Name: 体内转染和基因敲除在脊髓通过快速无创腰椎鞘内注射小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: 学习通过快速无创腰椎鞘内注射在小鼠脊髓进行体内转染和基因敲除的技术。该方法利用siRNA实现局部基因沉默，为神经科学研究提供高效可靠的实验手段。

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所有动物使用程序均符合当地管理机构（德国卡尔斯鲁厄政府区，卡尔斯鲁厄，德国）制定的伦理准则。
1. siRNA/PEI 复合物的制备
 
按照制造商的说明，制备siRNA/PEI复合物溶液，步骤如下：
<ol>
	<li>溶液 A：将所需量的 siRNA 用无菌水（如有必要）稀释至终体积的四分之一，再用 10% 葡萄糖溶液进一步稀释至终体积的一半。轻轻涡旋或通过移液上下吹打混匀。siRNA 的最佳用量需通过实验确定，但每只动物使用 10 µl 复合溶液中含 1 µg siRNA 是优化实验的良好起点。</li>
	<li>溶液 B：将所需体积的 PEI 试剂用无菌水稀释至终体积的四分之一，再用 10% 葡萄糖溶液进一步稀释至终体积的一半。轻轻涡旋或通过移液上下吹打混匀。 
	注意：PEI 试剂的用量决定了复合物中的离子平衡，从而影响转染效率。同样，PEI 溶液的最佳用量也需通过实验确定。在我们的实验条件下，每 1 µg siRNA 对应的最佳 PEI 溶液体积为 0.12 μl。</li>
	<li>将溶液 A 与溶液 B 一次性混合，轻轻涡旋。</li>
	<li>混合后的溶液在使用前于室温孵育 15 分钟。该复合物在室温下可稳定 2 小时，在 4 °C 下可稳定 24 小时。</li>
</ol>
2. 鞘内注射
<ol>
	<li>使用3%异氟烷麻醉小鼠，直至其翻正反射消失。&#160;此外，通过检查尾部和/或足垫夹捏反射进一步确认麻醉状态。&#160;</li>
	<li>在动物尾根部后端约2 cm2区域剃毛，以便在针头插入过程中获得更好的视野。</li>
	<li>将小鼠置于鼻罩中以在操作期间持续给予异氟烷，将其浓度降至1.5%，并用眼用润滑剂覆盖小鼠眼睛。</li>
	<li>使用连接30 G 0.5英寸针头的25 µl Hamilton注射器，准备即用型siRNA混合溶液。</li>
	<li>定位L6棘突（应为最突出的棘突），并通过轻压固定该区域的脊柱。</li>
	<li>小心地将针头插入L5与L6椎骨之间的沟槽，并观察是否出现尾巴抽动，此现象表明针头已成功进入硬膜内腔。 
	提示：可用指甲触诊定位该沟槽。</li>
	<li>一旦观察到尾巴抽动，应立即但小心地用一只手固定针头位置，同时用另一只手缓慢注入所需体积的物质。 
	提示：注入体积在5–10 µl之间为最佳，因体积小于5 µl不可靠，而大于10 µl则会导致压力过高。</li>
	<li>注射完成后，将小鼠移回笼中，使其从麻醉中恢复。</li>
	<li>为实现靶基因的最佳下调，每隔24小时重复注射至少2次。</li>
</ol>

<ol><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).</li>
<li>Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+tactile+allodynia+following+intrathecal+puncture+in+mouse%3A+contributions+of+Toll-like+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling.</a> Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).</li>
<li>Goula, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+intravenous+delivery+of+transgenes+to+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung.</a> Gene Ther. , 1291-1295 (1998).</li>
<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).</li>
<li>Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+modulation+of+wide+dynamic+range+neurons+in+the+lumbar+dorsal+horn+of+the+rat+by+spinally+administered+WIN55%2C212-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2.</a> Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).</li>
<li>Song, Z. H., Takemori, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+spinal+kappa+opioid+receptors+in+the+antinociception+produced+by+intrathecally+administered+corticotropin-releasing+factor+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).</li>
<li>Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+cannabinoid+%28CB1%29-receptors+in+the+development+and+maintenance+of+opioid+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance.</a> Neuroscience. , 1275-1288 (2007).</li>
<li>Yaksh, T. L., Rudy, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+catheterization+of+the+spinal+subarachnoid+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space.</a> Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).</li>
<li>Tappe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaffolding+protein+Homer1a+protects+against+chronic+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain.</a> Nat. Med. , 677-681 (2006).</li>
<li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+Cav3.2+T-type+calcium+channel+gene+in+sensory+neurons+demonstrates+its+major+role+in+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception.</a> EMBO J. 24, 315-324 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+dorsal+root+ganglia+by+intrathecal+injection%3A+effects+on+regeneration+of+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves.</a> Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).</li>
<li>Wigdor, S., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+and+systemic+morphine-induced+antinociception+in+mice%3A+contribution+of+descending+serotonergic+and+noradrenergic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

