Name: ATP合酶二聚体线粒体通过冷冻电子断层扫描可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 了解冷冻电子断层扫描技术用于线粒体蛋白质结构研究的方法。该技术可在天然状态下保存分子细节，帮助研究人员深入理解线粒体功能与蛋白质组织机制。

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本工作由马克斯·普朗克学会（K.M.D.、B.D.、A.W.M.、T.B.、T.B.B.、D.J.M. 和 W.K.）、德国研究基金会资助的“大分子复合物”法兰克福卓越集群（W.K.）以及欧洲分子生物学组织（EMBO）博士后长期奖学金（V.A.M.G.）资助。

1. 通过差速离心法从细胞或组织中制备线粒体
本部分介绍从各种真核生物中分离完整线粒体的一般步骤。针对所研究的每种组织/物种，缓冲液的具体组分和离心速度需要进行优化。
<ol>
	<li>在等渗缓冲液中裂解细胞（例如,&#160;250 mM 蔗糖，10 mM HEPES，pH 7.4），使用玻璃珠研磨仪（真菌菌丝）28，细胞壁的酶解消化（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）)29，球磨匀浆器（单细胞真核生物/培养细胞/线虫）30，或匀浆器（用于动物或植物组织）31.</li>
	<li>通过纱布过滤去除细胞碎片，随后进行低速离心（2,000 × g）, 4 °C，10 分钟。</li>
	<li>通过高速离心（9,000 × g，4 °C，10 分钟）收集上清液和线粒体沉淀。</li>
	<li>必要时，使用等渗密度梯度离心法对线粒体组分进行进一步纯化32.</li>
</ol>
2. 用于电子冷冻断层扫描的线粒体制备
以下部分介绍如何制备用于冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的玻璃态冰冻水合样品。注意：该方法涉及使用极低温的液氮和乙烷，可能造成严重的皮肤冻伤。必须佩戴护目镜和防冻手套。液态乙烷具有可燃性，必须在通风橱中操作。
<ol>
	<li>将线粒体沉淀重悬于250 mM海藻糖、10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）中，调节至总蛋白浓度约为5 mg/ml。</li>
	<li>根据制造商说明，在真空装置中对 glow-discharge 处理的带孔碳膜 EM 载网（碳膜面朝上）进行处理。</li>
	<li>将乙烷气体通入经液氮冷却的铝制容器内壁，使数毫升乙烷液化。</li>
	<li>将蛋白A偶联的金标示踪悬浮液与线粒体悬浮液按1:1比例混合，立即取3 µl滴加至镊子夹持的辉光放电处理过的电镜载网上。</li>
	<li>将镊子放入玻璃化冷冻装置中， 例如，一种自制的切片机。用滤纸楔形片吸去多余液体（约5秒，或直至液体停止扩散），并立即通过释放触发装置将载网浸入液态乙烷中。</li>
	<li>将载网从液态乙烷转移至液氮中。转移过程中，用滤纸去除载网上的过量乙烷。将一块楔形滤纸的尖端插入液态乙烷中，随着液态乙烷沿滤纸上升，轻轻将载网沿滤纸向上拖动，但保持其位于液面前沿以下。通过毛细作用去除载网上的液态乙烷，待液态乙烷完全去除后，立即将载网转移至液氮中。</li>
	<li>将玻璃化网格放入网格储存盒中，根据需要置于液氮中保存以备后续使用。</li>
</ol>
3. 断层扫描倾斜系列的记录
以下部分介绍了如何使用配备有柱后能量过滤器和CCD相机的Polara电子显微镜，对线粒体进行断层扫描倾转系列的设置与数据采集。所有配备CCD或直接电子探测器相机的电子冷冻显微镜均可采用类似的操作流程。
<ol>
	<li>校准显微镜
	<ol>
		<li>插入测试样品，例如，石墨和金岛颗粒置于有孔碳膜上。</li>
		<li>在显微镜的低剂量系统中选择搜索模式。</li>
		<li>将样品调整至同心高度。这是倾斜样品台时在 xy 方向上移动最小的位置。在 0° 倾斜角下将一个感兴趣点居中，将样品台倾斜至 20°，通过调节 z 轴高度重新将该点居中。返回 0° 并重复此过程，直至横向偏移最小化。</li>
		<li>选择曝光模式。选择用于采集断层图像的合适放大倍数（例如，在探测器上 25,000X ≈ 样品像素尺寸为 0.6 nm）。</li>
		<li>选择较小的聚光镜光阑（50–70 mm），并选择合适的光斑尺寸和电子束强度，使电子束略宽于成像设备，并在 CCD 上获得约 60 e-/像素，或在直接电子探测器（计数模式）上获得约 14 e-/像素/秒的像素读数。</li>
		<li>居中聚光镜光阑。</li>
		<li>找到高斯聚焦点，例如，对比度最低的位置。重置显微镜的离焦读数，并根据制造商说明校正枢轴点和旋转中心。</li>
		<li>调节至采集断层图像所需的离焦量。注意：高离焦量（8 µm）可提高对比度但降低分辨率，而低离焦量（2–4 µm）可提高分辨率但牺牲对比度。</li>
		<li>在无样品的孔区，根据制造商说明生成新的增益参考，并对能量滤光片进行校准。</li>
		<li>校准搜索模式与曝光模式。在曝光模式下将一个感兴趣点居中，然后切换至搜索模式。选择 1,500X 的放大倍数（探测器上样品像素尺寸为 0.033 µm/像素）和 100 µm 的离焦量（以增强对比度）。使用图像偏移线圈将感兴趣点重新移回中心。</li>
		<li>在搜索模式下，调节光斑尺寸和电子束强度，使电子束略宽于成像设备，并在 CCD 上获得约 20 e-/像素，或在直接电子探测器（计数模式）上获得约 8 e-/像素/秒的像素读数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>寻找合适的样品区域
	<ol>
		<li>将含有冷冻水合线粒体的载网插入液氮温度下的电子显微镜中（请参考电子显微镜制造商的操作说明）。</li>
		<li>在搜索模式下，扫描载网以寻找冰层厚度和样品质量合适的区域。对有潜力的区域采集一幅 6 秒的搜索图像，以判断是否适合进行断层图像采集。在此放大倍数下，应能清晰看到线粒体的内膜和外膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>断层倾斜系列图像的采集
	<ol>
		<li>找到合适的样品区域后，将样品台倾斜 ±60°，以确定在不被载网条或冰块遮挡曝光或聚焦区域的前提下可达到的最大倾斜范围。</li>
		<li>在附近一个外观相似且充满冰的孔区，切换至曝光模式，并调节电子束强度或图像采集时间，使每幅记录图像的电子剂量为 CCD 上 30–50 e-/像素，或直接电子探测器（计数模式）上 6–8 e-/像素/秒。</li>
