该ChroP方法结合芯片和质谱剖析染色质的基因座特异性蛋白质组学风景

该程序的总体目标是表征功能不同的染色质结构域的蛋白质组学组成，以了解不同元素如何协同作用以确定转录状态。八。这是通过首先从培养的细胞中制备细胞核并通过酶或机械方式将染色质消化成最佳长度的片段来实现的。第二步是使用针对组蛋白翻译后修饰或已知特异性标记感兴趣区域的蛋白质的诱饵抗体，通过免疫沉淀从大量染色质中纯化一个不同的功能域。

接下来，通过 SDS 页面分离免疫纯化的染色质蛋白，并在质谱分析之前消化 ingel。以下步骤是在高分辨率仪器上进行液相色谱质谱分析。最终，通过临时软件分析质谱原始数据，然后手动检查光谱以识别和量化组蛋白修饰和 coen 富集蛋白质，分别基于免疫沉淀材料中相对于输入的相对丰度的计算或 SLAC 比率和竞争实验使用可溶性肽作为诱饵的竞争对手通过作物， 我们可以深入了解组织修饰模式和变异之间的相互作用，并达到特定的染色质区域和由此募集的核相互作用，它们都以协同方式发挥作用。

为了定义对基因表达具有调节作用的特定染色质景观，作物相对于基于可溶性相互作用或组织修饰的体外筛选的现有方法的主要优势，例如 ASS 下拉。使用组蛋白肽或重构的染色质模板可以在更天然、较少人工的条件下研究基因座特异性染色质组成。裁剪的应用也可以扩展到其他模型系统或时间依赖性研究中。

例如，我们可以在细胞系中使用 crop，该细胞系响应某些扰动，从而引发全局转录响应。演示此程序的是 Monica Sodi。我实验室的 N 芯片程序的 Nuclei 的博士后是从未标记的制备的。

He A S3 细胞每次实验使用 1 至 2 乘以 10 至 8 个细胞。要收获细胞，将 5 x 10 的 7 个细胞分成 4 个等分试样，每个等分试样为 5 乘以 10，并在 4 摄氏度下以 340 倍 G 离心 10 分钟。用冰冷的 PBS 洗涤细胞，弃去上清液和复苏。

将每个细胞沉淀悬浮在 8 毫升中，裂解、缓冲并转移到 15 毫升试管中。在 4 摄氏度下在旋转轮上孵育 10 分钟。接下来，小心地将每种细胞裂解物倒在蔗糖垫上，并在 4 摄氏度下以 3， 270 倍 G 的水平转子离心 20 分钟，以分离细胞核和细胞质。

弃去上清液，在冰中洗涤 nu 核沉淀两次。第二次洗涤时冷 PBS。丢弃第二次洗涤的上清液后，将细胞核汇集在一个 50 毫升的试管中。

细胞核沉淀重悬于 1 mL 消化缓冲液中。将每个样品分成两份 500 μL 的等分试样，并保持在冰上。向每个等分试样中加入 5 微升 MNA，相当于每微升细胞核 0.005 单位酶的最终浓度。

轻轻混合并在 37 摄氏度下孵育 60 分钟。加入 1 毫摩尔 EDTA 以终止反应并保持在冰上。通过在 4 摄氏度下以 7， 800 倍 G 离心 10 分钟来沉淀消化的细胞核。

将上清液转移到两个试管中，并在 4 摄氏度下储存。这是 S one 级分，它包含包含单核细胞区的染色质的第一可溶性部分，小心地将沉淀重悬于 1 毫升透析液中，缓冲液并在 4 摄氏度下在 3 升透析缓冲液中透析过夜，并在第二天持续温和搅拌。收集透析材料，并在 4 摄氏度下以 7， 800 倍 G 离心 10 分钟。

将 super natin 转移到新的嵌血管中。这是 S 两个部分，根据 M a 的消化程度，它染色到 tta 核小体上。免疫沉淀前在 4 摄氏度下储存。

通过aros凝胶电泳和目视检查核小体阶梯的消化质量和缺陷，如本例所示，级分S 1在单核细胞区高度富集，而级分S 2主要包含用于染色质免疫沉淀的核小体。首先，向级分 S 中加入一体积的芯片稀释缓冲液。然后添加针对组蛋白翻译后修饰或目标蛋白的抗体，并于第二天在 4 摄氏度的旋转轮上孵育过夜。

使用蛋白 G 偶联磁珠分离染色质。向 S one 染色质样品中加入 100 μL 封闭的微珠，并在 4 摄氏度的旋转轮上孵育 3 小时。三个小时后。

以 340 倍 G 离心 1 分钟。将 einor 管放入磁架中以沉淀珠子。保存上清液，即含有未结合核小体的流过。

向磁珠中加入洗涤缓冲液，并在离心前在 4 摄氏度下在旋转轮上孵育 5 分钟。以这种方式，随着盐浓度的增加，总共洗涤珠子四次。用 75 毫摩尔氯化钠洗涤两次，然后用 125 毫摩尔洗涤一次，用 175 毫摩尔氯化钠洗涤一次以洗脱。