因此，上述描述的鞘内穿刺注射技术具有高效、快速、定位精确且无创的优点。从技术上讲，该操作最关键的环节是穿刺针插入沟槽的位置。实施此操作时必须保持手部极度稳定并具备耐心。与许多外科手术一样，经过训练可提高注射成功的几率。这一点尤为重要，因为在实际实验过程中，该技术无法提供明显的直接指标来确认注射是否成功。唯一可见的正确穿刺指标是观察到作为反射反应的尾巴抽动。
该方法完全保留了鞘内给药相较于其他全身给药途径的优势例如 口服、静脉注射、腹腔注射 等等。），例如脊髓调节的特异性，这使得用药剂量减少并限制了副作用；此外，鞘内注射能够递送通常无法穿过血脑屏障的物质，因为在鞘内注射时，针头被插入硬脑膜与脊髓之间的间隙。然而重要的是，与其他鞘内递送方法相比，鞘内针注射法侵入性最小，可在同一只动物身上进行多次应用，而不会造成明显的组织损伤，也不会因植入外来材料而引发免疫反应。
综上所述，本报告不仅展示了急性鞘内注射的常规逐步操作方法，还提供了一种该技术的改进应用实例，即通过此方法可在活体（in viv...

脊髓是多种关键生物过程和生理功能的重要中枢，包括对伤害性（伤害感受性）传入信号的处理与传导4-7。为实现对脊髓的药理学调控，已发展出多种实验技术，例如鞘内导管的慢性植入8、脊髓微量注射以及鞘内穿刺注射9。每种技术各有优缺点，其适用性取决于具体的实验设计。虽然鞘内导管的慢性植入在大鼠中较易实现，但由于小鼠体型限制，该方法在小鼠中实施极为困难。由于导管在小鼠本就狭窄的硬膜下腔占据较大空间，导致手术成功率极低，并常引发运动功能障碍。此外，慢性植入的导管易发生频繁堵塞，使药物的长期递送难以实现。最后，还常出现免疫反应。
通过采用急性鞘内注射方法可避免上述问题 通过 在没有预先植入导管的情况下，使用一根针即可实现将药物和试剂快速且解剖位置局限地递送至小鼠脊髓。该方法完全保留了鞘内给药相较于其他全身性给药途径的优势例如 口服、静脉注射、腹腔注射 等等。例如脊髓调节的特异性，可降低剂量并限制副作用，以及递送物质的能力&#160;通常不会穿过血脑屏障，因为在鞘内注射时，针头被插入硬脑膜与脊髓之间的间隙。然而重要的是，与其他鞘内给药方法相比，鞘内针注射法侵入性最小，可在同一动物体内进行多次应用，而不会造成明显的组织损伤，也不会因植入外来材料而引发免疫反应。但该方法需要较高的技术技巧，以精确地定位针头位置，从而确保疗效。
本文通过可视化方法演示了精准靶向腰段脊髓以实现最佳成功率的操作步骤。本实验选择在腰椎第5和第6节（L5与L6）椎体之间的沟槽处进行注射，该位置靠近脊髓末端，可最大限度降低脊柱损伤的风险。此外，我们还展示了利用该技术通过siRNA在脊髓中实现基因敲低的方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;体内&lt;/em&gt;-jetPEI</td><td>Polyplus</td><td>201-10G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>WAVE1 siRNA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-36832</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>对照 siRNA-A</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-37007</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗-&amp;szlig;-微管蛋白 III 抗体</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗-WAVE1 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF5514</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>快绿染料</td><td>Sigma</td><td>F-7252</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异氟烷装置</td><td>Dr&amp;auml;ger L&amp;uuml;beck</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>剃毛器</td><td>Wella</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hamilton 耐压注射器 1702</td><td>Hamilton</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>30 G 1/2 英寸 13 mm 针头</td><td>BD Microlance</td><td>304000</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica MS5 显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>用于 qRT-PCR 的 WAVE1 正向引物</td><td>Sigma</td><td></td><td>cacagagcctcaggacagg</td></tr><tr><td>用于 qRT-PCR 的 WAVE1 反向引物</td><td>Sigma</td><td></td><td>cttttcaccaacggcatctt</td></tr><tr><td>FastStart Essential DNA Green Master</td><td>Roche</td><td>6402712001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

