高通量筛选RNA病毒的广谱化学抑制剂
2014年5月5日
在体外测定法来测量病毒的复制已经由重组RNA病毒表达荧光素酶或能生物发光的其它酶的开发大大提高。这里我们详细介绍，结合麻疹和基孔肯雅病毒，从化学文库分离出广谱抗病毒药物，例如重组菌株的高通量筛选的管道。
该程序的总体目标是使用基于体外细胞的测定的组合从化学库中分离广谱抗病毒药物。这是通过首先选择抑制编码荧光素作为报告基因的麻疹病毒重组菌株的体外复制的化合物来实现的。同时，使用基于荧光素酶的活力测定法估计化合物的毒性。
来自两种分析的组合表型数据用于分离 HIIT 分子。最后的步骤是重新测试 HIIT 化合物的剂量反应复制、麻疹和鸡古纳病毒的抑制，并更准确地测量体外毒性。最终，通过筛选鉴定和验证广谱抗病毒化合物。
与现有方法（如基于细胞病变效应的标准病毒复制测定）相比，该技术的主要优点是它使用发光作为读数，并结合到表达荧光素酶作为报告基因的高度不同的病毒。演示该程序的是 El Niemans 团队的技术人员 Olivier Ellan 和与 Fredrik JI 研究部门一起工作的工程师 Marianne Luca Ori首先加热到室温。96 孔母板含有 10 毫摩尔的 DMSO 化合物储备液。
将每种化合物的 5 微升转移到新的 96 孔板中，每个孔中已经有 20 微升 DMSO，从而产生中间稀释板。现在，将 1 微升这些稀释板注入白色条形码组织培养物的干燥孔中。96 孔板。
这些是 D one 板，用于评估 20 微摩尔化合物的毒性。将它们存放在零下 20 摄氏度。现在从进一步稀释 10 倍的中间稀释板制作新板。
取每种稀释化合物 4 微升，并与 36 微升 DMSO 混合到孔中。从这些板中，将每个样品 1 微升转移到白色平底条形码组织培养物的干孔中。96 孔板。
这些是 D 两个板，它们用于评估 MV 复制的抑制。将它们也存放在零下 20 摄氏度。每 4 到 5 天在补充稳定的 L-谷氨酰胺的 DMM 中培养 HEK 2 93 T 细胞，通过胰蛋白酶使细胞通过，并在新鲜培养瓶中进行第 10 次稀释。
在它们的对数生长期，收集并计数用于实验的细胞。以每毫升 300， 000 个细胞的浓度重悬细胞。每个要筛选的板需要 12.5 毫升此稀释度的细胞。
现在，准备板用 1 微升 DMSO 加标一组对照孔。用 1 μL DMSO 和 2.5 μL 0.5% ipol 溶液加标第二组对照孔以杀死细胞。将细胞悬液转移到槽中，并向 D one 板的每个孔中分配 100 μL。
定期搅拌悬浮液以避免沉淀。然后将准备好的板孵育 24 小时。如上一节所述，为板准备细胞。
培养基中可以补充尿苷，以过滤掉针对嘧啶生物合成早期步骤的抗病毒分子，因为这些分子相当常见。将 10 分之一的细胞悬液留给含有未感染细胞的对照孔，并感染剩余的体积。解冻足够了。
RMV 两种豪华储备液，用每个靶细胞 0.1 个感染性颗粒感染培养物，实现 0.1 倍数的感染。将计算体积的病毒加入细胞悬液中并轻轻混合。将感染的细胞转移到槽中，并将 100 微升感染的细胞分配到 D 两个板中。
目标色谱柱 2 到 11，其中第 1 列和第 12 列包含加标化合物和阳性对照孔。将槽中的细胞轻轻混合，交替排列在第 1 列和第 12 列的行中，分配 100 微升未感染的细胞。现在将板孵育 24 小时。
孵育时间后，确定 D 单板细胞的活力。将 50 μL 基于荧光素酶的活力检测试剂混合到每个孔中，并等待 10 分钟。然后用光度计读取板。
将积分时间设置为每孔 100 毫秒。接下来，将 50 微升萤火虫荧光素底物混合到每个孔中并在室温下等待 6 分钟，以确定 D 两个板中的 MV 复制。然后查阅毒性测定的每个 D 1 和 D 2 板的 Z 因子。
继续计算病毒复制的抑制作用。Hi 化合物是将病毒复制减少到施加的临界值以下并且对每种 HI 化合物无毒的化合物。在 DMSO 中进行连续稀释，从 500 微摩尔开始，然后沿 96 孔板的一列以半步下降至 4 微磨牙，从化合物稀释板中加入 1 微升到白色条形码组织培养板中。
重复此过程两次以创建一式三份的测试板。然后用 50 微升培养基填充组织培养板。现在制备 37.5 毫升 HEK 2 93 T 细胞，以每毫升 600， 000 个细胞悬浮在补充的 DM EM 中。
在两支 15 ml 试管中加入 12.5 mL细胞悬液。每个细胞用 RMV 2 Luke 感染一管细胞，感染倍数为 0.1。用表达香草荧光素的重组韭菜感染第二管细胞。
使用 0.2 的感染倍数。使用倒置混合两管病毒感染的细胞。这应该在生物安全三级实验室中进行，因为现在 chivee 致病性将未感染的细胞和受感染的细胞组加载到它们自己的一组 HIIT 化合物板中。
