Name: 高通量筛选RNA病毒的广谱化学抑制剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 了解高通量筛选RNA病毒广谱化学抑制剂的方法，使用表达荧光素酶的重组麻疹病毒和基孔肯雅病毒进行体外细胞实验。该技术结合抗病毒活性与毒性评估，有效分离具有广谱抗病毒潜力的小分子化合物。

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我们感谢 Yves L. Janin 博士提出的有益评论和建议。我们感谢 H.H. Gad 提供 CHIK/Ren，感谢 C. Combredet 提供的技术支持。本研究得到了巴斯德研究所、法国国家科学研究中心（CNRS）、法国国家健康与医学研究院（INSERM）、卡诺研究所—巴斯德传染病研究所（STING 项目，资助 P.O.V 和 H.M.-L）、法国国家研究署（ANR-RPIB，STING 2.0 项目，资助 P.O.V）以及 &#34;法兰西岛大区议会&#34; （化学文库项目，资助编号 n&deg; I 06-222/R 和 I 09-1739/R（授予 H.M.-L.）。CHIKV/Ren 相关工作由项目 ArbOAS（ANR 资助编号 2010-INTB-1601-02）提供支持。

1. 含化合物的96孔子板的制备
<ol>
	<li>将含有溶于DMSO的10 mM化合物母液的96孔母板从-20 °C转移至室温。用DMSO将化合物稀释5倍&#160;，制备得到浓度为2 mM的96孔中间稀释板。稀释方法为：用移液器将5 μl&#160;样品加入20 μl DMSO中并混匀。</li>
	<li>从稀释板中吸取1 μl液体，加入白色、带条形码的组织培养96孔板的干燥孔中。此第一组子板（D1）用于评估化合物在终浓度为20 μM时的细胞毒性。子板于-20 °C保存，直至使用。</li>
	<li>再次进行1:10稀释，即从稀释板中吸取4 μl加入36 μl DMSO中并混匀。取1 μl加入白色、平底、带条形码的组织培养96孔板的干燥孔中。此第二组子板（D2）用于评估化合物在终浓度为2 μM时对MV复制的抑制作用。子板于-20 °C保存，直至使用。</li>
</ol>
2. 化合物毒性测定的细胞培养制备
<ol>
	<li>在含有稳定化L-谷氨酰胺并添加10%胎牛血清（FCS）、链霉素（100 μg/ml）和青霉素（100 IU/ml）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C和5% CO2条件下培养HEK-293T细胞。每4-5天通过胰酶消化传代细胞，并以1:10比例稀释至新培养瓶中。实验时细胞应处于对数生长期。</li>
	<li>实验当天，通过胰酶消化收集细胞并进行细胞计数。离心沉淀细胞后，用培养基重悬至浓度为3 × 105 个细胞/ml。注意每个筛选板需要12.5 ml细胞悬液。</li>
	<li>将细胞转移至加样槽中，并向含有添加化合物的D1板孔中每孔分配100 μl细胞悬液。加样过程中需定期搅动加样槽内的细胞悬液，以防止细胞沉降。</li>
	<li>向对照孔A1、C1、E1、G1、A12、C12、E12和G12中各加入1 μl DMSO，这些孔将作为活细胞对照（无毒性）。向对照孔B1、D1、F1、H1、B12、D12、F12和H12中各加入1 μl DMSO和2.5 μl 0.5% IGEPAL溶液以杀死细胞，这些孔将作为死细胞对照（高毒性）。</li>
	<li>于37 °C和5% CO2条件下孵育细胞24小时&#160;。</li>
</ol>
3. 准备被 rMV2/Luc 感染的细胞培养物
<ol>
	<li>按照 2.1 和 2.2 所述方法培养并复苏细胞。再次将细胞以 3 × 105 个细胞/ml 的浓度重悬于培养基中。请注意，每块筛选板需要 12.5 ml 细胞悬液。</li>
	<li>可选步骤：在培养基中添加终浓度为 20 μg/ml 的尿苷。 
	注意：在筛选抑制病毒复制的化合物文库时，常会分离到靶向嘧啶生物合成途径早期步骤的化合物13,16,27,28。向培养基中添加尿苷可用于排除此类抗病毒分子。事实上，当嘧啶生物合成途径上游酶被抑制时，添加尿苷可有效恢复病毒复制。</li>
	<li>保留十分之一体积的细胞悬液用于未感染细胞的对照孔，其余部分用于感染操作。</li>