		<li>通过将 0° 时采集的 1 秒图像的平均电子计数除以 60° 时图像的平均电子计数，计算剂量分布比（I0/I60）。该比值描述了随着倾斜角度增加，为保持每幅图像电子计数恒定所需增加的曝光时间（曝光时间 = 1/cos(α)n，其中 I0/I60 = 2n）。该比值也可作为冰层厚度的良好指标。线粒体的高质量断层图像通常在 I0/I60 = 2.3–2.6 的条件下采集。</li>
		<li>在无样品的孔区，以曝光模式采集一幅 1 秒图像，并记录每平方埃（Å2）的电子计数。结合剂量分布比，计算在特定总电子剂量下可采集的图像总数（例如，&#60;40 e-/Å2 用于结构解析，&amp;#38; ~160 e-/Å2 用于形态学观察）。</li>
		<li>通过将总倾斜范围（例如，±60° 对应 120°）除以步骤 3.3.4 中计算出的图像总数，确定断层图像采集所需的合适倾斜间隔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用上述确定的参数，通过适当的自动数据采集软件33,34 设置并记录断层图像。倾斜系列通常从 ±20° 开始，经过 0° 后再达到高倾斜角度，以最大限度保留低倾斜图像中的信息，因为高电子剂量会破坏这些信息。</li>
</ol>
4. 体层成像体积的创建与分割
本部分介绍如何从倾斜系列图像中生成线粒体的断层成像体积数据，以及如何对这些体积数据进行可视化展示。
<ol>
	<li>将断层扫描倾转系列保存至合适的目录中。使用开源软件（如 dm2mrc 或 tif2mrc（IMOD 软件包））生成图像堆栈，并将其转换为合适的文件格式，将 .dm3、.dm4 或 .tif 文件转换为 mrc 堆栈。使用 IMOD 进行断层重建时需要 mrc 堆栈格式。35其他软件包需要不同的格式。</li>
	<li>按照 IMOD 教程中详述的步骤对图像进行对齐并生成断层扫描图（tomogram）<a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a>).</li>
	<li>使用 IMOD 自带的非线性各向异性扩散滤波器增强断层图像的对比度。该滤波器对膜结构及与膜相关的颗粒（如 ATP 合酶）具有良好的处理效果。</li>
	<li>为实现可视化，使用市售软件对断层图像进行手动分割 例如， Amira。分配对应于内膜或外膜的体素，并生成表面。使用 AMIRA 软件中 EM-package 插件的点击工具选项36 标记ATP合酶颗粒的位置。</li>
</ol>
5. ATP合酶二聚体的亚断层平均及X射线结构拟合
以下部分描述了如何获得ATP合酶二聚体的亚断层平均图。
<ol>
	<li>以标记的颗粒作为输入，并使用适当的软件包（如“电子断层成像颗粒估算”程序），计算亚断层平均图。</li>
	<li>为评估分辨率，可通过傅里叶壳层相关性37比较两个独立测定的亚断层平均图。</li>
	<li>若有可用结构，可通过刚体拟合将已知的X射线晶体结构对接到亚断层平均图中，可手动操作，或使用Chimera程序中的自动顺序对接算法等自动对接工具38。</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文介绍的方案为线粒体的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）及子层析平均化技术提供了入门指导，但基本相同的方法也可应用于其他任何细胞区室或膜结构。为了获得尽可能高质量的数据，实验过程中的关键步骤包括样品制备、 plunge freezing（骤冷）过程以及数据采集策略。样品质量对实验成功至关重要，其依赖于优化的冷冻方案，以确保合适的冰层厚度，这对获得良好的图像对比度极为重要。最佳的数据采集策略取决于所使用的仪器和样品本身。需要优化的参数包括每幅图像的电子剂量、倾斜方案和离焦量。对高质量样品采集出高质量的断层图，将使后续所有处理步骤更加容易，并确保最终结果令人满意。
结合亚断层平均化和原子模型拟合的冷冻电子断层扫描技术（Cryo-ET）能够提供蛋白质复合物在其天然细胞环境中排列方式的详细信息。该技术同样适用于研究大型膜蛋白复合物的结构，例如呼吸链超复合物（1.7 MDa）、ATP合酶二聚体（2×500 kDa）或核孔复合物（约120 MDa）8,9,17。由于ATP合酶二聚体在去垢剂提取过程中会破坏其成排结构，而该提取步骤是膜蛋白复合物分离与纯化的必要过程，因此诸如X射线晶体学、核磁共振（NMR）或单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）等高分辨率技术均无法观察到ATP合酶二聚体的成排组织形式。
ATP合酶以二聚体成排的形式沿嵴脊排列，是所有物种线粒体中普遍存在的组织原则。电子传递链的质子泵复合物，特别是复合物I（NADH脱氢酶），位于这些成排结构两侧的膜区域8,9。呼吸链的这种组织方式对线粒体生物能量学具有深远影响。如果由于缺乏二聚体特异性蛋白亚基而导致成排结构无法形成，细胞会表现出更长的世代时间以及降低的细胞适应性，如图3所示的酵母突变体中所观察到的那样41。随着对线粒体疾病研究兴趣的日益增长，深入理解调控线粒体超微结构与功能的分子基础变得至关重要。电子冷冻断层成像技术（cryo-ET）为高分辨率方法测定的蛋白质结构与其在膜上纳米尺度的分布和排列之间建立了联系。这使得冷冻电子断层成像成为理解健康与疾病状态下线粒体结构与功能不可或缺的工具。
冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）的进一步技术发展与改进包括蛋白质标记策略，用于识别大分子复合物中蛋白质亚基的位置，或细胞中较小或结构不明显的蛋白质（&#60;0.5 MDa）的定位。此外，近年来，结合了亚断层平均化与单颗粒分析或螺旋重构的混合电镜处理方法，已将蛋白质结构解析至约 8 Å 分辨率42,43。然而，这些处理方法目前仅限于在冰层中分布良好或形成螺旋组装结构的纯化蛋白质，尚不适用于线粒体和嵴膜等拥挤的细胞环境。在数据采集方面，新的计算与硬件工具正在开发中，以实现断层图像的自动化采集，提高图像对比度，并降低所需的总电子剂量。cryo-ET 的唯一根本限制是电子束对样品造成的辐射损伤。这意味着在记录断层倾斜系列的每张图像时，只能使用极低的电子剂量，从而导致信噪比较低，最终限制了可达到的分辨率。一年多前推出的新型直接电子探测器，目前正在彻底改变单颗粒冷冻电镜领域44,45。这些新型探测器在较低电子剂量下即可提供更高的对比度和更优的分辨率。对于冷冻电子断层扫描而言，这意味着可以采集步长更小的倾斜系列，甚至双轴断层图像，而无需担心过度的辐射损伤（一张 CCD 图像的电子剂量相当于五张直接电子探测器图像）。这些探测器产生的海量数据在数据处理、管理和存储方面带来了新的挑战，亟待解决。
此外，基于与光学显微镜中常规用于增强相位对比度的原理相似的相位板，目前正被开发用于透射电子显微镜46,47。这将使得断层成像能够在更接近焦平面的条件下进行，从而实现更高分辨率，同时保留对断层图像对齐和三维结构解释所必需的低分辨率特征。总体而言，这些技术进步将极大拓展冷冻电子断层成像（cryo-ET）所能回答的生物学问题的范围。