每孔分配 50 μL 细胞，并在 37 摄氏度下孵育板 24 小时。第二天，向 RMV 两个 Luke 感染细胞的每个孔中加入 50 微升萤火虫荧光素酶。同样，将 50 微升 ran 香草荧光素底物添加到 Chick V 任 感染的细胞中，添加到未感染的对照细胞中，加入 50 微升十字花科碱基活力。
试剂通过确定抑制 MV 和 Chick V 复制 50% 的高化合物浓度进行此外，忽略显示细胞毒性的化合物。该筛选管道依赖于选择不显示任何显着细胞毒性并抑制 MV 和 Chick V 复制的化合物，分别在初级和二级筛选中确定，它利用了表达萤火虫或香草荧光素的重组病毒。作为一名记者。
使用基于商业荧光素的测定法评估化合物毒性，其中发光与该板上的活细胞相关。根据阳性对照孔设定的阈值，将 21 种化合物评分为毒性。首先使用 RMV 2 测量抗病毒活性。
将 Luke 发光与对照孔设定的限值进行比较。在这里，发现四种化合物能够在另一种测定中抑制超过 75% 的病毒复制。其中两种被发现对所有 HIIT 化合物都有毒。
在表达荧光素酶的 MV 和 Chick VRNA 病毒上测定半数最大抑制浓度。这两种病毒是无关的，因此使筛选更加稳健。同时，在剂量反应实验中证实了所选化合物缺乏细胞毒性。
在所有 13 种无毒化合物中，从 10， 000 个分子的化学库中鉴定出。这些化合物在化学结构和生物活性方面都是新颖的。根据结构相似性，这些化合物分为三个化学家族。
作为参考，使用具有强效抗病毒活性的物质获得一半最大抑制浓度值。在查看这些值时，将参考分子与通过筛选识别的大多数活跃命中分开，不到一个数量级。这表明一旦掌握，所选化合物的抗病毒活性相对较强。
该技术可用于在高通量设置下筛选大型化学文库，并选择小分子组并达到广谱抗病毒药物。
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概述
本文详述了一种高通量筛选管道，旨在从化合物库中分离广谱抗病毒药物。该方法利用表达荧光素酶的麻疹病毒和基孔肯雅病毒重组株，以提高病毒复制的测量。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 药理学
- 抗病毒研究
背景
- 体外测定病毒复制的方法得到改进。
- 利用表达生物发光酶的重组RNA病毒。
- 广谱抗病毒药物对于对抗各种病毒感染至关重要。
- 高通量筛选允许高效的化合物测试。
研究目的
- 从化合物库中分离广谱抗病毒药物。
- 评估抑制病毒复制的化合物。
- 评估化合物毒性和抗病毒效力并重。
使用的方法
- 选择抑制重组麻疹病毒复制的化合物。
- 使用荧光素酶基活力测定法估计毒性。
- 结合抗病毒和毒性测定的表型数据。
- 对已确定的化合物重新测试以确定剂量反应和毒性。
主要结果
- 通过组合测定数据识别HIIT分子。
- 验证广谱抗病毒化合物。
- 准确测量选定化合物的体外毒性。
- 成功分离出对麻疹病毒和基孔肯雅病毒均有效的化合物。
结论
- 筛选管道有效地分离出有前景的抗病毒候选化合物。
- 结合抗病毒效力和毒性评估至关重要。
- 这种方法可以促进新抗病毒疗法的发现。
常见问题
Executive Industry Relevance
This high-throughput screening pipeline enables biopharma teams to identify broad-spectrum antiviral compounds by integrating antiviral efficacy and cytotoxicity readouts using recombinant luciferase-expressing viruses. The approach supports early-stage target-agnostic screening for RNA virus inhibitors, reducing biological risk in antiviral portfolio development. By focusing on host-independent antiviral activity, the method enhances predictive confidence in lead selection for preclinical advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of antiviral hypotheses through phenotypic screening of chemically diverse libraries against divergent RNA viruses.