	<li>解冻适量的 rMV2/Luc 储存液。rMV2/Luc 储存液通常含有 106–108 个感染性颗粒/ml。每靶细胞需以 0.1 个 rMV2/Luc 感染性颗粒进行感染，相当于感染复数（MOI）为 0.1。注意：rMV2/Luc 源自麻疹疫苗（Schwarz 株），操作时需在 BSL2 环境中进行。</li>
	<li>将病毒加入细胞悬液中并轻轻混匀。将感染后的细胞转移至加样槽中，并向 D2 板第 2 至第 11 列含有化合物的孔中每孔分配 100 μl 感染细胞悬液。加样过程中应定期轻轻混匀加样槽内的细胞悬液。</li>
	<li>在第 1 列和第 12 列中，每两孔加入 100 μl 未感染细胞悬液，其余孔加入感染细胞悬液。</li>
	<li>将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时&#160;。</li>
</ol>
4. 荧光素酶活性检测与数据分析
<ol>
	<li>从培养箱中取出 D1 培养板，通过向培养孔中直接加入 50 μl 基于荧光素酶的细胞活力检测试剂来测定细胞活力。混匀后在室温下孵育 10 分钟，使用发光仪读数，每孔积分时间为 100 毫秒。</li>
	<li>从培养箱中取出 D2 培养板，通过向培养孔中直接加入 50 μl 荧光素酶底物来测定荧光素酶活性。室温孵育 6 分钟后，按照上述方法使用发光仪读数。</li>
	<li>为毒性检测的每块 D1 板计算 Z' 因子以确保筛选质量29。Z' = 1 - 3×(σ+ + σ-)/(µ+ - µ-)，其中 µ+ 和 σ+ 对应仅含 DMSO（无毒性）的 HEK-293T 细胞的发光均值和标准差，µ- 和 σ- 对应经 IGEPAL 处理以杀死细胞的培养孔的发光均值和标准差。Z' 值应高于 0.5，否则该板将被弃用。</li>
	<li>将毒性阈值设定为 µ+/2。弃用发光值低于此阈值的化合物（图 3A）。</li>
	<li>为抗病毒检测的每块 D2 板计算 Z' 因子。此处，µ+ 和 σ+ 对应仅用 DMSO 培养的感染细胞的发光均值和标准差，µ- 和 σ- 对应未感染细胞的发光均值和标准差。同样，Z' 值低于 0.5 的板将被弃用。</li>
	<li>按下式计算病毒复制抑制率：抑制百分比 = (µ+ -&#160;化合物 X 的荧光素酶活性)/(µ+ - µ-)×100。将抑制阈值设为 75%，筛选出既使发光值低于该阈值（图 3B），又根据步骤 4.4 所述标准判定为无毒性的化合物。</li>
</ol>
5. 毒性及广谱抗病毒活性的二次筛选
<ol>
	<li>将每个命中化合物在DMSO中进行1:2倍比稀释，从500 µM稀释至4 µM（共8个稀释度）。在白色带条形码的组织培养板中加入50 µl培养基。向各培养孔中加入1 µl每种化合物稀释液。重复操作两次，使每个命中化合物共获得3块培养板，每板包含两份倍比稀释系列。</li>
	<li>按照上述步骤（2.1和2.2）制备37.5 ml HEK-293T细胞悬液，浓度为6 × 105 个细胞/ml。将细胞悬液分装至两个离心管中，每管12.5 ml，分别用rMV2/Luc（MOI = 0.1）或表达Renilla荧光素酶的重组基孔肯雅病毒（CHIKV/Ren，MOI = 0.2）感染细胞。通过轻柔翻转混匀。 
	注意：CHIKV/Ren来源于基孔肯雅病毒的野生型毒株，因此必须在BSL3级生物安全实验室中操作。在培养孔中加入Renilla底物后，可将培养板从BSL3转移至BSL1环境（见下文）。</li>
	<li>将50 µl未感染、rMV2/Luc感染或CHIKV/Ren感染的细胞分别加入含有命中化合物倍比稀释液的培养板中。于37 °C孵育24小时。</li>
	<li>向rMV2/Luc感染的孔中加入50 µl萤火虫荧光素酶底物，以检测萤火虫荧光素酶活性；向CHIKV/Ren感染的孔中加入50 µl Renilla荧光素酶底物，以检测Renilla荧光素酶活性；最后，向未感染的细胞孔中加入50 µl基于荧光素酶的细胞活力检测试剂，以测定细胞活力。</li>
	<li>绘制数据图（图4），确定使麻疹病毒（MV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）复制抑制50%的命中化合物浓度。排除在此实验中显示一定毒性的化合物。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