线粒体是细胞的“能量工厂”。线粒体ATP合酶通过将线粒体内膜两侧的电化学质子梯度转化为化学键能，生成了驱动细胞过程所需的大部分ATP。为了理解线粒体能量转换背后的机制，我们需要确定ATP合酶的结构 原位，并了解其在线粒体内膜中的排列与分布方式。尽管大多数线粒体ATP合酶组分的高分辨率结构1-3 整个复合体的低分辨率图谱4 可获得的情况下，确定工作状态的酶在膜中的结构与构象至关重要。ATP合酶在线粒体内膜中的分布通常被认为呈随机分布，但早期的一项发现5 以及我们初步的实验结果6 表明事实并非如此。我们团队及其他团队后续的研究7 已证实ATP合酶沿线粒体内膜嵴的紧密弯曲脊状结构排列成二聚体的长行8，而电子传递链中的质子泵似乎位于这些排的两侧9这种排列方式对线粒体能量转换机制具有重要意义。
我们用于确定这种排列方式的技术是电子冷冻断层扫描（cryo-ET）。目前，cryo-ET 是唯一能够在分子分辨率下提供细胞、细胞区室或细胞器精确三维（3D）结构信息的方法。cryo-ET 特别适用于研究生物膜中的大型复合物，因为膜结构在三维断层图像中具有良好的对比度，易于进行三维追踪。
研究细胞或细胞器三维结构的其他方法无法提供分子层面的细节。超分辨率荧光显微镜10,11能够以数十纳米的精度精确定位标记在目标蛋白上的发光标签的位置或间距，但无法揭示蛋白质自身的结构，即使在低分辨率下亦如此。对塑料包埋的生物样品进行连续切片的透射电子显微镜观察12，或通过扫描电子显微镜进行块面成像13，可提供细胞体积的低分辨率图像，但同样无法呈现分子细节。原子力显微镜14原则上可达到分子甚至原子级分辨率，但仅限于在原子级平整的固体支撑表面上的物体表面成像。最后，X射线断层扫描15或利用自由电子激光产生的高强度X射线脉冲进行散射分析16，在可预见的未来也不太可能揭示完整细胞或细胞器等大而复杂且非周期性结构的分子分辨率三维结构。因此，目前尚无其他方法可替代冷冻电子断层成像技术（cryo-ET）用于在纳米尺度上研究细胞或细胞器的三维结构。
冷冻电子断层扫描（Cryo-ET）是研究膜相关蛋白复合物结构与构象的首选方法，包括核孔复合物17、流感病毒刺突复合物18以及鞭毛马达蛋白22,23，同时也可用于分析完整细菌细胞的组织结构19以及HIV等病原病毒进入细胞的过程20-23。Cryo-ET在可视化细胞内丝状蛋白及其相互作用方面具有不可替代的价值，例如肌动蛋白丝24或轴丝结构25。通过子层析平均法（subtomogram averaging）26，可将分辨率提升至2 nm或更高；该方法利用单颗粒图像处理技术，从断层图像中提取出具有重复性和规律性特征的子体积区域并进行平均处理。
冷冻电子断层扫描（Cryo-ET）涉及在透射电子显微镜（TEM）中，对一个薄样品（&#60;250 nm）在不同倾斜角度下获取一系列投影图像。样品必须足够薄，以确保与物质相互作用强烈的电子最多仅发生一次散射。多次散射会使所得图像难以解释，并降低对比度。通过合适的计算机程序，将所选样品区域的图像相互对齐并投影到三维空间中，从而生成样品的三维体积结构。图像的对齐过程借助金 fiducial 标记物实现，这些标记物在样品冷冻前与样品混合。理想情况下，每张图像中应包含10个或更多均匀分布的 fiducial 标记物，以实现良好的对齐效果。
为了观察分子细节，样品需在液态乙烷中快速浸入冷冻，以保持其天然的水合状态。在液态乙烷中冷冻的速度极快（约 ~105 °C/sec）27，使得水不会结晶，而是保持在一种玻璃化、类似玻璃的状态。冰晶的形成会破坏敏感的生物结构。由于生物样品容易受到辐射损伤，因此样品所能承受的散射事件总数存在限制。因此，图像以低剂量模式采集：首先在低倍率（1,500X）下、电子剂量低于 1 e-/nm2 的条件下（搜索模式）确定感兴趣区域；然后在较高倍率下，在感兴趣区域之外进行对焦（对焦模式）；只有在正式采集图像时，才对感兴趣区域施加较高的电子剂量进行照射（曝光模式）。
本文以线粒体内膜中的ATP合酶二聚体为例，概述了如何采集和处理电子冷冻断层图像。以下方案描述了如何为电子冷冻断层扫描制备线粒体，如何设置并采集具有特定总电子剂量的倾斜系列图像，以及如何处理倾斜系列图像以获得目标区域的三维重构体积。该流程的概览如图1所示。