- Operational Value: Combines antiviral and toxicity data to prioritize compounds with selective inhibition profiles, reducing false positives in hit identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Utilizes luciferase reporter systems to generate quantitative, luminescence-based readouts for viral replication and cell viability in a homogeneous assay format.
- Operational Value: Supports miniaturization to 96-well format, enabling screening of large chemical libraries with reduced reagent consumption and increased throughput.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Identifies compounds with activity against unrelated RNA viruses (measles and chikungunya), supporting mechanistic de-risking of broad-spectrum potential.
- Operational Value: Includes dose-response retesting to confirm inhibitory potency (IC50) and validate lack of cytotoxicity, enabling reliable handoff to preclinical toxicology.
Pipeline & Workflow Integration
The screening cascade fits within the early discovery workflow, progressing from primary hit identification to secondary validation and dose-response confirmation, aligning with lead generation and optimization stages in antiviral campaigns.
- Discovery Biology: Supports phenotypic screening to detect compounds that inhibit viral replication without requiring prior knowledge of viral targets or host pathways.
- Screening: Delivers assay-ready plates (D1 for toxicity, D2 for antiviral activity) with luciferase readouts enabling standardized, reproducible compound evaluation across screening runs.
- Analytics: Generates inhibition percentages and Z-factor metrics to assess assay quality and define hit thresholds based on replication reduction and toxicity exclusion.
- Translational Research: Confirms broad-spectrum activity through parallel inhibition of two genetically and clinically distinct RNA viruses, supporting translational relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening additional RNA viruses by swapping luciferase-expressing strains, maximizing assay investment across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target-agnostic antiviral hits by requiring dual-virus inhibition and absence of cytotoxicity, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Employs luminescence-based assays that are robust, scalable, and compatible with automated liquid handling and detection systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by filtering compounds based on efficacy and safety profiles early in discovery, lowering attrition risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chemical series showing consistent activity across virus families, informing medicinal chemistry focus.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, cell culture, and luciferase-based assay handling under appropriate biosafety conditions (BSL-2/BSL-3 depending on virus strain).
- Depends on access to luminometers with configurable integration times and white-bottom, barcoded 96-well plates to minimize cross-talk and ensure signal accuracy.
- Necessitates standardized compound dilution and plating procedures to maintain assay consistency across primary and secondary screens.
- Involves adaptation considerations when extending the platform to other viruses, including validation of luciferase expression, replication kinetics, and cytotoxicity profiles.
- Practical limitations include the need for BSL-3 facilities for highly pathogenic strains and potential interference from compound auto-luminescence or quenching effects in luciferase readouts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:34
Preparation of 96-well Daughter Plates with Compounds
3:03
Preparation of Cell Cultures to Determine Compound Toxicity
4:18
Preparation of Cell Cultures Infected by rMV2/Luc
5:37
Luciferase Activity Measurement
6:36
Secondary Screening for Toxicity and Broad-spectrum Antiviral Activity
8:52
Results: Identification of Anti-viral Hit Compounds
11:06
Conclusion
