Myospheres的产生从人类胚胎干细胞通过表观遗传修饰

该程序的总体目标是生成肌球。由来自人胚胎干细胞的骨骼肌细胞组成的 EB 样结构。这是通过通过 Baf 60 C 的慢病毒感染对细胞进行重编程来实现的，该程序的第二步是用第二种病毒 myo D 慢病毒感染相同的细胞。

然后在基于血清的培养基中诱导感染的细胞形成 EB 样聚集体 5 天。然后将 EB 培养基交换为无血清分化培养基，并将聚集体再生长两周形成肌球。最终，免疫荧光用于可视化 OCT 包埋聚集体的切片。

该技术的主要优点是骨骼肌细胞的高产量变性，与间充质或中胚层祖细胞类似，不需要事实分类，因此与三维培养系统兼容在感染人胚胎干细胞的前一天，在六个孔板中将人胚胎干细胞克隆和回收补充剂以 1000 x 的浓度添加到培养基中，使最终浓度为 2 微摩尔天用高滴度浴 60 CGFP 慢病毒感染人胚胎干细胞。首先，加入 1 毫升牛肚，将细胞孔解离成单细胞悬液，并在平板中孵育 5 分钟。然后收集并转移至15 mL试管中。

加入 9 毫升制备好的培养基，以 1， 200 RPM 的转速将细胞离心 5 分钟，同时等待 1 毫升 mt. SIR， 1。添加终浓度为 6 μg/ml 的 poly brain 和 2 μmol 的人胚胎干细胞恢复补充剂。

然后将细胞重悬于该溶液中，并将它们转移到 6 孔低贴壁板的单孔中。现在加入浓缩浴 60 C 病毒，感染倍数为 1 亿。将板与病毒一起孵育 3 小时。

然后收集细胞并将它们分成两个基质胶包被的板孔中。向每个板中加入 2 毫升 mt、SIR，其中 1 毫升含有 2 微摩尔补充剂，然后将细胞在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天，将介质更换为新介质。

在感染开始 48 小时后似乎已经聚集。检查荧光以评估感染效率。继续每天更换培养基，直到细胞达到 80% 汇合，然后使用相同的方案将细胞和肌 D 病毒解离到细胞上。

通过每日更换培养基来维持感染的细胞，直到它们在此生长点前一天达到 80% 汇合。以每平方厘米 1000 个细胞的速度将 MES 接种在基质胶包被的平板上，以将感染的细胞传代到 ME 的板中。第二天。

使用 trip ALI 解离它们并将细胞转移到 15 mL 试管中到细胞中。加入 9 毫升人胚胎干细胞培养基并离心。添加 1， 200 RPM 5 分钟。

复苏，将沉淀的细胞悬浮在新鲜的 6 mL 人胚胎干细胞培养基中。现在从两块 mes 板中取出培养基，并将感染的细胞添加到其中。将细胞孵育数天。

一次，添加 80% 汇合度。去除所有培养基并加入一毫升胶原酶 4。在 37 摄氏度的胶原酶中浸泡 5 分钟后，每毫升添加 1 毫克。

用一毫升人胚胎干细胞培养基替换胶原酶。然后在解剖显微镜下，使用 10 毫升移液器吸头刮取菌落，将菌落转移到 15 毫升试管中并让它们沉淀。三分钟后，去除上清液，并将细胞重悬于人胚胎干细胞培养基中。

然后将细胞以 1 比 4 的比例接种到冰毒平板上。受感染的细胞需要数量多，并且已经形成高质量的集落才能进行此过程。从每个孔中取出培养基，并加入 1 毫升胶原酶。四。

像以前一样，每毫升浓度添加 1 毫克，5 分钟后用 EB 培养基替换胶原酶反应。然后快速使用显微镜刮除菌落。使用 10 mL 移液器吸头，可以将细胞解离成小细胞团块。

将这些聚集体收集到 15 mL 试管中，静置约 3 分钟后，去除上清液，将细胞重悬于 3 mL EB 培养基中，并将所有细胞转移到 6 孔低位贴壁板的单个孔中。第二天将此板孵育过夜。检查它们是否有大菌落块。

如果找到任何。将它们流过 5 毫升移液器几次，将它们打散。如果有许多漂浮的单细胞，则通过沉降收集聚集体并替换为新鲜的 EB 培养基。

培养 5 天后，每隔一天更换一次培养基。收集细胞聚集体并用 2 毫升 PBS 洗涤一次，让细胞在正常重力下沉淀。然后用 3 ml DM 培养基替换 PBS，并在接下来的 15 天培养中将细胞放回相同的板孔中。

每三天更换一次培养基。在此期间，中间层将形成。人胚胎干细胞用携带 GFP 荧光的 60 C 浴感染。

72 小时后，对单元格进行事实分类。表达 BAF 60 C 的细胞生长至约 75% co 流畅度，然后用 myo D 慢病毒感染。通过实时定量 PCR 检测感染细胞中的外源基因表达。

检查蛋白质水平的表达和分布。接下来 GFP 对应于 baf 60 C 表达，并使用 myo D 抗体检查myo D 表达。15 天后，人类胚胎干细胞开始形成 EB 样聚集体。

将一部分肌球包埋在 OCT 化合物中，并对肌原和肌球蛋白重链标志物染色呈阳性的切片切片。从第 10 天开始，可以观察到肌球的零星收缩。一些肌球呈现出不同或不寻常的形状，可能是由于肌球之间的融合。

这项技术将推进疾病建模和治疗领域的研究，因为肌球可以从受不同肌肉疾病影响的患者的多能干细胞中产生。出于这个原因，肌球提供了一种适合药物清洁和疾病发病机制的 Disease in Edition 模型。