ATP合酶二聚体线粒体通过冷冻电子断层扫描可视化

该程序的总体目标是确定 C 2 中线粒体蛋白的结构和组织。这是通过首先生成包含样品的冷冻水合电子显微镜网格来实现的。接下来，在电子冷冻显微镜中记录样品的剂量限制倾斜系列。

然后处理倾斜序列以生成断层体积。最后，对蛋白质密度进行平均以确定蛋白质的结构，并对膜进行分割以揭示其 3D 结构。通过将蛋白质的平均值重新定位回 Tom Grahams 中，可以揭示膜中蛋白质的结构和组织。

因此，我们对线粒体进行电子哭泣断层扫描，因为我们想了解它们在分子水平上是如何工作的。与其他方法（例如薄塑料切片的电子显微镜）相比，该技术的主要优点是分辨率更高。该材料未以任何方式进行化学固定，并且保留了蛋白质的分子细节。

电子晶体技术可能需要一些时间来掌握，但有经验的用户每次会话可以获得 5 到 6 个高质量的 TOM 接地。该程序最困难的部分是产生最佳冰厚度的冷冻水合网格 分离和沉淀线粒体后，根据文本方案，在 10 毫摩尔 HEPA 缓冲液中使用 250 毫摩尔 T 三糖，将沉淀重新悬浮至每毫升总蛋白辉光放电约 5 毫克的浓度。全碳 EM 根据制造商的说明，在真空装置中将碳面朝上网格，通过将乙烷气流引导到液氮冷却铝制容器的内侧来液化几毫升乙烷。

用一把镊子拿起辉光放电 DM 网格，将其放在台式混合蛋白、共轭金基准悬浮液上，与线粒体悬浮液一对一，并立即将 3 微升溶液涂抹到网格上。接下来，将镊子放入玻璃化装置中，例如带有滤纸楔形的自制断头台，从网格中吸去多余的液体，然后松开扳机，立即将网格浸入液态乙烷中。然后将网格从液态乙烷转移到液氮中。

将新滤纸楔的尖端放入液态乙烷中，从网格中去除多余的乙烷。随着液体的上升，轻轻地将网格向上拖动滤纸，使其保持在液体前沿下方，然后立即将其转移到液氮中储存以备后用。将网格放入网格盒中并储存在充满液氮的实干家中，以记录断层倾斜系列。

首先确保液氮 doer 已满，并检查样品台和网格转移装置的温度是否低于 100 开尔文。通过获取测试网格的图像并检查荆棘环的质量来确认电子显微镜已正确对齐 T tho 环应该是圆形的并延伸到图像的边缘。接下来，插入带有冷冻水合线粒体的网格。

然后在搜索模式下，搜索具有适当冰厚度和样本质量的区域。拍摄有前景区域的 6 秒搜索图像，以确定是否适合数据收集。找到一个好的标本区域后，将载物台正负倾斜 60 度，以确定附近外观相似的充满冰的孔上的网格条或冰晶不阻碍曝光或聚焦区域的最大倾斜范围，切换到曝光模式并调整光束强度或图像采集时间。

因此，对于 CCD，每个记录的图像的电子剂量为每像素 30 到 50 个电子，或每秒每个像素 6 到 8 个电子。对于直接电子检测器，通过将在零度处采集的一秒图像的平均电子数除以空孔上 60 度图像的平均电子数来计算剂量分布比或 I 在 I 60 上为零。在曝光模式下获取一秒钟的图像，并记下每平方埃的电子数。

考虑到剂量分布比，使用适当的自动数据收集软件计算可以记录的特定总电子剂量的图像总数和倾斜间隔。使用刚刚确定的典型 tomos 参数设置并录制 Tom Agram。对于这些样品，从正负 20 度开始，在达到高倾斜度之前经过零度。

要创建和分割 tomos，请将倾斜序列转换为适合重建软件的文件格式。使用像 Im mod 这样的 Tom Graham 重建程序，通过标记金色基准标记的位置来对齐图像。对齐后，生成 Tommo Graham。

通过使用图像过滤器（例如非线性，与 IM o 一起分布的各向同性扩散过滤器）来增强 tommo Graham 的对比度，以实现可视化。使用市售程序手动分割 Tom.将对应于内膜和外膜的体素分配给单独的层，分配后，创建一个表面来可视化膜。

使用 emira 的 EM 包插件中的点击器选项，使用标记的粒子作为输入和适当的软件包（例如粒子估计）来标记 TP syntase 粒子的位置。对于电子断层扫描程序，计算分辨率估计的 agram 平均值。使用免费的可视化程序计算两个独立确定的 sub tommo 平均值之间的门厅壳相关性。

嵌合体首先手动将已知的 X 射线结构拟合到子 Tom Agram 平均值中，然后自动使用命令拟合，如图所示，线粒体电子呐喊中膜的手动分割揭示了线粒体中 Christi 的结构。通过对缺乏某些蛋白质的酵母敲除菌株的线粒体进行成像。可以评估这些蛋白质对 Christi 形态的影响。

这里显示的是来自缺乏 TP 合成亚基 E 的酵母菌株的线粒体，这是形成 TP 合成二聚体所必需的。与野生型线粒体的正常 Lala Christi 不同，这些细胞器反而包含许多内膜结构，这些结构要么没有 Christi，要么包含小的气球状膜内陷。在对比度良好的 Ingram 中，很容易看到 A TP Synthes 二聚体，如此处的黄色箭头所示。

通过分割膜，现在可以将现在由黄色球体表示的 A TP 合成的位置与 Christi 的形态相关联。在这种情况下，A TP 合成物沿着 Lo Meer Christi Sub tommo 的高度弯曲边缘形成一排排二聚体平均，从而可以以 4 纳米或更高的分辨率确定蛋白质的结构。通过将已知的 X 射线结构拟合到 sub tomo Graham 中，可以组装出蛋白质复合物在其天然环境中的平均原子模型。

在这个例子中，可以将平均体积放回 Tomo Graham 中，以帮助组织相对于彼此以及相对于膜中其他蛋白质复合物的单个复合物。我们的协议演示了如何使用电子冷冻断层扫描来确定线粒体内膜内蛋白质复合物的结构和组织。该方案还可用于确定不同细胞区室内其他膜结合蛋白的结构和组织。

样品制备是获得良好热谱的关键。冷冻的水合网格必须包含 70 至 150 纳米厚度的完美玻璃眼。通常，我们会筛选 5 到 6 个网格，直到您找到具有最佳冰厚和标本质量的区域。

对于克级收集，最好使用带有专用冷冻载物台和能量过滤器以及带有直接电子探测器的相机的 300 千伏透射电子显微镜，但也可以使用带有侧入式冷冻载物台和 CCD 相机的 200 千伏仪器。看完这个视频，你应该对如何准备一个 cry m 网格有了很好的了解。收集倾斜序列，重建热谱图，并计算 sub tommo 平均值。

这些是研究细胞中蛋白质的组织如何影响该细胞执行生物功能（如高效 A TP 合成）的能力所需的基本技能。不要忘记使用液氮和液体 Ethan 可能非常危险，应始终佩戴安全眼镜和手套。