Name: 使用吉布森大会和基因枪烟草中瞬时基因表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学习使用吉布森组装和基因枪技术在烟草叶片表皮细胞中实现瞬时基因表达的方法。该技术无需限制性内切酶，可靶向叶绿体和过氧化物酶体进行蛋白定位研究。

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作者谨此感谢马萨诸塞州总医院的Jen Sheen慷慨捐赠了Nicotiana benthamiana幼苗。Jen Bush在植物培养及生长室区域设置方面为我们提供了极大的建议与帮助。Wyss研究所的Tom Ferrante在共聚焦显微镜使用方面提供了关键支持。作者尤其要感谢波士顿儿童医院及Wyss研究所的Don Ingber慷慨捐赠了基因枪及相关耗材。本项目经费由美国能源部高级研究计划署（ARPA-E Award # DE-000079）通过合作协定为PAS、JCW和MdM提供，以及由Chimerion Biotechnology, Inc.为MJV提供资助。

1. 用于多个细胞器靶向的可变剪接序列的设计
<ol>
	<li>确定目标蛋白的最终表达位点。本研究旨在将蛋白靶向至叶绿体、过氧化物酶体和细胞质。</li>
	<li>查阅文献，筛选已知可将蛋白靶向至目标细胞器的蛋白和DNA序列。本研究中选用的序列包括：来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）L-异天冬氨酸甲基转移酶的叶绿体靶向序列6,15，以及来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）转甲状腺素蛋白样S-尿囊素合酶的过氧化物酶体靶向序列16,17。</li>
	<li>设计一种可变剪接策略，以确保目标蛋白被正确靶向至相应细胞器。本研究采用在天然拟南芥（Arabidopsis）系统中观察到的剪接位点6，对mRNA序列进行重新设计，在保留天然剪接位点的基础上，将编码叶绿体或过氧化物酶体靶向标签的序列插入到可变剪接的内含子中（图1）。</li>
</ol>
2.&#160;DNA片段的Gibson组装
另见图2。
Gibson 组装法依赖于预混液中的多种酶发挥作用，其作用包括：1）部分消化双链 DNA 的末端以产生单链，以及 2）使相邻 DNA 片段的互补碱基配对并退火。该方法可实现 DNA 片段的克隆，且不受限制性酶切位点的限制。
<ol>
	<li>选择DNA质粒构建体中各元件的排列顺序。以TriTag-1为例，其包含以下元件：a) 质粒载体（pORE，含有在植物中已知可表达的GFP构建体、卡那霉素抗性标记以及用于大肠杆菌和农杆菌的复制起点） E. coli 和 根癌农杆菌 宿主）、b）启动子序列（PENTCUP2，已在植物中被证明为组成型表达），c）叶绿体靶向序列（CTS），c）过氧化物酶体靶向序列（PTS），以及d）如前所述的一系列剪接位点6.</li>
	<li>逐碱基设计构建体 计算机模拟 设计软件。ApE 是一款适用于此项工作的开源免费软件包。 
	注意：TriTag-1 的顺序为：质粒载体、启动子、ATG、剪接供体位点、叶绿体靶向序列、剪接供体位点、中性位点、剪接受体位点、过氧化物酶体靶向序列、剪接受体位点、GFP，以上均包含于质粒载体中。
	<ol>
		<li>设计 计算机模拟 DNA 重组构建时，设计 PCR 引物使每段片段之间具有 50 bp 的重叠区域。可直接将 50 bp 的重叠序列用作引物，正向和反向各 25 bp。
		<ol>
			<li>务必记录每段序列片段的来源：它是需要培养并进行质粒小提的质粒；可用作PCR模板的线性序列；还是需要通过商业途径合成的序列？多家公司提供低成本的DNA片段合成服务 &#60;500 bp。在这种情况下，TriTag 本身为 437 bp，因此直接商业订购更为有利。</li>
			<li>若将所有片段通过PCR扩增并从其模板DNA中纯化出来，将获得最佳结果。将抗性标记作为切割位点，可将这段较大的DNA分为两个较小的模板，更易于进行PCR扩增。</li>
			<li>限制性内切酶 DpnI 可切割甲基化的 DNA。&#160; 如果PCR模板来自质粒小量抽提产物 大肠杆菌， DpnI 处理将去除污染的模板 DNA。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所有DNA序列分别纯化，并洗脱于水、TE或Buffer EB中。
	<ol>
		<li>pORE 载体部分 1，约 3,000 bp（绿色箭头）。经 PCR 扩增并用 DpnI 处理。</li>
		<li>pORE 载体第二部分，约 3,000 bp（黑色箭头）。经 PCR 扩增并用 DpnI 处理。</li>
		<li>TriTag 插入片段，437 bp（蓝色箭头）。商业订购。用 ddH₂O 重悬。2O.</li>
