使用吉布森大会和基因枪烟草中瞬时基因表达

以下实验的总体目标是观察 A GFP 标记报告基因在烟叶表皮细胞中的瞬时基因表达。这是通过首先设计将在叶绿体和过氧化物酶体中表达的 DNA 构建体来实现的。然后使用 PCR 扩增和 Gibson 组装构建构建体。

接下来，使用基因枪将构建体递送到烟叶表皮细胞。最终，通过共聚焦显微镜对烟叶进行成像，揭示叶绿体和过氧化物酶体中的 GFP 表达。与现有方法（如经典克隆）相比，该技术的主要优点是它不需要限制性内切酶，因此，任何可以通过 PCR 扩增的序列都可以被克隆。

由于基因设计的灵活性，这些技术的应用扩展到更大的规模。农业植物的基因工程通过确定植物细胞内用于最终蛋白质表达的位点来开始此协议。对于这项工作，目的是靶向叶绿体、过氧化物酶体和胞质溶胶的表达。

接下来，设计 expression 构造。该构建体必须在单个质粒中包含启动子、可检测基因和终止子。在这种情况下，组成型启动子 P 端杯 2 驱动 GFP 的表达，然后是 Nolene Synthe、终止子或 nos t。

请注意，在本实验中，我们将测试一系列标签、trit 标签、1、2 和 3 表达到 GFP 的末端末端，以在叶绿体和过氧化物酶体中表达。Gibson 组装方法依赖于预制混合物中几种酶的作用，以部分消化双链 DNA 的末端并促进相邻 DNA 序列的互补碱基对的退火。最终构建体具有三个部分，在 Gibson 组装之前必须在四个 PCR 反应中扩增。

第一次和第二次反应扩增 8， 000 个碱基对的质粒载体 PORE，其中包含 GFP NOS T 和 cany 抗性标记物。抗性标记是将这种大 DNA 分成两个更小模板的好地方，这两个模板更容易 PCR 扩增。第三反应扩增启动子 P 端杯 2，第四反应扩增三角离子 1使用计算机设计软件，例如 ape design，构建碱基，使得每块之间有 50 个碱基对重叠。

订购用于 PCR 的引物时，可以使用 50 个碱基对重叠，因为引物 25 个碱基对每个方向进行 PCR 扩增后，分别纯化 PCR 产物并在蒸馏去离子水中稀释。如果 PCR 模板是用限制性内切酶 DPN 处理的大肠杆菌的小量制备物，则可以去除污染模板 DNA。接下来，测量每个 DNA 片段的浓度。

对于要组装的每种构建体（包括对照），将载体浓度调整至约 150 ng/μL，从冰箱中取出 15 μL 的 Gibson Assembly 混合物等分试样，然后在冰上解冻。使用在线开源tool@gibbon。org，确定每个片段的等摩尔量的体积。

将计算出的每个片段的体积添加到 15 μL Gibson 混合物中。还可以单独制备载体 DNA 的对照。每个反应的总体积应为 20 μL。

如果需要，用水调节音量。将试管在 50 至 55 摄氏度下孵育 30 至 60 分钟。孵育后，将试管放回冰上。

从零下 80 摄氏度的冰箱中取出含有 200 微升氯化钙感受态大肠杆菌商业制剂的微量离心管，然后用手稍微加热。然后将所有 20 微升反应物加入大肠杆菌中。将培养物在冰上孵育 30 分钟，然后转移到 42 摄氏度的水浴中并热休克 60 秒。

不要使用电感受态细胞。相对较高的盐浓度和低 DNA 浓度可能会导致细胞在转化后产生电弧。将培养物放回 ICE 中 2 分钟，然后涂上 750 μL SOC 或 LB 培养基，让它们在 37 摄氏度下恢复 30 分钟。