<table><tbody><tr><td>蔗糖</td><td>Roth</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>海藻糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>溶壁酶</td><td>biomol</td><td>Z1000.1</td><td></td></tr><tr><td>密度梯度介质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556 或 P1644</td><td></td></tr><tr><td>蛋白A金标</td><td>Aurion</td><td>810.111</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>乙烷</td><td>Air Liquide</td><td>P0502S02R0A001</td><td></td></tr><tr><td>氮气</td><td>Air Liquide</td><td>I4150RG</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1004 090</td><td>4号</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumont</td><td>T506</td><td>非磁性，#5型</td></tr><tr><td>透射电镜复合测试载网</td><td>Plano GmbH</td><td>S142</td><td>带石墨和金岛的多孔碳膜</td></tr><tr><td>多孔碳载网</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH 或 C-flat</td><td></td><td>R2/2 300 Cu网</td></tr><tr><td>冷冻载网盒</td><td>Plano GmbH</td><td>160-42</td><td>可选自制金属盒</td></tr><tr><td>玻璃匀浆器（Potter）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7984</td><td></td></tr><tr><td>搅拌器</td><td>Waring</td><td>8011S</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠研磨仪（珠击式）</td><td>BioSpec Products</td><td>1107900-105</td><td>含0.5 mm珠子</td></tr><tr><td>轴承珠（Balch）匀浆器</td><td>isobiotec</td><td>H8</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>46915</td><td>Sorvall RC6+</td></tr><tr><td>辉光放电装置</td><td>Bal-Tec A.G.</td><td>CTA 010</td><td></td></tr><tr><td>载网玻璃化装置</td><td>FEI, Gatan 或 Leica</td><td></td><td>可选自制冷冻投入装置</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>FEI 或 Jeol</td><td></td><td>300 keV</td></tr><tr><td>直接电子探测器</td><td>Gatan</td><td>K2 summit</td><td>4k × 4k 像素，计数模式</td></tr><tr><td>电荷耦合器件（CCD）</td><td>Gatan</td><td>US4000</td><td>4k × 4k 像素（直接电子探测器的替代方案）</td></tr><tr><td>能量过滤器</td><td>Gatan 或 Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>图像采集软件</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>断层图像采集软件</td><td>Gatan, FEI, USCF 或 UC-Boulder</td><td></td><td>4种可选方案</td></tr><tr><td>断层图像处理软件</td><td>FEI, UCSF 或 UC-Boulder</td><td></td><td>3种可选方案</td></tr><tr><td>子断层平均软件</td><td>UC-Boulder 或 巴塞尔大学</td><td></td><td>2种可选方案</td></tr><tr><td>断层图像可视化软件</td><td>UC-Boulder, FEI 或 犹他大学</td><td></td><td>3种可选方案</td></tr><tr><td>可视化软件插件</td><td>歌德大学</td><td></td><td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td></tr><tr><td>结构可视化软件</td><td>UCSF</td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr><tr><td>数值计算软件</td><td>MathWorks</td><td></td><td>http://www.mathworks.de/academia/</td></tr></tbody></table>

