Name: Myospheres的产生从人类胚胎干细胞通过表观遗传修饰 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 了解通过表观遗传修饰从人类胚胎干细胞生成肌球体的方法。该技术利用慢病毒转导Baf 60 C和Myo D，形成类胚体聚集体，并在无血清培养基中分化为具有收缩功能的骨骼肌细胞，为肌肉再生医学研究提供高效模型。

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PLP 是桑福德儿童健康研究中心的副研究员。本工作获得了以下资助：美国国立卫生研究院/国立关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）资助的 R01AR056712、R01AR052779 和 P30 AR061303 项目，以及肌营养不良协会（MDA）和桑福德儿童健康研究奖。本工作部分受益于欧洲共同体第七框架计划项目 FP7-Health - 2009 ENDOSTEM 241440（激活血管相关干细胞与肌肉干细胞以修复和维持肌肉组织）的研究经费支持。SA 获得了加州再生医学研究所（CIRM）博士后奖学金的支持。

1. 人类胚胎干细胞的感染
本实验方案需要编码BAF60C和MyoD13的高滴度慢病毒。这些质粒构建体可应要求提供。
<ol>
	<li>开始前的建议
		<ol>
			<li>为确保高感染效率，需在无饲养层条件下接种hESCs进行感染（图2A以消除病毒摄取过程中的细胞竞争。事实上，与人胚胎干细胞（hESCs）相比，MEFs 感染难度显著更低，且具备 MyoD 介导的转分化能力。因此，从 hESC 培养物中清除 MEFs 可提高感染效率。</li>
			<li>建议使用高滴度的慢病毒，以确保高效的感染效率。提高感染效率的方法在“检测感染.</li>
			<li>通过向每孔加入1 ml浓度为1 mg/ml的Matrigel制备Matrigel包被板，在室温下放置至少1小时（若前一日制备，则密封后于4 °C过夜）。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>感染步骤
		<ol>
			<li>感染前一天
				<ol>
					<li>添加hES细胞克隆 &amp;#38; 培养基中加入1,000倍稀释的恢复补充剂（终浓度为2 mM）。</li>
				</ol>
			</li>
			<li>第0天 - 感染BAF60C 
				注意：首先用 BAF60C 感染 hESCs，然后用 MyoD 进行感染。
				<ol>
					<li>消化一个6孔板中以克隆形态培养的人胚胎干细胞（hESCs）孔内的细胞14 在37 °C下用1 ml TrypLE孵育5分钟，获得单细胞悬液。</li>
					<li>将悬液转移至15 ml离心管中，加入9 ml hESC培养基，1,200 rpm离心5分钟。</li>
					<li>离心期间，在洁净离心管中配制感染混合液：向1 ml mTeSR1培养基中加入polybrene（6 mg/ml）和hES细胞克隆 &amp;#38; 恢复补充剂（2 mM）。</li>
					<li>重悬细胞沉淀（约 5 x 105-1 × 106 将一个汇合度良好的hESC孔中的细胞与1 ml感染混合液混合，接种至6孔低吸附培养板中，以防止细胞贴附于塑料表面。</li>
					<li>加入BAF60C-iRES-GFP病毒，浓度为108 MOI值感染，在培养箱中孵育3小时</li>
					<li>收集含有病毒的细胞悬液，均分至两个包被了Matrigel的孔中，随后每孔加入2 ml mTeSR1+ hES细胞克隆 &amp;#38; 向每孔加入恢复液，置于培养箱中过夜。</li>
				</ol>
			</li>
			<li>第1天
				<ol>
					<li>小心移除含有病毒的培养基，替换为 2 ml mTeSR1 和 hES 细胞克隆培养基 &amp;#38; 恢复补充剂。细胞将开始出现聚团，如图所示 图2B.</li>
				</ol>
			</li>
			<li>第2天 - 用MyoD感染 
				<ol>
					<li>在继续操作之前，使用荧光显微镜检查细胞的荧光状态，以确保感染效率较高。如果未达到预期效果，请参见“检测感染".</li>
					<li>如果细胞融合度已达到至少80%，则按以下步骤进行；否则需再等待一天后再进行操作。</li>
					<li>吸除培养基，加入1 ml TrypLE试剂以解离细胞。在37 °C孵育5分钟。</li>
					<li>重复1.2.2.2 - 1.2.2.6所述步骤，加入MyoD病毒，浓度为108 感染复数（MOI）</li>
				</ol>
			</li>
			<li>第3天
				<ol>
					<li>小心移除含有病毒的培养基，并更换为 2 ml mTeSR1 和 hES 细胞克隆培养基 &amp;#38；恢复补充剂</li>
					<li>将MEF接种于基质胶包被的培养板上，密度为2.5 × 10⁵5/cm2 第二天继续培养以促进感染细胞的增殖。</li>
				</ol>
			</li>
			<li>第4天
				<ol>
					<li>吸除培养基，加入1 ml TrypLE试剂以解离细胞。在37 °C孵育5分钟。</li>