下一个板，将 LB 板上的混合物与腔或其他适当的抗生素在 37 摄氏度下孵育过夜，通过测序筛选 10 个菌落。请注意，与传统的基于连接的克隆相比，这种方法可能导致更高的背景和更多的非靶标重组事件。先前已在 JoVE 中描述了用基因枪对烟草进行生物转染。

在这里，回顾了与先前实验步骤的关键步骤和差异。扩增和分离构建体后，按照 woods 和 zeto 的 JoVE 文章中的描述准备基因枪子弹，并将它们加载到基因枪中，用于转染 Nico Tania Benham Miana 烟叶表皮组织。选择靠近三到五个月大的植物基部的大叶子。

小心地将其底部朝上放在 15 厘米培养皿中的湿纸巾上，并佩戴适当的眼睛和耳朵保护装置。将基因枪的氦气压力设置为 200 至 250 PS。我小心翼翼地将基因枪对准叶子底部的肋骨之间，大约在叶子上方 3 到 5 厘米处。释放安全性并将颗粒输送到叶子上。

在叶子上的相同位置使用每个子弹两次。移动到另一个位置，如果叶子爆炸，则重复该过程，丢弃并开始新叶子。由于生长条件（如年龄、湿度等），叶片韧性存在一些差异。

所有注射完成后，盖上叶子并在长凳上以弱光存放两到三天。在配备 UV 荧光的解剖显微镜中检查叶子，并寻找表达 GFP 的单个细胞。当发现表达 GFP 的细胞时，使用解剖剪刀小心地提取 5 到 10 毫米的叶子切片。

立即将每个单独的叶子碎片浸入含有约 200 微升 0.1% Triton X 100 的深孔显微镜载玻片的孔中。清洁剂有助于防止表面形成气泡，深孔显微镜载玻片允许使用配备适当滤光片和 40 x 水浸物镜的共聚焦显微镜对细胞进行更大的组织成像区域成像。在这项研究中，将三种不同的 GFP 细胞器靶向构建体与未标记的 GFP 和 rubis 进行了比较。Coag.

在表达未标记 GFP 的对照实验中，使用 GFP 共聚焦显微镜检测瞬时转化的单细胞中的 GFP 荧光。仅在细胞核和胞质溶胶中观察到荧光，而不在叶绿体中观察到荧光，它们通过叶绿素的红色自发荧光来识别，如本例中所示，即仅用叶绿体 Rubis Oag 转染的细胞。GFP 构建体 GFP 在大细胞器中表达。

该单元格的轮廓为白色。黄色表示构建体与叶绿素共定位的区域，表明构建体靶向叶绿体，如该三角图像所示，在叶绿体、外围、胞质溶胶和被认为是过氧化物酶体的小点状细胞器中可以看到一个转染细胞 GFP 表达。同样，triag 2 转染的细胞也在叶绿体胞质溶胶和过氧化物酶体 triag 3 中表达 GFP，它由嵌入叶绿体序列低复杂性区域的过氧化物酶体信号组成，仅定位于叶绿体和过氧化物酶体。

请注意，此单元格位于不同的叶层中。该图总结了在典型烟叶表皮细胞的隔室中观察到的表达。显示了细胞内的相对大小和位置，并通过基因枪转染和共聚焦显微镜观察到的相对表达水平。

请注意，未标记的 GFP 定位于胞质溶胶和细胞核，PIMT 两个 GFP 对照定位于叶绿体和 triag 一个 GFP，triag 两个 GFP 和 Triag 3G FP 定位于叶绿体和过氧化物酶体，如预测的那样，看完这个视频，你应该对如何使用 Gibson 组装构建血浆有很好的了解， 将其 Bally 递送到烟叶上，并在 3 天内观察 GFP 表达。在尝试此程序时，重要的是要记住使用每微升 150 纳克的载体 DNA 进行 Gibson 组装，并使用每微升 1500 纳克的最终 DNA 构建体来制作基因枪弹。按照此程序，可以进行其他方法，如农杆菌转染，以获得稳定的基因表达，而不是瞬时。