此处所述的筛选流程旨在选择具有广谱RNA病毒抑制活性且特性适宜的化合物。当采用该方案对包含10,000种化合物的文库进行筛选并应用上述过滤标准时， 即 MV复制抑制率超过75%的化合物中，共有40种（0.4%）呈阳性结果。此外，其中约一半化合物在基于荧光素酶的细胞活力检测中显示出一定毒性，因此被排除。最终，选取了十余种可大量获取的阳性化合物进行复测。这一小批化合物在剂量-反应实验中易于重复检测，可同时评估其对细胞毒性以及对MV和CHIKV病毒复制的抑制作用。图4）。所有选定化合物的抗病毒活性均得到确认，该筛选流程的整体命中率为1.3‰。这一数值与其他研究团队采用不同基于复制的高通量抗病毒筛选方法所获得的结果非常接近。27,32，且处于细胞水平表型检测通常的预期范围内（1-5‰）33然而，命中率在很大程度上取决于所筛选的化合物库以及打分筛选阈值，而这些阈值可根据采集数据的特征进行调整。在此，针对MV复制抑制和细胞毒性的筛选阈值是通过经验确定的，并进行了权衡，以获得适量的初筛阳性结果，便于在针对CHIKV的二次筛选中进行复测。
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RNA病毒可导致多种人类感染，在全球范围内对公共卫生和经济造成重大影响。针对多种人类RNA病毒，已开发出高效的疫苗，并广泛用于预防性治疗。然而，目前仍严重缺乏针对RNA病毒感染的治疗药物。事实上，对于登革病毒、丙型肝炎病毒或人呼吸道合胞病毒（hRSV）等重要人类病原体，尚无有效的疫苗可用。此外，RNA病毒是大多数新发传染病的致病原因，其发生频率因全球交流以及人类对生态系统的干扰而不断增加。面对RNA病毒所带来的这一威胁，现有的治疗手段极为有限且相对低效。1-3目前的治疗方法主要基于使用重组I型干扰素（IFN-α/β）以刺激先天免疫，或给予利巴韦林。尽管这种核糖核苷类似物的作用机制尚存争议，且可能涉及多种途径，但其抑制细胞内肌苷单磷酸脱氢酶（IMPDH）、从而耗竭细胞内GTP池的作用显然至关重要。4利巴韦林与聚乙二醇化干扰素-α联合使用是治疗丙型肝炎病毒的主要方案。然而，干扰素-α/β和利巴韦林的治疗效果相对有限 体内 对大多数RNA病毒而言，它们通过表达毒力因子有效抑制IFN-α/β信号通路5 并且常常逃逸利巴韦林的作用3此外，利巴韦林治疗虽 recently 获批用于治疗重症 hRSV 疾病，但其疗效存在争议，且正引发重要的毒性问题6近年来，一些针对特定病毒的治疗方法已投入市场，特别是针对流感病毒开发的神经氨酸酶抑制剂3然而，RNA病毒种类繁多且不断持续出现，在可预见的未来难以针对每一种病毒开发出特异性治疗方法。因此，迫切需要建立高效策略，以在近期识别并开发出有效的抗病毒分子。
可以说，一种对多种RNA病毒均具有活性的广谱抑制剂将能够解决这一问题。尽管这样的分子仍是病毒学家的梦想，但随着我们对细胞防御机制和先天免疫系统认识的不断深入，已显示出某些可能性7,8。目前，多个学术和工业实验室正在寻找能够激活细胞防御机制或特定代谢通路的分子，以抑制病毒复制。尽管这类化合物可能会产生显著的副作用，但由于针对急性病毒感染的治疗通常持续时间较短，因此即使存在一定的长期毒性，其应用仍可被接受。为了鉴定此类广谱抗病毒分子，研究人员已开发出多种策略。一些研究项目致力于发现靶向特定防御通路或代谢通路的分子，例如：通过病原体识别受体诱导抗病毒基因表达9，激活RNaseL等抗病毒因子10，利用自噬机制促进病毒降解11，调控核苷酸合成通路12,13，或触发凋亡级联反应以加速病毒感染细胞的死亡14。另一些研究团队则建立了非靶点依赖的表型筛选方法13,15-17。在这种策略中，抗病毒分子仅需具备在特定细胞系统中阻断病毒复制的能力即可被识别。通常认为，若一种化合物能够抑制2至3种无亲缘关系的RNA病毒，则其具备成为广谱抗病毒分子的合适特征。通过此类经验性方法筛选出的阳性化合物，其作用机制通常在后续阶段才被阐明，而这一过程最终可能揭示出抗病毒药物作用的新型细胞靶点。值得注意的是，一项对美国食品药品监督管理局（FDA）在1999年至2008年间批准的新药进行的回顾性分析表明，总体而言，这类表型筛选在发现首创新药（first-in-class small-molecule drugs）方面通常优于基于靶点的筛选策略18。
