通过影像学的蛹壳果蝇

本文演示了如何使用直接通过蛹壳快速扫描共聚焦显微镜对细胞图像的行为。将其留在蛹壳完好无损，此方法允许观察和动态细胞过程的测量在果蝇发育的阶段，是很难直接学习。

在本视频中，我们将演示新技术，这些技术使我们能够在不影响黑腹果蝇结构完整性的情况下对黑腹果蝇的进行成像。通过保持瞳孔病例完整，我们最大限度地减少了成像对蛹发育和活力的影响。我们使用共振扫描 8， 000 赫兹共聚焦显微镜进行成像。

重要的是，这款显微镜的扫描速度非常快，灵敏度高，大大减少了漂白，从而可以延长观察时间。通过这种方法，我们已经能够可视化各种细胞生物过程，包括行为、fop、足、形态发生、吞噬作用和有丝分裂。使用这种技术，我们可以长时间原位观察事件而不会损坏生物体。

从这些方法中获得的观察结果可用于了解果蝇发育这个相对难以接近的阶段的各种生物现象，奶酪人，适当的阶段，我们检查它们，同时还在小瓶中寻找发育阶段的关键指标，以研究细胞分裂，我们寻找已经避开头部的 PIPA， 但仍然没有显示绿包和胎粪以及背腹部。用湿润的画笔触摸窥视盒，转移水以溶解唾液胶，使个体松动。然后轻轻地将琵琶推开，用画笔捡起，然后转移到盛有水的培养皿中。

人们在水中彻底清洗，以清洁食物或碎屑。然后，我们将它们排成一排，背侧朝上，以确保它们处于正确的阶段。小心处理它们。

即使管道上开一个小孔，它们也很容易死亡。将选定的个体小心放置玻璃底培养皿并定向，使感兴趣的特征最接近盖玻片并尽可能平行于表面。为了观察瞳孔翼，我们将蛹支撑在支撑物上，例如细长的造型粘土或牙蜡，确保它们在定向后不会移动。

然后，我们邀请这道菜，以确保感兴趣的特征是可见的并且方向正确。通常，一次安装多个 pipa 可以防止一个不表达荧光蛋白或不处于所需阶段的可能性。一旦琵琶全部安装好并正确定向，我们用蘸有 diod dilin glycol 的画笔触摸每个 pipa 的底部，diod dilin glycol 是一种无毒的山峰，与纯油或稀释水的折射率相匹配。

这具有双重目的，即减少瞳孔的衍射和减少浸入的折射 一旦我们正确安装和布置了 pupi，就会使用透镜。我们转向激光扫描共聚焦显微镜。我们使用像 SP 5 一样配备共振扫描仪的倒置。

将培养皿安装在显微镜上，我们使用显微镜光学元件定位 puput。找到蛹后，调整焦距，以便在这种情况下可以看到感兴趣的特征，即翅膀。我们通过穿过机翼中间的大气管元件来识别机翼。

当确定感兴趣区域并聚焦显微镜时，我们将 20 x 干物镜。重新确认聚焦后，我们将显微镜切换到共聚焦模式。我们调整共聚焦的参数以最大限度地减少曝光。

光强度保持在 10% 透射率以下。为了最大限度地提高亮度，我们为带有 azuma four 的 20 倍镜头打开了 130 微米的针孔，并将增益设置为 900 伏。通过这些设置，我们可以成像数小时，而不会影响有丝分裂间隔的长度或动物的健康状况。

接下来，我们设置 Z 切片的数量和图像捕获的频率，以匹配我们试图观察到的生物现象的特征，例如，一分钟的成像间隔足以捕捉细胞分裂的所有重要特征。但是 3 秒的间隔对于观察 phylo podia 的动力学很重要。通过上皮上下聚焦，直到找到所需的特征。

如有必要，使用显微镜和 XYZT 模式收集随时间变化的 Z 堆栈。电影的持续时间也是一个重要参数。我们制作了长达 10 小时的视频。

当同时对多个荧光分子进行成像时，我们试图缩短总成像持续时间。原则上，每个荧光标签都会导致活性氧的产生增加。在实践中，我们没有观察到与三重标记线成像 1 小时或更短时间相关的致死率。

如果目标组织或过程小于约 5 微米，您可能需要使用浸没透镜。请记住，这些镜头将激光聚焦到更精细的点，从而增加光强度，您必须相应地调整成像参数，电影从共聚焦显微镜传输到运行高速公路图像分析程序斐济的计算机。借助斐济，我们可以打开、测量和作共聚焦生成的多维图像中的特征。

这种成像方法使我们能够研究细胞核相对于细胞周期的位置。在瞳孔翼中，我们以一分钟的间隔从上皮顶部到最可观察的细胞核底部收集了一个 Z 堆栈。在这些电影中，我们只观察到左图所示的根尖共聚焦切片中发生的分裂，右侧显示的更多基底切片揭示了新分裂的细胞核从浅表层返回，但不包含有丝分裂的其他特征。

这些数据表明，快速分裂的瞳孔翼上皮与幼虫翼盘和其他 MedOne 相似。在有丝分裂期间，该细胞核中的上皮移动到上皮的顶端表面。尽管有这种共性，但瞳孔翼上皮的分层相对不严重，大多数细胞核非常靠近顶层。

以前在瞳孔发育早期对果蝇进行成像的方法受到阻碍，主要是由于试图去除或穿透瞳孔外壳。我们在这里描述了一种新颖的方法，该方法使我们能够在发育过程中可视化成体细胞，而不会影响生物体的活力。我们的方法与其他方法在性质上不同，因为它保持了瞳孔大小写的完整性。

共聚焦显微镜与共振扫描相结合，使我们能够看到瞳孔壳 20 微米范围内发育中的组织。分辨深度的主要限制是晶状体的工作距离和组织中外壳的散射。然而，我们的方法使我们能够解析从顶端到基部的上皮细胞的特征。

我们使用这种技术来观察有丝分裂、系统、足、形态发生和吞噬作用。除此之外，我们还在一个样品中研究了多达三种不同的荧光标签。我们相信这里描述的方法为瞳孔发育的早期阶段打开了最外层上皮层的研究。

当与 geal 遗传学的力量相结合时，这种可访问性可能会进一步提高我们对成人发育的理解。