利用Gibson组装和基因枪在烟草中进行瞬时基因表达 关键词：瞬时表达，烟草，Gibson组装，基因枪，植物转化，分子克隆，重组DNA技术

以下实验的总体目标是观察绿色荧光蛋白标记的报告基因在烟草叶片表皮细胞中的瞬时表达。首先设计一种可在叶绿体和过氧化物酶体中表达的DNA构建体，然后通过PCR扩增和吉布森组装技术构建该载体。

接下来，使用基因枪将构建物递送至烟草叶片表皮细胞。最终，通过共聚焦显微镜对烟草叶片进行成像，可观察到叶绿体和过氧化物酶体中的GFP表达。与传统克隆等现有方法相比，该技术的主要优势在于无需使用限制性内切酶，因此任何可通过PCR扩增的序列均可进行克隆。

由于遗传设计具有灵活性，这些技术的应用可扩展到更大范围。对农作物进行基因工程改造时，首先应确定目标蛋白在植物细胞内的最终表达位点。本研究的目标是将表达定位于叶绿体、过氧化物酶体和细胞质。

接下来，设计表达载体。该载体必须在单个质粒中包含启动子、可检测基因和终止子。在此实例中，组成型启动子PendCup2驱动GFP的表达，其后紧跟Nolen合成酶终止子（nos t）。

请注意，在本实验中，我们将测试一系列标签——Trit 标签一、二和三——这些标签表达于 GFP 的末端，用于在叶绿体和过氧化物酶体中进行表达。Gibson 组装方法依赖于预混液中多种酶的作用，对双链 DNA 的末端进行部分消化，并促进相邻 DNA 序列互补碱基对的退火。最终构建体包含三个部分，需在 Gibson 组装前通过四轮 PCR 反应进行扩增。

第一和第二步反应扩增一个 8,000 个碱基对的质粒载体 PORE，该载体包含 GFP NOS T 和一个卡那霉素抗性标记。该抗性标记是将这段大片段 DNA 分割为两个较小模板的理想位点，以便更高效地进行 PCR 扩增。第三步反应扩增启动子 P end cup two，第四步反应则使用计算机辅助设计软件（如 Ape Design）对 triag one 进行扩增，通过逐个碱基设计构建序列，使各片段之间具有 50 个碱基对的重叠区域。

进行PCR引物订购时，可利用50个碱基对的重叠区域作为引物，每个方向各25个碱基对。完成PCR以扩增各个组分后，需分别纯化PCR产物，并用去离子蒸馏水稀释。若PCR模板为大肠杆菌的质粒小提产物，且经过限制性内切酶DPN处理，则可去除污染性的模板DNA。接下来，测定各DNA片段的浓度。

将每种待组装的构建体（包括对照）的载体浓度调整至约150纳克/微升，从冷冻箱中取出15微升Gibson组装混合液，并置于冰上解冻。使用在线开源工具@gibbon.org，确定各片段等摩尔量所需的体积。

将每种片段的计算体积加入到15微升Gibson反应混合液中。同时准备仅含载体DNA的对照。每个反应的总体积应为20微升。

如有需要，用水调节体积。将离心管置于 50 至 55 摄氏度下孵育 30 至 60 分钟。孵育结束后，将离心管放回冰上。

从–80 °C冰箱中取出含有200 µL商业化制备的氯化钙感受态大肠杆菌的微量离心管，用手轻微 warming。然后将全部20 µL反应产物加入大肠杆菌中。将菌液置于冰上孵育30分钟，随后转移至42 °C水浴中热激60秒。

请勿使用电转感受态细胞。相对较高的盐浓度和较低的DNA浓度可能导致细胞在转化后发生电弧现象。转化后，将菌液置于冰上孵育两分钟，然后加入750微升SOC或LB培养基，在37摄氏度下恢复培养30分钟。