基于细胞的高通量病毒复制检测通常通过病毒的细胞病变效应来确定。将细胞接种于96孔或384孔板中，并在待测化合物存在下进行病毒感染和培养。数天后，用结晶紫等染料对细胞层进行固定和染色。最后，使用酶标仪测定吸光度，并通过化合物保护细胞层免受病毒诱导的细胞病变效应的能力，识别出抑制病毒复制的化合物。另一种方法是采用标准的细胞活力检测法（如MTS还原法）来评估病毒介导的细胞病变效应。这类检测方法操作简便且成本较低，但存在三个主要局限性。首先，该方法需要病毒与细胞的组合能够在数天内产生明显的细胞病变效应，但这种情况并非总能实现，因此需要替代策略19。其次，这类方法的定量性较差，因其依赖于对病毒复制的间接测量。最后，具有细胞毒性的化合物可能被误判为阳性结果，因此必须通过检测细胞活力的反向筛选实验将其排除。为克服其中部分难题，研究人员利用反向遗传学技术构建了可表达报告蛋白（如EGFP或荧光素酶）的重组病毒或复制子，这些报告蛋白可由一个额外的转录单元表达，或与病毒蛋白基因融合表达（相关示例见文献20-23）。当这些病毒复制时，报告蛋白会与病毒蛋白一同表达。这为定量检测病毒复制以及评估候选分子的抑制活性提供了极为有效的手段。对于表达荧光素酶（或其他能够产生生物发光的酶）的重组病毒而言，该优势尤为显著，因为此类报告系统具有宽广的动态范围、高灵敏度，并且几乎无背景信号。此外，该系统无需激发光源，从而避免了化合物自身荧光带来的干扰24。
本文详细介绍了一种高通量筛选化学文库中广谱RNA病毒抑制剂的实验方案。首先在感染表达萤光素酶的重组麻疹病毒（MV）的人源细胞上测试化合物25 (rMV2/Luc,&#160;图1，初筛）。MV 属于 单负链病毒目 顺序，并常被视为负链RNA病毒的典型代表。因此，MV基因组可作为病毒聚合酶的模板，用于合成编码病毒蛋白的mRNA分子。在一种名为rMV2/Luc的重组MV毒株中，荧光素酶的表达由插入P基因与M基因之间的一个额外转录单元所驱动。图2A）。与此同时，使用基于商业荧光素酶的试剂对化合物在人细胞上的毒性进行检测，该试剂通过ATP定量来评估培养物中代谢活跃细胞的数量（图1，初筛）。利用这两种检测方法可对完整的化合物库进行筛选，以选出无毒且能有效抑制MV复制的化合物。随后，对筛选出的阳性化合物进一步验证其剂量依赖性抑制MV复制的效果、无毒性作用，以及抑制基孔肯雅病毒（CHIKV）复制的能力（图1，二次筛选）。CHIKV 是 披膜病毒科 属于披膜病毒科，其基因组为一条正链单股RNA分子。因此，它与麻疹病毒完全无关，而能够抑制麻疹病毒（MV）和CHIKV的化合物极有可能对一大类RNA病毒具有广谱抑制作用。CHIKV的非结构蛋白由病毒基因组直接翻译产生，而结构蛋白则由亚基因组mRNA分子经转录和翻译生成。我们的 体外 CHIKV复制实验基于一种名为CHIKV/Ren的重组毒株，该毒株表达海肾荧光素酶&#160;通过在 nsP3 与 nsP4 序列之间插入报告基因，使酶作为非结构多聚蛋白的切割片段表达26 (图2B海肾荧光素酶活性的检测可用于监测CHIKV生命周期早期阶段的病毒复制情况。
本高通量实验方案用于在含有10,000种分子、化学多样性丰富的商业化合物库中快速筛选具有广谱抗病毒潜力的候选化合物。这些化合物基本符合利平斯基五规则，分子量范围为250至600道尔顿，log D值低于5。其中大多数分子为新型化学实体，在其他商业化合物库中尚未有收录。