通过电子冷冻断层扫描技术可视化线粒体中的atp合酶二聚体

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

电子冷冻断层扫描技术是结构生物学中一种强大的工具，能够以分子细节水平对细胞、细胞器、膜囊泡或病毒等生物样品的三维结构进行可视化观察。为实现这一目标，需将含水样品迅速浸入液态乙烷中实现玻璃化冷冻，从而使其保持接近天然状态的冻结水合形态。随后在透射电子显微镜中，于液氮温度下采集样品的倾斜系列图像，并据此重构出三维断层图像。由于断层数据体固有的信噪比较低，可通过亚断层平均技术增强其中可识别且重复出现的结构特征，即裁剪出多个相同的亚体素，对其进行空间对齐并取平均以降低噪声。通过该方法，可获得分辨率达到2 nm甚至更高的三维密度图。随后将已知的高分辨率结构模型拟合至该三维密度图中，即可构建出蛋白质复合物在其天然环境中的原子模型。本文将展示我们如何利用电子冷冻断层扫描技术来研究 原位 线粒体中大型膜蛋白复合物的排列方式。我们发现，ATP合酶沿内膜嵴高度弯曲的嵴顶以二聚体成行排列，而复合物I则随机分布在这些成行区域两侧的膜中。通过亚断层平均法，我们获得了嵴膜中线粒体ATP合酶二聚体的结构。