		<li>PENTCUP 启动子，约750 bp（橙色箭头）。经PCR扩增并用DpnI处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定每种DNA片段的浓度，载体片段的浓度应达到150 ng/μl。</li>
	<li>从冷冻保存的吉布森组装混合物中取出一份 aliquot，在冰上解冻。该混合物可商业购买，也可在实验室中简单制备。12–14.
	<ol>
		<li>该配方包含两个步骤：制备黏稠的5倍浓缩母液，以及分装成每份15 μl、浓度为1.33倍的反应液。5倍浓缩母液的组成为：3 ml 1 M Tris-HCl（pH 7.5）、300 μl 1 M MgCl₂2，600 μl 10 mM 的每种 dNTP，300 μl 1 M DTT，1.5 g PEG-8000，20 mg NAD，以及 ddH₂O20 到 6 ml。分装成每份 320 μl (18)，除一份外其余均于 -20 °C 冻存。该溶液将非常黏稠。标记为“5X 等温缓冲液”</li>
		<li>向剩余的320 μl体系中加入1.2 μl T5 Exonuclease、20 μl Phusion High-Fidelity DNA Polymerase、160 μl Taq DNA Ligase和700 μl ddH₂O2O. 在 PCR 管中冰上分装 15 μl 等份样本（约 80 份），并于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定各片段等摩尔数所需的体积。可使用一些在线计算器，如 Gibthon.org。所有DNA片段总体积应为5 μl。将它们加入15 μl的Gibson反应混合物分装液中。如果所需体积过小难以移液，可稀释DNA片段和/或使用多份分装液。
	<ol>
		<li>不要忘记单独准备载体DNA的对照（例如 含有抗生素抗性标记的DNA片段，并用水补足体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将试管置于热循环仪中，在 50–55 °C 下孵育 30–60 分钟。孵育后放回冰上冷却，随后进行转化 E. coli 通过热激化学感受态细胞进行转化。请勿使用电转感受态细胞，因为高盐浓度和相对较低的DNA浓度可能导致细胞在电击时产生电弧。
	<ol>
		<li>将全部20 μl加入200 μl市售氯化钙感受态细胞中 E. coli. 
		冰上孵育30分钟，42 °C热激60秒</li>
		<li>冰浴2分钟，加入750 μl SOC或LB培养基，于37 °C在微型离心管中振荡复苏30分钟。将混合物及适当稀释液涂布于含卡那霉素的LB平板（或其它适当抗生素）。与传统的基于连接的克隆方法相比，此方法可能导致较高的背景菌落数（以及更多的非靶向重组事件），但值得筛选约10个菌落进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过测序确认克隆，并将一份等份试样于 -80 °C 保存</li>
</ol>
3.&#160;利用基因枪对烟草进行基因枪轰击转染
该技术已在 JoVE 中建立18,19。关键步骤和差异如下所述。
<ol>
	<li>培养 50–100 ml 大肠杆菌（E. coli）或 200 ml 农杆菌（Agrobacterium），进行大提纯化。继续实验所需的质粒浓度约为 1,500 ng/μl。</li>
	<li>按先前所述方法制备基因枪微弹，并将其装入基因枪中。</li>
	<li>为转染本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片表皮组织，选择一株三个月大植株基部附近较大的叶片。小心剪下叶片，并将其背面朝上放置于直径 15 cm 培养皿内湿润的纸巾上。</li>
	<li>将基因枪的氦气压力设定为 200–250 psi。</li>
	<li>小心将基因枪对准叶片背面叶脉之间的区域，距离叶片约 3–5 cm。解除安全装置，将微弹轰击至叶片表面。每颗微弹可在同一叶片位置使用两次。若叶片破裂，应弃去并更换新叶片——叶片坚韧程度因生长条件（如植株年龄、湿度等）存在差异。对于直径 12 cm 的叶片，预计可进行约 6 次轰击。</li>
	<li>将轰击后的叶片盖上培养皿盖，在室温低光照条件下放置 2–3 天。</li>
	<li>在配备紫外荧光装置的解剖显微镜下观察叶片，寻找表达绿色荧光蛋白（GFP）的单个细胞，并切取 5–10 mm 的叶段。</li>
	<li>将叶段浸入深孔载玻片的 ~200 μl 0.1% Triton X-100 溶液中。该去垢剂有助于防止液体表面产生气泡，而深孔载玻片则可提供更大的组织成像区域。</li>
</ol>
4. 转染组织的共聚焦显微镜观察
不同仪器的操作说明各不相同，因此接受正规培训至关重要。
<ol>
	<li>进行荧光检测实验时，将激发激光设置为 489 nm，并将光电倍增检测器设置为 500–569 nm 以检测 GFP 荧光，设置为 630–700 nm 以检测叶绿素自发荧光。使用 40 倍水浸物镜对细胞进行成像。</li>
</ol>