<table><tbody><tr><td>Freedom EVO 平台</td><td>TECAN</td><td></td><td>自动化机器人平台</td></tr><tr><td>96 孔白色聚苯乙烯细胞培养微孔板</td><td>Greiner Bio One</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 发光细胞活力检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>基于荧光素酶的细胞活力检测</td></tr><tr><td>Bright-Glo 荧光素酶检测试剂系统</td><td>Promega</td><td>E2610</td><td>含有萤火虫荧光素酶底物的试剂</td></tr><tr><td>Renilla-Glo 荧光素酶检测试剂系统</td><td>Promega</td><td>E2710</td><td>含有海肾荧光素酶底物的试剂</td></tr><tr><td>Britelite plus 报告基因检测试剂系统</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6016761</td><td>含有萤火虫荧光素酶底物的试剂。可作为 Bright-Glo 试剂的替代品用于检测荧光素酶活性。</td></tr></tbody></table>

广谱rna病毒化学抑制剂的高通量筛选

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA病毒可引起多种重大人类疾病，例如流感、支气管炎、登革热、丙型肝炎或麻疹。由于全球人员交流日益频繁以及人类活动不断深入自然生态系统，RNA病毒也构成了新发传染病的潜在威胁。2005至2006年印度洋地区发生的基孔肯雅病毒疫情就是此类新发疫情的典型实例。近年来，随着对调控病毒复制的细胞通路研究取得进展，人们发现靶向宿主细胞功能而非病毒本身的化合物，可能抑制多种RNA病毒的复制。目前已通过以宿主靶点为导向的筛选方法鉴定出一些广谱抗病毒化合物。然而，通过检测细胞病变效应的减弱来衡量病毒复制抑制程度的功能性筛选，仍然是最主要的筛选策略。重组病毒技术的发展极大提升了此类功能性筛选的效率，特别是那些表达可产生生物发光的报告酶（如荧光素酶）的重组病毒。在本报告中，我们详细描述了一种高通量筛选流程，该流程结合表达报告酶的重组麻疹病毒和基孔肯雅病毒以及细胞活力检测方法，用于鉴定具有广谱抗病毒活性的化合物。