线粒体的电子冷冻断层成像清晰地揭示了该细胞器的三维形态（图2）。通过对断层图像数据中的膜结构进行手动分割，可以展示线粒体内嵴的结构。通过成像来自不同酵母基因敲除菌株的线粒体（这些菌株缺失特定的蛋白质组分），可评估这些蛋白质对嵴形态的影响。图3 展示了一种缺失ATP合酶亚基e的酵母菌株中的线粒体。ATP合酶复合物中的这一组分对于线粒体ATP合酶的二聚化至关重要。该菌株的线粒体缺乏野生型线粒体中典型的板层状嵴结构（图2），而是包含多个内膜区室。这些区室要么完全缺失嵴结构，要么含有少量球囊状的膜内陷结构（图3）。
在对比度良好的断层图像中，较大的线粒体蛋白质复合物（本例中为ATP合酶二聚体）清晰可见（图4；视频1）。通过子断层图平均法，可将这些复合物的结构解析至2-3 nm的分辨率（图5；视频2）。平均后的体积图可重新放置回断层图像中，以评估各个复合物之间的空间排列关系及其相对于膜中其他蛋白质复合物的定位（图6；视频3）。
<img alt="线粒体的分离、冷冻及冷冻电镜；示意图；流程：细胞破碎、断层成像。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 电子冷冻断层成像各阶段的流程图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图。</a>
<img alt="线粒体结构、断层扫描及3D模型，标注了内膜、外膜、嵴和基质。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 野生型 S. cerevisiae 线粒体的形态学结构。 对野生型 S. cerevisiae 线粒体的断层扫描体积数据进行中心切片（左图）及其对应的表面渲染体积图像（右图）。外膜的分割体积以灰色显示，内边界膜和嵴膜的体积以浅蓝色显示。改编自 Davies et al8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像。</a>
<img alt="线粒体结构示意图，突出显示膜、嵴和基质；电子显微镜对比图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 缺失 ATP 合酶二聚化所需亚基的 S. cerevisiae 菌株的线粒体。 对缺失 ATP 合酶二聚化所需蛋白亚基 e 的 S. cerevisiae 菌株的线粒体进行断层扫描成像（左）及其对应的表面渲染体积图像（右）。与图 2相比，该突变菌株的线粒体缺乏野生型线粒体典型的板层状嵴结构，取而代之的是大量内膜区室，其内无嵴或含有气球状嵴。因此，冷冻电子断层扫描技术可清晰揭示基因缺失导致的膜形态改变。改编自 Davies et al8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像。</a>
<img alt="叶绿体的电子显微镜图像，显示ATP合酶的位置，示意图标明能量合成位点。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 来自真菌 P. anserina 的线粒体。 对丝状真菌 P. anserina 的一个线粒体进行断层扫描切片（左）及其对应的表面渲染体积图像（右）。在此断层图中，10 nm颗粒成行排列（黄色箭头），位于内膜嵴高度弯曲的膜脊上方（见视频1）。通过子层析平均法已将这些颗粒鉴定为ATP合酶二聚体。引自Davies 等9。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>
<img alt="显示分子构型、结合位点和相互作用的蛋白质结构示意图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 线粒体ATP合酶的结构与排列方式。 左侧为酿酒酵母（S. cerevisiae）ATP合酶二聚体的侧面和顶面视图，通过亚断层扫描平均法结合拟合的原子模型确定其电子密度；右侧为线粒体内膜囊泡，显示ATP合酶二聚体呈行状排列。该图通过将ATP合酶二聚体的亚断层平均结构按照平均过程中计算出的坐标置入膜囊泡的分割体积中生成。改编自Davies et al8。原子模型：F1/转子环 [PDB:2WPD]39（蓝色和紫色）；寡霉素敏感赋予蛋白-OSCP [PDB:2BO5]40（绿色）；外周 stalk 片段 [PDB:2CLY]1，含来自[PDB:2WSS]2的N端残基（黄色和红色）（见视频 2）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像。</a>
<img alt="显示微管排列的冷冻电镜图；揭示蛋白质相互作用的三维结构分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 来自 P. anserina 线粒体的分离嵴囊泡。 来自 P. anserina 嵴囊泡的断层扫描体积切片（左）及其对应的表面渲染体积（右）。从膜上突出的蛋白质密度清晰可见。由黄色箭头指示的密度为ATP合酶二聚体，通过亚断层平均法鉴定确认。绿色箭头指向经抗体标记鉴定为NADH脱氢酶（复合物I；详见9）的密度。对蛋白质密度进行分割后，揭示了它们在嵴中的组织方式：ATP合酶二聚体（红色和黄色）沿高度弯曲的嵴脊成行排列，而NADH脱氢酶复合物（绿色）则位于这些行两侧的膜区域（见视频3）。引自 Davies et al9。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>
视频 1. P. anserina 线粒体的电子冷冻断层扫描图像。 本视频展示了从丝状真菌 P. anserina 的一个线粒体获得的断层扫描体积数据的连续切片。ATP 合酶的排列以黄色箭头标示。经过表面渲染和分割的体积图像显示了 ATP 合酶（黄色球体）相对于线粒体嵴三维结构的位置。外膜为灰色；内边界膜为透明蓝色；嵴膜为不透明蓝色。引自 Davies et al9。另见图 4。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">点击此处观看视频</a>。
视频2. 来自线粒体ATP合酶二聚体的亚断层扫描平均图像 S. cerevisiae 配有拟合的原子模型。 平均值由121个子体积计算得出。密度以三个等高线水平显示：1σ（网格状）、2σ（浅灰色）和3σ（深灰色）。使用Chimera中的顺序拟合程序将原子模型拟合到密度中。原子模型：F1/rotor环 [PDB:2WPD]39 （蓝色和紫色）；寡霉素敏感赋予蛋白-OSCP [PDB:2BO5]40 （绿色）；外周 stalk 片段 [PDB:2CLY]1 来自[PDB:2WSS]的N端残基2 （黄色和红色） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">点击此处观看视频。</a>
改编自 Davies 等8。另请参见图5。
视频 3. 来自 P. anserina 线粒体的分离嵴囊泡。 展示了对断层扫描体积数据的连续切片，随后是分割后的表面渲染体积图像。膜上突出的蛋白质密度清晰可见。红色和黄色密度为 ATP 合酶二聚体。绿色密度为经抗体标记确定的 NADH 脱氢酶（复合物 I）。资料来自 Davies et al9。另见图 6。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">点击此处观看视频。</a>