下一步，将混合物接种到含有卡那霉素或其他适当抗生素的LB平板上，于37摄氏度过夜培养，通过测序筛选10个菌落。需要注意的是，与传统的基于连接的克隆方法相比，该方法可能导致较高的背景值以及更多的非靶向重组事件。利用基因枪对烟草进行生物弹击转化的方法此前已在JoVE中报道过。

本文回顾了先前实验方案中的关键步骤和差异。在扩增并分离构建体后，按照 JoVE 文章中 Woods 和 Zeto 所述的方法制备基因枪微弹，并将其装入基因枪中，用于转染 Nico Tania Benham Miana 烟草叶片表皮组织。选择一株三至五个月大植株基部附近较大的叶片。

在15厘米的培养皿中，将叶片底面朝上小心放置于湿润的纸巾上，并佩戴适当的眼部和耳部防护装备。将基因枪的氦气压力设置为200至250 PSI。将基因枪对准叶片底面叶脉之间，距离叶片约3至5厘米处，仔细瞄准。解除安全装置，将微粒递送至叶片。

在同一叶片位置使用每个子弹两次。若叶片破裂，则更换位置并重复此过程，丢弃已损坏的叶片，另取一片新叶片。由于生长条件（如叶片年龄、湿度等因素）不同，叶片的坚韧程度存在一定差异。

所有注射完成后，将叶片覆盖，并在实验台上弱光条件下放置两到三天。使用配备紫外荧光装置的体视显微镜观察叶片，寻找表达GFP的单个细胞。一旦发现表达GFP的细胞，用解剖剪小心地切取5至10毫米长的叶片片段。

立即将每一片叶组织碎片浸入深孔载玻片孔中，孔内含有约 200 µL 的 0.1% Triton X-100 溶液。该去垢剂有助于防止表面产生气泡，而深孔载玻片则可提供更大的组织成像区域，便于使用配备适当滤光片和 40 倍水浸物镜的共聚焦显微镜观察细胞。在本研究中，将三种不同的 GFP 细胞器靶向构建体与未标记的 GFP 以及 rubis.Coag 进行了比较。

在对照实验中，通过GFP共聚焦显微镜检测瞬时转化单细胞中的GFP荧光，其中表达的是无标签的GFP。荧光仅出现在细胞核和细胞质中，而不出现在叶绿体中；叶绿体可通过叶绿素的红色自发荧光来识别，如本例中转染了仅靶向叶绿体的RubisOag-GFP构建体的细胞所示。GFP在大型细胞器中表达。

细胞以白色轮廓标出。黄色表示该表达构建体与叶绿素共定位的区域，表明该构建体靶向叶绿体。在此转染了 triag one 的细胞图像中，可见绿色荧光蛋白（GFP）在叶绿体、周边区域、细胞质以及一些被认为是过氧化物酶体的小点状细胞器中表达。同样，转染了 triag two 的细胞也在叶绿体、细胞质和过氧化物酶体中表达 GFP。而 triag three 由嵌在叶绿体序列低复杂度区域内的过氧化物酶体信号组成，其定位仅限于叶绿体和过氧化物酶体。

请注意，该细胞位于不同的叶片层次中。此图总结了在典型的烟草叶片表皮细胞各区室中观察到的表达情况。图中展示了细胞内各结构的相对大小和位置，以及通过基因枪转染和共聚焦显微镜观察到的相对表达水平。

请注意，未标记的GFP定位于细胞质和细胞核，PIMT二GFP对照定位于叶绿体，而triag一GFP、triag二GFP以及Triag 3G FP如预期般定位于叶绿体和过氧化物酶体。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用Gibson组装法构建质粒，通过基因枪法将其递送至烟草叶片，并在三天内观察GFP的表达。在进行该实验时，需特别注意在Gibson组装反应中使用150 纳克/微升的载体DNA，以及在制备基因枪微弹时使用1500 纳克/微升的最终DNA构建体。在完成该实验流程后，还可采用农杆菌转染等其他方法，以实现基因的稳定表达而非瞬时表达。