在体 内 脊髓中的sirna转染与基因敲低 通过 小鼠快速无创腰椎鞘内注射

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

本报告介绍了一种非侵入性急性鞘内注射的逐步操作技术 即 与导管植入无关。该手术技术的技术局限在于操作者手部的精细程度。注射过程迅速，尤其对于经过训练的实验人员而言；由于该技术对组织的破坏极小，因此可进行多次注射；此外，机体对异源工具的免疫反应（例如导管）不会发生，从而更准确、特异地反映脊髓的调控作用。由于药物主要局限于脊髓靶向区域，无需使用大剂量给药；更重要的是，可避免全身给药时常见的对其他组织的不良影响。1,2此外，我们将该技术与 体内 利用聚乙烯亚胺（PEI）试剂转染核酸3，这为研究脊髓功能提供了极大的灵活性 通过 递送药理学制剂以及基因、RNA 和蛋白质调节剂。

为了展示一次成功的注射，我们采用快绿FCF染料对成年C57Bl6小鼠（8-10周龄）进行了该技术操作。注射后让动物恢复数分钟，以使染料充分扩散，随后通过过量CO2处死动物。接着解剖脊柱并暴露脊髓。可见蓝色斑点对应扩散的染料，标记了注射位点。未观察到脊髓损伤迹象，证实该技术具有微创性（图1A）。染料从注射部位向头侧扩散，仅在注射后数分钟内即到达脊髓胸段区域（图1B）。此外，染料成功注入硬膜外腔可通过脊髓表面被染色而内部未染色得以证实（图1C）。
此外，该技术结合PEI试剂盒，能够实现siRNA对脊髓的高效体内转染。在进行鞘内注射siRNA（每24小时一次，共3次）后，从腰段L3-L5背侧脊髓组织提取物中检测到靶蛋白（此处为WAVE1）的表达水平在蛋白水平降低至约70%（图2A，n = 20），mRNA水平也出现类似下降（图2B，n = 6）。此外，在腹侧脊髓组织提取物中也观察到...

本报告介绍了一种简单快速的鞘内穿刺技术，可在短暂轻度麻醉条件下对小鼠腰段脊髓进行局部siRNA转染。

在体 内 脊髓中的siRNA转染与基因敲低 通过 小鼠快速无创腰椎鞘内注射

本报告介绍了一种非侵入性、无需导管的急性鞘内注射技术的逐步操作指南，即独立于导管的急性鞘内穿刺注射方法……

本实验的总体目标是通过鞘内给药将IRNA局部递送至脊髓。首先需要制备最优的I-R-N-A-P-E-I复合试剂，然后进行小鼠鞘内注射的准备工作。孵育至少15分钟后，将siRNA混合溶液吸入Hamilton注射器中。最后一步是小心地进行鞘内注射，每隔24小时重复注射一次，以确保最佳的基因下调效果。最终进行免疫印迹和实时定量PCR分析。通过PCR检测可显示INA转染后蛋白和mRNA水平的成功下调。该技术的主要优势在于，相较于导管内注射或脊髓注射，其侵入性更小。通常，初次接触该方法的研究人员需要经过训练，以掌握必要的精细操作技能，从而能够通过脊柱椎体间的微小缝隙进行注射，同时避免损伤脊髓。配制SIR溶液时，首先用无菌水稀释所需量的SIR A。然后用移液枪反复吹打，将其进一步用10%葡萄糖溶液稀释。配制PEI溶液时，先用无菌水稀释所需量的PEI试剂，再用移液枪反复吹打，将其进一步用10%葡萄糖溶液稀释。接下来，将Irna溶液一次性加入PEI溶液中，轻轻涡旋混匀，然后将混合溶液在室温下孵育15分钟。在孵育混合溶液的同时，准备进行鞘内注射的小鼠。用3%异氟烷麻醉小鼠后，在尾部基部附近剃除约两平方厘米的毛发，并用酒精清洁注射部位。然后将小鼠置于鼻罩中，以便在操作过程中持续给予异氟烷，并将异氟烷浓度降低至1.5%。使用连接30号半英寸针头的25微升Hamilton注射器，吸取足够量的Irna-PEI溶液，用于注射5至10微升。接下来，找到最明显的棘突，即第六腰椎（L six）。通过轻轻按压第六腰椎上方区域，固定此部位的脊柱，施加适当压力以触及棘突，但避免压陷整个身体。然后使用指甲定位第五腰椎（L five）与第六腰椎（L six）之间的沟槽。现在小心地将针头插入第五腰椎（L5）与第六腰椎（L6）椎间隙的沟槽之间，并观察小鼠是否出现尾部抽动，该反应提示针头已成功进入硬膜内腔。一旦观察到尾部抽动，应立即用一只手小心固定针头位置，同时用另一只手缓慢注入5至10微升（µL）的物质。注射完成后，将小鼠放回笼中，使其从麻醉状态中恢复。每隔24小时重复注射至少两次，以实现靶基因的最佳下调效果。急性鞘内注射快绿染料后，注射部位无明显组织损伤迹象，该部位可通过脊髓的Punta切除处进行标记。注射后数分钟内可见染料向头侧方向扩散。星号标记了注射位点，白色方框标记了腰段区域。在L3至L5节段的脊髓横切面中，可见脊髓表面有特异性染色，但脊髓内部无染色。连续三天通过鞘内注射将靶向WAVE1的siRNA与PEI试剂混合后进行给药，结果显示，与注射乱序siRNA对照组相比，腰段背侧脊髓中WAVE1蛋白表达下调，该结果通过Western印迹和定量逆转录PCR（qRT-PCR）证实。来自腰段L3至L5脊髓腹侧和颈段脊髓裂解液的蛋白质印迹定量结果显示，wave1蛋白的下调程度相似，而脑组织和背根神经节（DRG）