<ol><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trait+stacking+in+transgenic+crops%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22GM+crops%22%5BJournal%5D)">Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities.</a> GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).</li>
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<li>Hickey, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene+regulation+in+plants+by+alternative+splicing+of+a+suicide+exon%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).</li>
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<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li>
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<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl%2FD-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li>
<li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+a+camel+through+the+eye+of+a+needle%3A+the+import+of+folded+proteins+by+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).</li>
<li>Reumann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Arabidopsis+leaf+peroxisomes+reveals+novel+targeting+peptides%2C+metabolic+pathways%2C+and+defense+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms.</a> The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+Fluorescence+Complementation+%28BiFC%29+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li>
<li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究描述了在植物中将单个转基因蛋白定位到多个细胞区室的简单策略。目标是设计一种能在Nicotiana benthamiana中多个细胞器内表达同一基因的载体。所采用的策略包括基于GFP的DNA载体的合理设计、吉布森组装（Gibson assembly）、利用基因枪将质粒递送至叶片细胞，以及通过共聚焦显微镜观察实验结果。
设计了三种不同的短N端标签，用于同时靶向叶绿体、过氧化物酶体和细胞质11这些“TriTags”是通过组合自然界中存在的编码选择性剪接mRNA的DNA设计而成，这些mRNA可引导其编码的蛋白质靶向叶绿体及细胞质6 或过氧化物酶体加细胞质17TriTag-3 不依赖于选择性剪接，其包含一个叶绿体靶向序列，该序列中天然无结构区域已被过氧化物酶体靶向序列取代15,17. TriTags 的功能 体内 靶向GFP Nicotiana benthamiana 叶表皮细胞（图5).
<p clas...