我们介绍了一种收集和处理完整线粒体冷冻电子断层成像图的方法。该技术可提供关于天然生物膜中大型膜蛋白复合物的结构、功能和组织的详细信息。

通过电子冷冻断层扫描技术可视化线粒体中的ATP合酶二聚体

电子冷冻断层扫描技术是结构生物学中一种强大的工具，能够对生物样品（如……）的三维结构进行可视化观察。

本实验的总体目标是确定 C two 中线粒体蛋白质的结构与组织形式。首先制备含有样品的冷冻水合电子显微镜载网，随后在冷冻电子显微镜中对样品进行剂量受限的倾斜系列图像采集。然后对倾斜系列图像进行处理，以生成断层扫描体积。最后，对蛋白质密度进行平均，以确定蛋白质的结构，并对膜进行分割以揭示其三维结构。通过将蛋白质的平均结构重新定位到Tom Grahams中，可揭示膜中蛋白质的结构与组织方式。因此，我们对线粒体进行电子冷冻断层扫描，以期在分子水平上理解其工作原理。与薄塑料切片的透射电子显微镜等其他方法相比，该技术的主要优势在于分辨率更高。样品无需任何化学固定，蛋白质的分子细节得以完整保留。电子冷冻断层成像技术需要一定时间才能掌握，但经验丰富的使用者每次实验可获得五到六个高质量的断层图像。该实验流程中最困难的部分是制备冰层厚度适宜的冷冻水合网格。根据文本方案，在分离并离心收集线粒体后，使用含250毫摩尔三羟甲基氨基甲烷（Tris）和10毫摩尔HEPES缓冲液的溶液重悬沉淀物，使总蛋白浓度约为每毫升5毫克。按照制造商说明，将全碳支持膜电镜网格（碳膜面朝上）在真空装置中进行辉光放电处理。将少量乙烷气体喷射至液氮冷却的铝制容器内壁，使数毫升乙烷液化。使用一对镊子夹取一个经辉光放电处理的DM载网，将其放置在实验台上。将蛋白质与标记金颗粒的参照物悬浮液和线粒体悬浮液以1:1的比例混合，立即取三微升该混合液滴加到载网上。接着，将镊子放入冷冻固定装置（例如自制的 Guillotine 装置）中，用滤纸楔形片从载网上吸去多余液体，然后释放触发装置，迅速将载网浸入液态乙烷中。随后，将载网从液态乙烷转移至液氮中。通过将新的滤纸楔形尖端插入液态乙烷中，去除载网上多余的乙烷。当液体上升时，轻轻将载网沿滤纸向上拖动，始终保持载网位于液面前端以下，随后立即将其转移至液氮中保存以备后续使用。将载网放入载网盒中，并置于充满液氮的杜瓦瓶内，用于记录断层扫描倾斜系列图像。首先确保液氮罐已加满，并检查样品台和载网转移装置的温度低于100开尔文。通过拍摄测试载网的图像并检查衍射环的质量，确认透射电子显微镜已良好校准：衍射环应呈圆形，并延伸至图像边缘。接着，插入载有冷冻水合线粒体的载网。然后进入搜索模式，寻找冰层厚度和样品质量合适的区域。对有希望的区域拍摄六秒的搜索图像，以确定其是否适合进行数据采集。找到合适的样品区域后，将载物台向正负60度方向倾斜，以确定在不被支撑栅条或附近外观相似的冰孔中冰晶遮挡曝光或聚焦区域的情况下可达到的最大倾斜范围，随后切换至曝光模式，并调整电子束强度或图像采集时间。因此，每幅记录的图像对于CCD而言，其电子剂量为每像素30至50个电子，或每像素每秒6至8个电子。对于直接电子探测器，通过将零度下采集的一秒图像在无孔区域的平均电子计数除以60度下同样区域图像的电子计数，计算剂量分布比率（即I₀/I₆₀）。在曝光模式下采集一幅一秒图像，并记录每平方埃的电子计数。根据剂量分布比例，使用合适的自动数据采集软件，计算在特定总电子剂量下可记录的图像总数和倾斜间隔。使用刚刚确定的典型断层参数，设置并记录断层图。对于这些样品，从正负20度开始，经过零度，再达到高倾斜角度。要创建和分割断层图像，需先将倾转系列转换为适用于重建软件的文件格式。使用诸如Imod之类的Tom Graham重建程序，通过标记金标示物的位置来对图像进行对齐。对齐后，生成Tommo Graham。通过使用图像滤波器（例如随 IM o 提供的非线性各向异性扩散滤波器）来增强 tommo Graham 的对比度，以用于可视化。使用商业软件对 Tom 进行手动分割。将对应于内膜和外膜的体素分配到不同的层中，分配完成后，生成表面以可视化膜结构。使用 emira 的 EM 软件包插件中的点击工具选项，以标记的颗粒作为输入，并结合适当软件包（如颗粒估算软件）标记 TP 合成酶颗粒的位置。对于电子断层扫描程序，计算一幅平均图像以进行分辨率估算。使用免费可视化程序，计算两个独立确定的子断层图平均图像之间的首层壳层相关性。Chimera 软件首先通过手动方式，然后使用本图所示的“fit”命令自动将已知的X射线结构拟合到亚断层平均的Tom Agram中。对线粒体电子冷冻显微镜图像中的膜进行手动分割，可揭示线粒体中嵴的结构。通过成像缺乏特定蛋白质的酵母敲除菌株的线粒体，可以评估这些蛋白质对嵴形态的影响。图中所示为缺乏 TP 合成酶亚基 E 的酵母菌株的线粒体，该亚基是形成 ATP 合成酶二聚体所必需的。与野生型线粒体典型的规则排列的嵴结构不同，这些细胞器包含若干内膜结构，这些结构要么缺乏嵴，要么含有小型球状的膜内陷结构。在对比度良好的显微图像中，ATP 合成酶二聚体清晰可见，如图中黄色箭头所示。通过分割膜结构，可以将由黄色球体表示的ATP合成位置与嵴的形态关系可视化。在此情况下，ATP合成以二聚体形式排列成行，位于高曲率的线粒体嵴边缘。亚断层平均技术使得蛋白质结构的分辨率可达四纳米或更高。通过将已知的X射线结构拟合到亚断层平均图中，可以组装出蛋白质复合物在其天然环境中的原子模型，如图所示。在此示例中，平均体积可重新放入Tomo Graham中，以帮助确定各个复合物之间以及它们与膜中其他蛋白质复合物的相对空间排列。本方案展示了如何利用电子冷冻断层扫描技术来确定线粒体内膜中蛋白质复合物的结构与组织方式。该方案也可用于确定不同细胞区室中其他膜结合蛋白的结构与组织形式。样品制备是获得良好热图的关键。冷冻水合载网必须含有厚度为70至150纳米的完全玻璃态冰层。通常需要筛选五到六个载网，直至找到冰层厚度和样品质量均理想的区域。对于断层扫描数据的采集，最好使用配备专用冷冻样品台、能量过滤器和直接电子探测器相机的300千伏透射电子显微镜，但也可使用配备侧插式冷冻样品台和CCD相机的200千伏仪器。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备冷冻电镜载网、采集倾斜系列图像、重构断层图以及计算亚断层平均图。这些是研究细胞内蛋白质的组织方式如何影响细胞执行生物功能（如高效的ATP合成）所需的基本技能。切记，操作液氮和液态乙烷可能存在极大危险，必须始终佩戴护目镜和手套。