该筛选流程首先选择能够抑制麻疹病毒（MV）复制且不表现出显著细胞毒性的化合物（图1，初筛）。本方法利用基于荧光素酶的检测技术评估细胞毒性和病毒复制抑制效果。所有移液步骤和数据采集均可在机器人平台上以高通量方式进行。
化合物的细胞毒性通过基于荧光素酶的活力检测法进行评估，该方法通过定量培养物中三磷酸腺苷（ATP）的含量来反映活细胞数量，ATP含量对应于代谢活跃的细胞。由于荧光素酶催化的荧光素氧化反应依赖于ATP，因此发光信号强度与活细胞提供的ATP量成正比。图3A展示了一个代表性筛选板的实验结果。如预期所示，含有活细胞或经IGEPAL处理杀死的死细胞的对照孔中，测得的荧光素酶活性值差异显著。阈值经验性地设定为µ+/2，以排除显示一定细胞毒性的化合物；在本例中，该板上有21种化合物被剔除。与此同时，抗病毒活性通过rMV2/Luc（一种表达荧光素酶的麻疹病毒重组毒株）进行检测（图2）。实验使用人源HEK-293T细胞，因其对麻疹病毒感染高度敏感。因此，感染孔中的荧光...

体外检测病毒复制的实验方法已因表达荧光素酶或其他可产生生物发光的酶的重组RNA病毒的发展而得到显著改进。本文详细介绍了一种高通量筛选流程，该流程结合了麻疹病毒和基孔肯雅病毒的此类重组毒株，用于从化合物库中筛选广谱抗病毒药物。

广谱RNA病毒化学抑制剂的高通量筛选

RNA病毒是导致人类重大疾病（如流感、支气管炎、登革热、丙型肝炎或麻疹）的病原体。它们还构成了一种新出现的威胁……

本实验的总体目标是利用体外细胞检测方法的组合，从化学文库中分离出广谱抗病毒药物。首先筛选能够抑制编码荧光素酶作为报告基因的重组麻疹病毒体外复制的化合物，从而实现这一目标。同时，采用基于荧光素酶的细胞活力检测方法评估这些化合物的毒性。结合两种检测的表型数据用于分离命中分子。最后步骤包括对命中化合物进行剂量反应验证，以重复抑制麻疹病毒和基孔肯雅病毒，并更准确地测量体外毒性。最终通过筛选鉴定并验证广谱抗病毒化合物。与基于细胞病变效应的标准病毒复制检测等现有方法相比，该技术的主要优势在于采用发光信号作为检测读数，并结合了两种表达荧光素酶作为报告基因的高度差异性病毒。演示本实验操作的人员为来自Hélène Munier-Lehmann团队的技术员Olivier Helynck，以及在我所在Frédéric Tangy研究组工作的工程师Marianne Lucas-Hourani。首先将含有化学化合物DMSO溶液（浓度为10毫摩尔/升）的96孔母板恢复至室温。取每种化合物5微升，转移至新的96孔板中，该96孔板每孔已预先加入20微升DMSO，从而制备得到中间稀释板。随后，用移液器将1微升上述稀释板中的溶液加入白色条形码标记的组织培养96孔板的干燥孔中。这些是 D 一板，用于评估化合物在 20 µM 下的毒性。将它们保存在 -20 °C 条件下。现在从中间稀释板制备新的板，进一步稀释 10 倍。取4微升每种稀释后的化合物，加入含有36微升DMSO的孔中进行混合。从这些板中，将每个样品1微升转移至白色平底带条形码的96孔组织培养板的干燥孔中。这些是 D 二板，用于评估 MV 复制的抑制作用。同样需在 -20 摄氏度下保存。在添加了稳定型L-谷氨酰胺的DMEM培养基中培养HEK-293-T细胞。每四到五天用胰蛋白酶消化传代一次，并按1:10稀释至新的培养瓶中。在细胞的对数生长期，收集并计数用于实验的细胞。将细胞重悬于每毫升300,000个细胞的浓度。每块需要筛选的培养板需加入12.5毫升该稀释度的细胞悬液。现在，准备培养板。向一组对照孔中加入1微升DMSO，向第二组对照孔中加入1微升DMSO和2.5微升0.5% IGEPAL溶液以杀死细胞。将细胞悬液转移至加样槽中，并向D-one板的每孔加入100微升细胞悬液。定期振荡悬液以避免沉淀。然后将制备好的平板孵育24小时。按照前一节的方法准备细胞用于加样。培养基中可添加尿苷，以排除靶向嘧啶生物合成早期步骤的抗病毒分子，因为这类分子较为常见。将十分之一的细胞悬液保留下来，用于未感染细胞的对照孔，其余部分进行感染。解冻足够量的rMV2-luc储存液，使每个靶细胞感染0.1个感染性病毒颗粒，即感染复数（MOI）为0.1。将计算好的病毒体积加入细胞悬液中，并轻轻混匀。将感染后的细胞转移至储液槽中，并向96孔板的D2列加入100 µL感染细胞