本研究是一项代谢工程/合成生物学项目，通过单个DNA构建体，使植物细胞在多个细胞器中表达报告蛋白。
将蛋白质靶向多个位置的一种方法是克隆多个基因拷贝，每个拷贝包含不同的定位肽。每个拷贝必须通过连续的重复转化引入，或者 alternatively，通过单个转化子的回交实现1。这种方法需要额外的克隆步骤，并且每个末端只能连接一个定位标签，因而存在局限性。
另一种使蛋白质定位于多个位置的方法是通过选择性剪接2–5。RNA从单个基因转录而来，但转录本的不同拷贝在细胞内可能以多种方式被差异性加工。这可能导致细胞中由同一基因产生多种信使RNA。这些不同的信使RNA可编码同一蛋白质的不同亚型，或在发生阅读框移位的情况下，编码完全不同的蛋白质。尽管选择性剪接已在文献中被描述多年，但其作用机制以及保守的供体和受体剪接位点直到最近才逐渐被阐明6。随着这些剪接位点的特征被更清晰地解析，也为相关工程化操作带来了新的机遇。
植物代谢工程领域在将蛋白表达于多个细胞器时面临一项挑战。当需要将一种蛋白靶向定位至多个细胞器时，研究人员必须对同一基因进行多次克隆，每次均需连接不同的信号序列，以引导其进入目标细胞器。对于一个需靶向三个细胞器的单个基因，这相当于需要构建三个基因；而对于一个包含六个基因的代谢通路，则需要构建多达18个基因，克隆工作量显著增加。将多个定位序列整合到一个可选择性剪接的单一基因中，可显著减少这一工作量。例如，对光呼吸7,8和类异戊二烯合成9,10途径的重新设计均涉及叶绿体和过氧化物酶体。在本研究中，我们利用了先前报道的天然Arabidopsis thaliana系统中存在的剪接位点6。我们基于理性设计改造了mRNA序列，在保留天然剪接位点不变的前提下，将编码叶绿体或过氧化物酶体靶向标签的序列插入到可变剪接的内含子中（图1）。最终表达的蛋白是否带有标签，取决于编码该蛋白的前体mRNA是否将相应内含子切除（图1g和图1h）。有关本研究中所用构建体设计的更多细节，请参见配套文章11。
由于这仍然是一个重要的克隆工作，因此在构建过程中采用了吉布森组装（Gibson assembly）这一新型DNA构建克隆方法。吉布森方法可用于任意序列的克隆，不受限制性酶切位点的限制（图2）12–14。该方法利用特定的酶混合物，实现一步法、等温条件下的DNA片段组装。在此方法中，设计多个双链线性DNA片段，使其具有约50 bp的重叠序列。吉布森组装酶混合物对线性DNA片段进行部分消化，暴露出同源的单链区域。这些部分单链序列在反应体系中重新退火，从而实现快速、一步完成、无需连接酶、且不受序列限制的亚克隆反应。
本研究描述了：1）针对植物叶绿体、过氧化物酶体和细胞质中表达的可变剪接结构的合理设计；2）利用无需连接的吉布森组装新方法进行克隆；3）通过基因枪将构建体递送至烟草叶片细胞；以及 4）通过绿色荧光蛋白（GFP）和共聚焦显微镜观察到的细胞器靶向结果。

