此前是无法测量的。...

一种用于在稀有细胞群体中研究以启动子为中心的时空基因组结构的整合工作流程

我们提出了一种三色染色质单分子定位显微镜（SMLM）染色与分析方案，可实现常染色质、异染色质和RNA聚合酶II（RNAP...

一种用于在致密核环境中研究染色质的多标记单分子定位显微镜实验方案

学习ChroP方法，结合染色质免疫沉淀与高分辨质谱技术，分析组蛋白修饰及非组蛋白在特定染色质区域的蛋白质组构成，揭示基因调控机制。

ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

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