high-throughput-screening-for-broad-spectrum-chemical-inhibitors-rna

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

高通量筛选RNA病毒的广谱化学抑制剂

通过基于细胞的全基因组功能缺失RNA干扰筛选，可以鉴定出参与病毒感染的新型宿主因子。Drosophila 细胞培养模型特别适用于该方法，因为其RNA干扰操作简便且效率高。本文以痘苗病毒（vaccinia...

RNAi 筛选参与痘苗病毒（Vaccinia）感染的宿主因子：利用果蝇（Drosophila）细胞

已开发、优化、验证并应用了三种检测方法，包括基于细胞病变效应（CPE）的检测、剂量-反应检测和加药时间（ToA）检测，用于筛选针对蓝舌病毒（BTV）的新型抗病毒药物，并确定新发现抗病毒药物可能的作用机制（MoA）。...

检测针对蓝舌病毒新型抗病毒药物的实验方法

本文介绍了细胞毒性及单周期感染性检测方法，可用于快速、准确地筛选化合物，以确定其对野生型和耐药型 HIV-1...

快速筛选HIV逆转录酶和整合酶抑制剂

本文介绍了一种用于研究病毒进入特定步骤的实验方案，以鉴定和评估新型抗病毒药物。...

早期病毒进入检测法用于抗病毒化合物的鉴定与评价

本文描述了评估靶向HIV-1复制周期整合后步骤的RNA分子有效性和毒性的方法。这些方法可用于筛选新分子以及优化现有分子的结构形式。...

评估靶向HIV-1产生的RNA在基因或药物治疗中的有效性和毒性

本文介绍了一种利用高通量RNA干扰筛选来发现可被调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的实验方案，特别是针对弹状病毒和痘苗病毒治疗，但该方法也可轻松适用于其他溶瘤病毒平台，或用于发现普遍调控病毒复制的宿主基因。...

全基因组RNA干扰筛选鉴定调控溶瘤病毒治疗的宿主因子

我们描述了一种基于细胞的检测方法，通过表达绿色荧光蛋白并利用流式细胞术或荧光显微镜进行检测，以报告HIV-1的融合过程。via该方法可用于在无细胞感染系统和细胞间感染系统中测试病毒进入抑制剂（特异性作用于融合步骤）。...

一种高通量Cre-Lox激活的病毒膜融合检测方法用于筛选HIV-1病毒膜融合抑制剂

本文介绍了用于鉴定以下两类分子的实验方案：1）促进节肢动物传播病毒（arbovirus）复制的病毒编码免疫调节因子；2）限制节肢动物传播病毒复制的真核宿主因子。这些基于荧光和发光的检测方法使研究人员能够在信号-背景比低的简单实验体系中，快速获得节肢动物传播病毒复制的定量结果。...

利用虫媒病毒感染作为筛选工具鉴定病毒免疫调节因子和宿主抗病毒因子

在本研究中，我们描述了基于复制子和病毒酶的检测方法所采用的实验方案，用于以高通量筛选形式筛选寨卡病毒复制的抑制剂。...

高通量抗病毒检测用于筛选寨卡病毒复制抑制剂

本方法描述了利用基于红外染料的成像系统，以高灵敏度检测感染小鼠支气管肺泡灌洗（BAL）液中的H1N1病毒。该方法可在96孔或384孔板中进行，所需检测样品体积小于&lt;10...

高通量流感病毒检测方法

了解高通量筛选RNA病毒广谱化学抑制剂的方法，使用表达荧光素酶的重组麻疹病毒和基孔肯雅病毒进行体外细胞实验。该技术结合抗病毒活性与毒性评估，有效分离具有广谱抗病毒潜力的小分子化合物。

广谱RNA病毒化学抑制剂的高通量筛选

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