<table><tbody><tr><td>寡核苷酸引物</td><td>IDT</td><td>(custom)</td><td>为特定载体构建设计</td></tr><tr><td>GeneBlocks</td><td>IDT</td><td>(custom)</td><td>500 bp 的寡核苷酸</td></tr><tr><td>ApE 软件</td><td>犹他大学</td><td>(download)</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td></tr><tr><td>MinElute 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>用于纯化 PCR 产物</td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>用于制备适合克隆的质粒 DNA 量</td></tr><tr><td>含 GC Buffer 的 Phusion Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0532S</td><td>用于 PCR 扩增目标基因</td></tr><tr><td>Gibson 组装反应混合液</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>包含以下 9 种组分的预混液</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td><td>Teknova</td><td>T1075</td><td>Gibson 组装混合液组分</td></tr><tr><td>1 M MgCl₂</td><td>G Biosciences</td><td>82023-086</td><td>Gibson 组装混合液组分</td></tr><tr><td>dNTP 混合液</td><td>Fermentas</td><td>R0192</td><td>Gibson 组装混合液组分</td></tr><tr><td>1 M DTT</td><td>Fermentas</td><td>R0861</td><td>Gibson 组装混合液组分</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Affymetrix</td><td>19966</td><td>Gibson 组装混合液组分</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Applichem</td><td>A1124,0005</td><td>Gibson 组装混合液组分</td></tr><tr><td>T5 核酸外切酶</td><td>Epicentre</td><td>T5E4111K</td><td>Gibson 组装混合液组分</td></tr><tr><td>Phusion 聚合酶</td><td>NEB</td><td>F530S</td><td>Gibson 组装混合液组分</td></tr><tr><td>Taq DNA 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0208L</td><td>Gibson 组装混合液组分</td></tr><tr><td>Gibthon.org</td><td></td><td></td><td>用于简化计算的网站</td></tr><tr><td>Plasmid PLUS Maxi 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td>用于制备基因枪弹粒所需的 DNA</td></tr><tr><td>基因枪系统</td><td>BioRad</td><td>165-2451</td><td>包含所有必要组件</td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>(n/a)</td><td>(n/a)</td><td>由 MGH 的 Jen Sheen 惠赠</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>SP5 X MP</td><td>用于观察最终细胞成像</td></tr><tr><td>深孔载玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71561-01</td><td>用于共聚焦成像</td></tr><tr><td>A Plasmid Editor (ApE)</td><td>University of Utah</td><td></td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td></tr><tr><td>Gibthon：连接计算器</td><td></td><td></td><td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td></tr></tbody></table>

利用gibson组装和基因枪在烟草中进行瞬时基因表达

关键词：瞬时表达，烟草，gibson组装，基因枪，植物转化，分子克隆，重组dna技术

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

为了将单一蛋白质靶向多个亚细胞器，植物通常会复制相关基因，并利用包括不同启动子和/或信号序列在内的复杂调控策略分别表达每个基因。对于希望将酶靶向特定细胞器的代谢工程和合成生物学研究人员而言，面临一个挑战：若一种蛋白质需要定位到多个细胞器，研究人员必须多次克隆同一基因。本研究提出了一种解决方案：利用mRNA的可变剪接技术。该技术借助已知的叶绿体和过氧化物酶体靶向序列，将其整合到一条可发生可变剪接的mRNA中。部分剪接变体被运送至叶绿体，部分至过氧化物酶体，另一部分则留在细胞质中。本文设计了基于可变剪接的多细胞器靶向系统。在此研究中，通过一系列合理设计的5’端mRNA标签，预期实现GFP在叶绿体、细胞质和过氧化物酶体中的表达。这些标签有望在异源基因需要在多个亚细胞器中表达时，减少所需的克隆工作量。这些载体在前期研究中已设计完成11，并采用吉布森组装（Gibson assembly）方法进行克隆，该方法是一种无需限制性内切酶的连接无关克隆技术。所得质粒通过改良的基因枪法导入本氏烟草（Nicotiana benthamiana）表皮叶片细胞中。最后，利用共聚焦显微镜观察转化后的叶片。

该设计工作源于周密的规划。本项目的新颖之处在于利用可变剪接产生一种前体mRNA，该mRNA可翻译出差异表达的蛋白质。这些蛋白质在不同的细胞器中表达，具体包括叶绿体、过氧化物酶体和/或细胞质。我们改造了一种天然可变剪接的Arabidopsis基因6，并将已知的叶绿体6和过氧化物酶体17靶向序列分别置于不同的外显子中（TriTag-1 和 TriTag-2）。TriTag-3 则由嵌入叶绿体序列低复杂度区域内的过氧化物酶体信号构成。这些序列均与GFP保持正确的阅读框连接（图1）。
本研究中使用的质粒包含多个元件：PIMT2 基因的天然选择性剪接调控序列6、叶绿体和过氧化物酶体靶向序列、GFP 以及质粒骨架。由于每个元件均具有非常特定的必需序列，因此需要采用序列无关的克隆方法。吉布森组装（Gibson assembly）方案12,13可用于任意序列的拼接，前提是各组分部分设计为彼此之间具有序列同源性，且不含重复...