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ATP合酶二聚体线粒体通过冷冻电子断层扫描可视化

我们介绍了一种利用高通量冷冻电子断层扫描技术测定高分辨率结构的实验方案 原位...

使用 Tomoauto：高通量自动化冷冻电子断层成像实验方案

许多蛋白质在结合到膜表面时发挥其功能。通过透射电子显微镜可间接观察外周蛋白与纳米盘膜的结合。我们发现，负染剂磷钨酸钠诱导纳米盘形成特征性堆叠（缗钱状结构）的现象，会因外周蛋白的结合而受到抑制。...

通过透射电子显微镜可视化与分析膜相互作用蛋白的方法

在本方案中，我们展示了连续切片电子断层扫描技术在阐明果蝇（Drosophila）间接飞行肌线粒体结构中的应用。...

三维线粒体超微结构 果蝇 通过连续切片电子断层扫描揭示的间接飞行肌

我们提出了一种研究线粒体和内质网在基因改造后于全细胞中分布的方案，该方案结合了相关光镜与三维电子显微镜技术，包括抗坏血酸过氧化物酶2和辣根过氧化物酶染色、在同一切片中对含有或不含目标基因的细胞进行连续切片，以及通过电子显微镜进行连续成像。...

线粒体与内质网的光与体电子显微镜关联成像

我们提出了一种用于大分子高分辨率结构研究的冷冻生物样品冷冻聚焦离子束微加工薄片制备方案 原位 使用冷冻电子断层扫描技术。本方案提供了制备高质量、高重复性薄片的指南，用于对细胞内大分子的结构进行表征 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）.

样品制备与冷冻聚焦离子束微加工 酿酒酵母 用于冷冻电子断层扫描

本实验方案描述了使用 Tomo5 进行高分辨率冷冻电子断层扫描远程数据采集，以及使用 emClarity 进行后续数据处理和子断层平均化的方法。以脱铁铁蛋白为例，详细展示了获得分辨率为 2.86 Å...

冷冻电子断层扫描远程数据采集与亚断层图像平均法

本方案描述了如何使用全内反射荧光显微镜（TIRF）追踪支撑脂质膜中的单个离子通道并测定其活性，从而阐明侧向膜运动与通道功能之间的相互作用。方案详细介绍了如何制备膜样品、记录数据以及分析结果。...

使用全内反射荧光显微技术对脂双层中单分子侧向迁移及离子通道活性进行成像

冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术提供了一种无需包埋、切片或其他侵入性制备步骤即可观察完整细胞中细胞器的方法。目前该技术获得的三维分辨率可达数纳米，视场范围为数微米，可观察样品厚度约为 1...

细胞器的可视化 原位 通过冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术

本方案描述了如何重建线粒体嵴以实现高精度、高分辨率和高通量的三维成像。...

一种用于可视化胰腺癌细胞线粒体超微结构变化的三维技术

冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）能够以纳米级分辨率实现细胞超微结构的三维可视化，但手动分割仍耗时且复杂。我们提出了一种新颖的工作流程，该流程整合了先进的虚拟现实软件用于cryo-ET断层图的分割，并通过对哺乳动物细胞中线粒体的分割展示了其有效性。...

利用虚拟现实技术实现冷冻电子断层数据的沉浸式分割与分析

了解冷冻电子断层扫描技术用于线粒体蛋白质结构研究的方法。该技术可在天然状态下保存分子细节，帮助研究人员深入理解线粒体功能与蛋白质组织机制。

通过电子冷冻断层扫描技术可视化线粒体中的ATP合酶二聚体

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