氨基沉淀的染色质。将珠子在 30 微升补充有 50 毫摩尔 dihi 的 LDS 样品缓冲液中孵育。在 70 摄氏度下 3 次 etol 持续 5 分钟。

随后通过 SDS 页面分离提到的蛋白质以开始此过程，用甲醛交联细胞。向 SLAC 标记的细胞中添加 0.75% 甲醛。短暂混匀并在室温下孵育 10 分钟。

加入 125 毫摩尔甘氨酸，在室温下孵育 5 分钟，使甲醛指向。接下来，将细胞分成 2 到 4 个等分试样，每等分试样约为 5 乘以 10 到 7 个细胞。最后一次洗涤后，用冰冷的 PBS 冲洗细胞 3 次。

弃去上清液，保留沉淀，将每个细胞沉淀重悬于 10 mL 裂解缓冲液中。用 430 倍 G 的旋转离心机在 4 摄氏度下孵育 10 分钟，在 4 摄氏度下孵育 5 分钟。弃去上清液并保留核沉淀。

用洗涤缓冲液 Resus 洗涤细胞核沉淀后，将每个细胞核沉淀悬浮在 3 毫升 ChIP 孵育缓冲液中，并保持在冰上以 200 瓦的冷却生物破裂剂中碎裂染色质超声处理。去除 2% 的超声染色质，并在 65 摄氏度下孵育至少 1 小时以逆转交联。在芯片孵育缓冲液中。

这是输入材料。随后，使用 PCR 纯化试剂盒提取 DNA，并通过 aros 凝胶电泳评估染色质片段化，以免疫沉淀交联染色质。将所选抗体添加到轻和重标记的超声染色质中。

在光通道中，除了抗体外，还将过量折叠的可溶性肽分装到轻和重样品中，分别放入三个微量离心管中，第二天在 4 摄氏度下在旋转轮上孵育过夜，向每个染色质样品中加入 100 微升封闭的蛋白 G 偶联磁珠，并在旋转轮上在 4 摄氏度下孵育 3 小时。以 340 倍 G 离心 1 分钟。将 einor 管放入磁架中以沉淀珠子。

上清液是含有未结合核小体的流出物，保存用于后续对照。在洗涤缓冲液中增加盐浓度洗涤珠子四次。用 150 毫摩尔氯化钠洗涤 2 次，然后用 300 毫摩尔氯化钠洗涤 2 次。

将微珠在 95 摄氏度和 30 μL SDS 页面下孵育 25 分钟。上样缓冲液以洗脱和去交联免疫沉淀的蛋白质。最后，在质谱分析之前，合并 EIT 并通过 SDS 页面分离蛋白质。

从 NIP 中富集的组蛋白被消化以开始此过程。切下与胶体 kumasi 的核心组蛋白带相对应的凝胶切片，染色 4 至 12%BIS CITRIS 丙烯酰胺梯度凝胶，然后用 50% 乙酰腈和去离子蒸馏水与 100% 乙酰丁腈交替进行染色，以在凝胶块完全染色时收缩凝胶。在真空离心机中干燥它们。

在 1 摩尔碳酸氢铵中加入 D 6 个乙酸酐、每体积 1 至 9 体积和 3 微升乙酸钠，作为凝胶块的催化剂。在 37 摄氏度下强烈摇晃孵育 3 小时。在 100% 乙酰丁腈中收缩凝胶块，然后在真空离心机中脱水约 5 分钟，然后用冰冷的凝胶块再水化。

每微升 100 纳克试用溶液溶于 50 毫摩尔碳酸氢铵中，在 37 摄氏度下过夜。使用氘化、乙酐和胰蛋白酶消化对赖氨酸进行化学修饰的组合会产生类似组蛋白凝胶消化模式的 RC，将可溶性消化的肽收集在新的记录管中，并将肽干燥约一小时。将冻干肽重悬于 0.5% 乙酸、0.1% Tri Fluor 乙酸脱盐中，并在手工微柱上将肽浓缩在反相 C 18 碳夹心和离子交换色谱上。

将 50% 的肽上样到 C 18 碳夹心样品杯上，50% 上样到 SCX 样品台上使用 5% 氢氧化铵、30% 甲醇从 SCX 样品头和使用 80% 乙基丁腈、0.5% 乙酸的 C 18 碳样品头中洗脱肽。最后，冻干，在天然染色质免疫沉淀和作物方法中，逃避的肽和 res 将它们悬浮在 0.1% 甲酸中。第一步用 MNA 消化染色质，从大量染色质中纯化不同的功能域。

左图显示了一个小规模的 MNA 测试，其中 DNA 在不同时间间隔用 MNA 消化染色质后在 1% aros 凝胶上分离。大规模 MNA 消化如右图所示。在 MNA 染色质消化 60 分钟后，在分离 S 一个组分（包含单核细胞区）和 S 两个组分（包含多核小体）后，在 1%aros 凝胶上分离 DNA。