本研究介绍了一种利用BioRad基因枪检测的植物亚细胞器选择性靶向新方法。

利用Gibson组装和基因枪在烟草中进行瞬时基因表达

关键词：瞬时表达，烟草，Gibson组装，基因枪，植物转化，分子克隆，重组DNA技术

为了将单一蛋白质靶向多个亚细胞器，植物通常会复制相关基因，并分别表达每个基因……

以下实验的总体目标是观察绿色荧光蛋白标记的报告基因在烟草叶片表皮细胞中的瞬时表达。首先设计一种可在叶绿体和过氧化物酶体中表达的DNA构建体，然后通过PCR扩增和吉布森组装技术构建该载体。接下来，使用基因枪将构建物递送至烟草叶片表皮细胞。最终，通过共聚焦显微镜对烟草叶片进行成像，可观察到叶绿体和过氧化物酶体中的GFP表达。与传统克隆等现有方法相比，该技术的主要优势在于无需使用限制性内切酶，因此任何可通过PCR扩增的序列均可进行克隆。由于遗传设计具有灵活性，这些技术的应用可扩展到更大范围。对农作物进行基因工程改造时，首先应确定目标蛋白在植物细胞内的最终表达位点。本研究的目标是将表达定位于叶绿体、过氧化物酶体和细胞质。接下来，设计表达载体。该载体必须在单个质粒中包含启动子、可检测基因和终止子。在此实例中，组成型启动子PendCup2驱动GFP的表达，其后紧跟Nolen合成酶终止子（nos t）。请注意，在本实验中，我们将测试一系列标签——Trit 标签一、二和三——这些标签表达于 GFP 的末端，用于在叶绿体和过氧化物酶体中进行表达。Gibson 组装方法依赖于预混液中多种酶的作用，对双链 DNA 的末端进行部分消化，并促进相邻 DNA 序列互补碱基对的退火。最终构建体包含三个部分，需在 Gibson 组装前通过四轮 PCR 反应进行扩增。第一和第二步反应扩增一个 8,000 个碱基对的质粒载体 PORE，该载体包含 GFP NOS T 和一个卡那霉素抗性标记。该抗性标记是将这段大片段 DNA 分割为两个较小模板的理想位点，以便更高效地进行 PCR 扩增。第三步反应扩增启动子 P end cup two，第四步反应则使用计算机辅助设计软件（如 Ape Design）对 triag one 进行扩增，通过逐个碱基设计构建序列，使各片段之间具有 50 个碱基对的重叠区域。进行PCR引物订购时，可利用50个碱基对的重叠区域作为引物，每个方向各25个碱基对。完成PCR以扩增各个组分后，需分别纯化PCR产物，并用去离子蒸馏水稀释。若PCR模板为大肠杆菌的质粒小提产物，且经过限制性内切酶DPN处理，则可去除污染性的模板DNA。接下来，测定各DNA片段的浓度。将每种待组装的构建体（包括对照）的载体浓度调整至约150纳克/微升，从冷冻箱中取出15微升Gibson组装混合液，并置于冰上解冻。使用在线开源工具@gibbon.org，确定各片段等摩尔量所需的体积。将每种片段的计算体积加入到15微升Gibson反应混合液中。同时准备仅含载体DNA的对照。每个反应的总体积应为20微升。如有需要，用水调节体积。将离心管置于 50 至 55 摄氏度下孵育 30 至 60 分钟。孵育结束后，将离心管放回冰上。从–80 °C冰箱中取出含有200 µL商业化制备的氯化钙感受态大肠杆菌的微量离心管，用手轻微 warming。然后将全部20 µL反应产物加入大肠杆菌中。将菌液置于冰上孵育30分钟，随后转移至42 °C水浴中热激60秒。请勿使用电转感受态细胞。相对较高的盐浓度和较低的DNA浓度可能导致细胞在转化后发生电弧现象。转化后，将菌液置于冰上孵育两分钟，然后加入750微升SOC或LB培养基，在37摄氏度下恢复培养30分钟。