大脑切片生物素化:一个前体内方法来衡量地区特有的质膜蛋白贩运成年神经元

该程序的总体目标是量化神经元表面蛋白的急性变化。在离体脑切片制备中，这是通过首先制备可行的急性脑切片来实现的。接下来，用感兴趣的药物处理切片。

然后使用膜 imperian tonation 试剂标记细胞表面蛋白。最后，使用 strep avid 和亲和层析分离表面生物素化蛋白。最终，免疫绘图用于量化药物治疗后蛋白质表面表达的变化。

与现有方法（例如基于细胞的测定）相比，该技术的主要优点是神经元蛋白运输是在原位检查的，而不是在异源表达系统或原代神经元培养物中检查的。一般来说，刚接触这种方法的人将难以准备可行的品牌切片。好。要准备脑切片，首先根据文本协议制作新鲜的 1 x 人工脑脊液或 A CSF 和蔗糖补充 A CSF 或 S-A-C-S-F，冷却。

ICE 上的 S-A-C-S-F 使用 95% 的氧气和 5% 的二氧化碳，通过在冰上鼓泡 20 分钟，使缓冲液充满氧气。通过颈椎脱位和斩首处死 P 30 至 38 只小鼠并迅速取出大脑后，使用振动切片机将它们置于预冷的含氧 S-A-C-S-F 中。在感兴趣的区域制作 300 微米的大脑切片，如果需要，将左右半球分开，分别用作对照和实验切片。

使用火抛光的 pastier 移液器将切片转移到含有含氧 A CSF 的网状底部保持室中。让切片在 31 摄氏度下恢复 40 分钟，并持续温和地冒泡。孵育后，将切片转移到各个网状室中。

在 24 孔板中，在预热的含氧 A CSF 中洗涤切片 3 次，不断冒泡。如果测试化合物，则加入 10 倍浓度药物的 1/10 体积，并在所需温度下在水浴中轻轻摇动板后轻轻倒置混合。使用冰冷的 A CSF 通过清洗 3 次来快速冷却切片，以购买 aate 表面蛋白。

在冰冷的 A CSF 中制备新鲜的 1.0 毫克/毫升磺胺 N-H-S-S-S 生物素 向切片中加入 0.75 毫升溶液，在冰上孵育 45 分钟。使用冰冷的 A CSF 快速洗涤切片 3 次后，在冰冷的 A CSF 中孵育 10 分钟，然后用冰冷的切片淬灭缓冲液洗涤切片 3 次，并与 0.75 毫升切片孵育，淬灭缓冲液 2 次，每次在冰上 25 分钟，以淬灭游离的 suo N-H-S-S-S 生物素以制备组织裂解物。在冰冷的 A CSF 中清洗切片 3 次，然后使用火抛光的 pasti 移液器将每片转移到微量离心管中。

200 GS 离心 1 分钟，轻轻沉淀切片，然后小心吸出剩余的 A CSF。然后加入 400 微升冰冷的冰块，撕开一个圆周率，并使用 P 200 移液器上下吹打一次以完全裂解组织。将解离的组织转移到新试管中，用 18， 000 Gs 的旋转离心机在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，并在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。

为了沉淀细胞碎片，分离生物素化蛋白质并通过免疫印迹进行分析。根据文本方案，神经元多巴胺转运蛋白响应于细胞系中的 PKC 激活而被内化。尽管许多报告表明 PKC 在各种细胞系和表达系统中诱导了多巴胺、活性转运蛋白或债务表面丢失，但在培养的多巴胺能神经元中证实这一发现一直具有挑战性，我们使用小鼠 stri AAL 切片直接测试 dat 是否内化响应成人多巴胺能神经元中的 PKC 激活所见。

在这里，我们在罗勒或载体处理的条件下在小鼠纹状体中检测到强大的 DA 表面表达，在细胞表面 PKC 激活处有 81.4 正负 5.8% 的总债务，用四个球 12。Myra State 13 acetate 显着降低 dat 表面表达至 60.8 正负总债务的 5.2%，这相当于质膜债务损失约 30%。相比之下，只有 1.6 加或负 0.4% 的总酪氨酸羟化酶被生物素化，这与其细胞内定位一致，并证实了调性试剂被排除在多巴胺能神经元的细胞内部之外。

观看此视频后，您应该对如何测量完整神经元末梢中 plus 膜蛋白表达的变化有很好的了解。