消化的染色质和富含单核小体的染色质与识别特异性组蛋白翻译后修饰的抗体一起孵育。例如，组蛋白 H 3 K 9 ME 3 上的赖氨酸 9 三甲基化，沉默染色质的标志物。然后通过 SDS 页面分离免疫纯化的蛋白质以及染色质输入，胶体 kumasi 染色显示核心组蛋白 H 3、H 4、H 2 A 和 H 2 B 在 17 道尔顿带周围和以下，H 3 和 H 2 B 共迁移流经和输入中存在的 H 3 上 trimm 甲基化甘氨酸 9 的量之间的比较表明，约 50% 的感兴趣的区域经过免疫纯化，排除了由于染色质的次要亚群富集而导致的偏倚风险。

该直方图表示每种修饰的三个独立实验的平均值正负 SEM，然后采用质谱 MS 来表征富集核小体内共相关的翻译后修饰。所有组蛋白翻译后修饰均通过使用 CID 片段化手动检查该代表性 Ms m Ms 光谱中的相应 ms ms 光谱来验证。B 离子和 Y 离子系列允许定义 H 3、9 至 17 肽的序列，并在赖氨酸、9 至 17 残基上定位三甲基化，方法是首先构建对应于每个修饰肽的提取离子色谱图或 XIC，基于质量电荷值，并计算曲线下面积或每个峰的 UC

接下来，通过将每个修饰肽的 A UC 除以对应于该肽的所有观察到的未修饰和修饰形式的面积总和来估计 H 3 9 至 17 肽中赖氨酸 9 上不同程度甲基化的相对丰度。第三，碎裂材料中每种修饰的相对富集表示为碎裂肽中每种甲基化相对于输入的相对丰度之间的对数 2 比率。H 3、9 至 17 肽的分析显示 D 和 TRIMM 甲基化赖氨酸 9 的富集，以及未修饰和单甲基形式的相应消耗。

将这些结果作为抗体特异性的阳性对照，所有其他修饰的 cos 结合或消耗可以在相同的 H 3 的分子内水平和同一核小体内其他 coen 富集组蛋白的分子间水平上进行评估。该代表性热图总结了在组蛋白 H 3、H 4 和 H 2 上鉴定的所有与 H ptm 相关的 cos 的富集 A.每行对应于不同的修饰，ND 表示未检测到修饰以筛选所有蛋白质。通过超声处理碎裂的交联染色质的异质染色质芯片内的共缔合与细胞培养物或 lac 中氨基酸的稳定同位素标记结合使用。

首先，通过计算重赖氨酸和重精氨酸掺入蛋白质来评估标记效率。为了准确定量蛋白质，需要将两种重氨基酸掺入率提高到 95%，如此处观察到的赖氨酸和精氨酸肽密度分布的中位数分别等于 0.974 和 0.964。其次，必须优化可溶性肽与抗体的比例。

该图显示了 H 3 9 至 17 肽中 2 加电荷三毫米甲基化赖氨酸九、K、九、ME 三的相应质量电荷值的放大质谱，包括输入和碎裂八度的轻和重形式。在输入时，重肽和轻肽的强度在正向 SLAC 芯片中接近 1。轻肽的强度远低于重肽的强度，因此表明竞争有效。

此处显示了轻 L 和重 H 标记的染色质输入和 co 氨基沉淀材料芯片的 SDS 页面的代表性结果。与碎裂材料相对应的泳道被切成 10 个切片，同时仅分析了 2 个输入切片。对于掺入测试分析，slac 竞争实验通常一式两份，即所谓的正向和反向形式，其中与过量可溶性肽的竞争从重 H 到轻 L 染色质样品切换。

该代表性全谱图显示了对应于 HP 1 和宏观 2 A 蛋白肽的 SLAC 对，重蛋白与轻蛋白的比率大于 1。在反向复制中以小于 1 的比率镜像的正向实验中，证明这些蛋白质在异质染色质蛋白中的特异性富集，其重和轻形式的强度在正向和反向实验中相似，产生接近 1 的恒定比率，并被归类为背景。正向和反向 X chipp 实验的交集导致鉴定出两个实验中存在的 635 种蛋白质，并用至少两个比率计数进行定量。

它们的重轻比的对数 2 图代表所谓的异染色体。此散点图中的红色虚线表示前 40% 和 30% 的蛋白质比率。如图所示，真正的 trimm 甲基化赖氨酸 9 相互作用物被明确识别为存在于蛋白质比率分布前 40% 内的蛋白质。

在这里，来自输入正向和反向 X 作物实验的蛋白质比率分布分别以黑色、蓝色和橙色显示。观看此视频后，您应该对如何制备 E 染色质和最终作物以在质谱分析之前处理单沉淀蛋白质有很好的了解。如何识别和定量质谱中的组蛋白修饰，以及如何根据其蛋白质比率定义特定的 interac。