下一步，将混合物接种到含有卡那霉素或其他适当抗生素的LB平板上，于37摄氏度过夜培养，通过测序筛选10个菌落。需要注意的是，与传统的基于连接的克隆方法相比，该方法可能导致较高的背景值以及更多的非靶向重组事件。利用基因枪对烟草进行生物弹击转化的方法此前已在JoVE中报道过。本文回顾了先前实验方案中的关键步骤和差异。在扩增并分离构建体后，按照 JoVE 文章中 Woods 和 Zeto 所述的方法制备基因枪微弹，并将其装入基因枪中，用于转染 Nico Tania Benham Miana 烟草叶片表皮组织。选择一株三至五个月大植株基部附近较大的叶片。在15厘米的培养皿中，将叶片底面朝上小心放置于湿润的纸巾上，并佩戴适当的眼部和耳部防护装备。将基因枪的氦气压力设置为200至250 PSI。将基因枪对准叶片底面叶脉之间，距离叶片约3至5厘米处，仔细瞄准。解除安全装置，将微粒递送至叶片。在同一叶片位置使用每个子弹两次。若叶片破裂，则更换位置并重复此过程，丢弃已损坏的叶片，另取一片新叶片。由于生长条件（如叶片年龄、湿度等因素）不同，叶片的坚韧程度存在一定差异。所有注射完成后，将叶片覆盖，并在实验台上弱光条件下放置两到三天。使用配备紫外荧光装置的体视显微镜观察叶片，寻找表达GFP的单个细胞。一旦发现表达GFP的细胞，用解剖剪小心地切取5至10毫米长的叶片片段。立即将每一片叶组织碎片浸入深孔载玻片孔中，孔内含有约 200 µL 的 0.1% Triton X-100 溶液。该去垢剂有助于防止表面产生气泡，而深孔载玻片则可提供更大的组织成像区域，便于使用配备适当滤光片和 40 倍水浸物镜的共聚焦显微镜观察细胞。在本研究中，将三种不同的 GFP 细胞器靶向构建体与未标记的 GFP 以及 rubis.Coag 进行了比较。在对照实验中，通过GFP共聚焦显微镜检测瞬时转化单细胞中的GFP荧光，其中表达的是无标签的GFP。荧光仅出现在细胞核和细胞质中，而不出现在叶绿体中；叶绿体可通过叶绿素的红色自发荧光来识别，如本例中转染了仅靶向叶绿体的RubisOag-GFP构建体的细胞所示。GFP在大型细胞器中表达。细胞以白色轮廓标出。黄色表示该表达构建体与叶绿素共定位的区域，表明该构建体靶向叶绿体。在此转染了 triag one 的细胞图像中，可见绿色荧光蛋白（GFP）在叶绿体、周边区域、细胞质以及一些被认为是过氧化物酶体的小点状细胞器中表达。同样，转染了 triag two 的细胞也在叶绿体、细胞质和过氧化物酶体中表达 GFP。而 triag three 由嵌在叶绿体序列低复杂度区域内的过氧化物酶体信号组成，其定位仅限于叶绿体和过氧化物酶体。请注意，该细胞位于不同的叶片层次中。此图总结了在典型的烟草叶片表皮细胞各区室中观察到的表达情况。图中展示了细胞内各结构的相对大小和位置，以及通过基因枪转染和共聚焦显微镜观察到的相对表达水平。请注意，未标记的GFP定位于细胞质和细胞核，PIMT二GFP对照定位于叶绿体，而triag一GFP、triag二GFP以及Triag 3G FP如预期般定位于叶绿体和过氧化物酶体。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用Gibson组装法构建质粒，通过基因枪法将其递送至烟草叶片，并在三天内观察GFP的表达。在进行该实验时，需特别注意在Gibson组装反应中使用150 纳克/微升的载体DNA，以及在制备基因枪微弹时使用1500 纳克/微升的最终DNA构建体。在完成该实验流程后，还可采用农杆菌转染等其他方法，以实现基因的稳定表达而非瞬时表达。