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一种微创方案，用于稳定小鼠脊柱并进行重复性操作 体内...

体内 使用双光子显微镜对小鼠脊髓进行成像

来源：Tadokoro, T.，等。成年小鼠软膜下腺相关病毒9型（AAV9）载体递送。J. Vis. Exp.

小鼠脊髓软膜下基因递送以评估基因表达

来源：Li, D., et al. 成年小鼠中重组腺相关病毒的直接鞘内注射. J. Vis. Exp.

在小鼠模型中通过鞘内递送病毒治疗中枢神经系统疾病

病毒载体可实现靶向基因操作。本文演示一种在小鼠脊髓中进行条件性基因表达或基因剔除的方法，通过立体定位注射将病毒载体注入脊髓背角，此处是初级躯体感觉传入神经与中枢神经系统神经元之间突触联系的重要部位。...

在小鼠脊髓中进行病毒载体的立体定位注射以实现条件性基因操作

本文介绍了一种将基因转移至啮齿类动物坐骨神经施万细胞（SCs）的体内技术。该方法操作简便，适用于研究参与髓鞘化施万细胞发育及维持过程中的信号转导机制。...

体内电穿孔法将基因转移至啮齿类动物坐骨神经施万细胞

通过注射依赖重组酶的重组腺相关病毒（rAAV）可操控脊髓中任意基因标记的细胞类型。本文介绍如何转导腰段脊髓背角中的神经元。该技术可实现对被操控神经元亚型的功能性研究。...

腺相关病毒介导的脊髓遗传学定义神经元中转基因表达

本文介绍了一种使用含1%盐酸利多卡因的病毒溶液进行直接鞘内注射的技术，以确保腺相关病毒高效递送至小型动物，并建立了一种评分系统，可根据利多卡因引起的短暂性肌力减弱程度来预测中枢神经系统中的转导效率。...

成年小鼠脑脊液内直接注射重组腺相关病毒

本文介绍了一种通过将导管植入大鼠脊柱腰段鞘内空间，向其中枢神经系统递送药物的方法。我们重点阐述反义寡核苷酸的递送，但该方法同样适用于其他治疗方式的给药。...

大鼠中枢神经系统中反义寡核苷酸的鞘内递送

本文描述了一种对幼年大鼠腰池进行注射的外科手术方法。该方法已用于基因治疗载体的鞘内递送，但预计也可适用于多种其他治疗剂，包括细胞和药物。...

通过腰池注射在幼年大鼠中进行鞘内载体递送

腰椎鞘内注射是一种具有转化相关性的给药途径，可用于将基因治疗递送至中枢神经系统。本标准化操作方案全面涵盖了新生期、幼年期及成年小鼠和大鼠的腰椎鞘内注射技术，旨在指导研究人员在临床前基因治疗研究中采用该技术。...

小鼠和大鼠中枢神经系统靶向基因治疗载体的腰椎鞘内注射

本文详细介绍了针对成年小鼠中枢神经系统的鞘内给药方法，重点在于操作步骤的精确性以及实现重复给药的可能性。文中包含一项验证性研究的结果，显示反义寡核苷酸可降低SOD1-ALS模型小鼠中突变SOD1的表达水平，证明该方法在神经退行性疾病临床前研究中的应用价值。...

向人源 SOD1-G93A ALS 小鼠腰椎鞘内注射 SOD1-ASO 实现中枢神经系统精准靶向及可预测疗效

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