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科研

JoVE Journal

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环境

使用吉布森大会和基因枪烟草中瞬时基因表达

病毒诱导的基因沉默（VIGS）在Nicotiana benthamiana和番茄中的应用

植物提供了一种新颖的系统，可用于大规模商业化生产药用蛋白，相较于现有的表达模式，该系统更具可扩展性、成本效益更高且更安全。在本研究中，我们报道了一种简单便捷且可扩展的方法，将含有目的基因的根癌农杆菌（Agrobacterium...

高效农杆菌浸润法实现植物中重组蛋白的高水平瞬时表达

病毒诱导的基因沉默是鉴定植物非寄主抗性相关基因的有效工具。我们展示了利用表达 GFPuv...

通过VIGS介导的正向遗传学筛选鉴定参与非寄主抗性的基因

瞬时蛋白表达在 烟草属 基于真空渗透的植物 农杆菌...

农杆菌介导的烟草属植物瞬时蛋白表达的优化与应用

我们介绍一种实验设计方法，可用于确定并建模转基因调控元件、植物生长与发育参数以及培养条件对植物中单克隆抗体和报告蛋白瞬时表达的影响。...

利用实验设计方法表征复杂系统：以烟草中瞬时蛋白表达为例

利用瞬时表达系统，以烟草植物生产了一种真菌纤维素酶...

在烟草植物中表达来自Trichoderma reesei的重组纤维素酶Cel5A

定制质粒的合成过程费时费力。本实验方案描述了使用吉布森组装克隆技术来减少定制DNA克隆所需的工作量和时间。该方案还能以与传统“剪切-粘贴”DNA克隆相似的成本，获得可靠的用于哺乳动物表达的带标签蛋白载体。...

利用Gibson组装技术构建在人延伸因子-1α启动子调控下表达FLAG标签蛋白的质粒载体

本研究比较了不同生产平台中目标人源重组蛋白的表达。我们重点探讨了基于传统发酵罐的培养系统和植物系统，分别描述了每种系统的建立过程，并根据已报道的结果，阐明了各平台固有的局限性和优势。...

不同生物反应器中重组蛋白表达的比较分析：细菌、昆虫细胞与植物系统

在亚细胞水平上，信号事件受到发育和环境线索的动态调控。本文介绍了一种利用烟草瞬时表达系统监测蛋白质-蛋白质动态相互作用，并揭示植物细胞中信号转导空间组织的实验方案。...

利用烟草瞬时表达系统成像MAPK信号通路的空间重排

使用pBIBAC-GW双元载体可轻松实现具有完整单拷贝插入的转基因植物的构建。本文提供了一系列实验方案，指导读者完成转基因拟南芥植株的构建过程，并对插入片段的完整性及拷贝数进行检测。...

利用BIBAC-GW双元载体产生单拷贝插入的转基因植物

在Nicotiana benthamiana叶片中进行三萜类化合物制备规模的瞬时表达

学习使用吉布森组装和基因枪技术在烟草叶片表皮细胞中实现瞬时基因表达的方法。该技术无需限制性内切酶，可靶向叶绿体和过氧化物酶体进行蛋白定位研究。

利用Gibson组装和基因枪在烟草中进行瞬时基因表达关键词：瞬时表达，烟草，Gibson组装，基因枪，植物转化，分子克隆，重组DNA技术

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