					<li>将细胞转移至15 ml离心管中，加入9 ml hESC培养基，1,200 rpm离心5分钟。</li>
					<li>移除上清液，并用6 ml hESC培养基重悬。</li>
					<li>从含有MEFs的6孔板中移除培养基，以1:2的传代比例接种hESCs，每孔含MEFs的孔中加入3 ml培养基。 
						提示！ 当细胞集落达到汇合状态时，可将部分经 MyoD/BAF60C 感染的细胞冻存于液氮中作为储备。冻存液包含 90% KOSR、10% DMSO 及 2 mM hES Cell Cloning &amp;#38; 恢复补充剂。随后可将剩余孔中的细胞进行分化处理——具体步骤见下文描述。若需要更多细胞以生成更多的肌球体，可按以下方法进一步扩增感染的hESCs：</li>
					<li>吸除培养基，加入1 ml浓度为1 mg/ml的胶原酶IV，于37 °C孵育5 min。</li>
					<li>去除IV型胶原酶，加入1 ml hESC培养基。</li>
					<li>在解剖显微镜下，用10 ml枪头刮取菌落。</li>
					<li>将菌落块收集到15 ml离心管中，静置3分钟使其沉降。移除上清液，用hESC培养基重悬，按1:4的比例接种至MEFs培养板中。</li>
				</ol>
			</li>
		</ol>
	</li>
	<li>检测感染
		<ol>
			<li>在细胞传代过程中，建议将感染的细胞以较小规模接种，用于收获RNA进行分析，并通过免疫荧光检测蛋白表达，以检查各阶段反映正确生物学状态的生物标志物参见代表性结果对于高滴度的慢病毒，预期感染细胞的比例应至少达到80%。</li>
			<li>为确保高效率，可对慢病毒载体进行改造，引入荧光筛选标记和/或抗生素抗性基因。我们表达BAF60C的慢病毒质粒也携带GFP荧光标记。</li>
			<li>对hESCs进行荧光标记分选。若感染效率较低，建议使用荧光激活细胞分选（FACS分选）富集表达BAF60C病毒的细胞，随后用高滴度MyoD病毒进行感染。
				<ol>
					<li>添加hES细胞克隆 &amp;#38; 分选前一天在培养基中加入恢复补充剂。</li>
					<li>分选当天，使用 TrypLE 消化细胞（方法同第 0 天），并将细胞重悬于 KO 替代血清加 hES 细胞克隆培养基中 &amp;#38; FACS管中的恢复补充剂。</li>
					<li>分选结束后，将细胞收集至KO替代血清中，并接种至MEFs培养板上，加入hES细胞克隆培养液 &amp;#38; 恢复补充剂</li>
				</ol>
			</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
2. 类胚体诱导与分化
<ol>
	<li>诱导与分化步骤
		<ol>
			<li>第0天 - 胚状体（EB）诱导
				<ol>
					<li>在开始对BAF60C/Myod感染的人胚胎干细胞（hESCs）进行分化前，需确保培养孔中具有大量细胞集落（图2C）。</li>
					<li>每孔吸除培养基，用PBS洗涤一次，加入1 ml浓度为1 mg/ml的IV型胶原酶。在37 °C下孵育5分钟。</li>
					<li>吸除胶原酶，加入1 ml EB培养基。</li>
					<li>在解剖显微镜下，使用10 ml枪头轻轻刮擦，将集落机械性地分离为含有400–800个细胞的细胞团块。</li>
					<li>将集落碎片收集至15 ml离心管中，静置沉降3分钟。吸除上清液，用3 ml EB培养基重悬细胞，然后将细胞悬液转移至一个6孔低吸附培养板的孔中。</li>
				</ol>
			</li>
			<li>第1天
				<ol>
					<li>在继续操作前，检查集落大小及细胞死亡情况。若存在较大团块，使用5 ml移液器轻柔吹打3–4次以破碎团块。若细胞死亡严重（漂浮细胞和碎片较多），则将细胞团块通过重力沉降收集至15 ml离心管中，更换为3 ml新鲜EB培养基后重新接种；否则按以下步骤操作。</li>
					<li>向各孔中加入1.5 ml新鲜EB培养基。</li>
				</ol>
			</li>
			<li>第2天
				<ol>
					<li>将各孔中的细胞团块收集至15 ml离心管中以更换培养基，静置沉降2分钟。</li>
					<li>吸除上清液，加入3 ml新鲜EB培养基重悬，再将细胞悬液重新分配至原孔中。</li>
				</ol>
			</li>
			<li>第3天
				<ol>
					<li>向各孔中加入1.5 ml新鲜EB培养基。</li>
				</ol>
			</li>
			<li>第4天
				<ol>
					<li>操作步骤同“第2天”所述。</li>
				</ol>
			</li>
			<li>第5天 - 胚状体样细胞团的成肌分化（图2D）。
				<ol>
					<li>按照步骤2.1.3.1所述方法收集细胞团块，用2 ml PBS洗涤一次，静置使团块沉降。</li>
					<li>吸除PBS，加入3 ml DM培养基，重新接种至原孔中。</li>
				</ol>
			</li>
			<li>第6天至第20天
				<ol>
					<li>从第6天至第20天，每隔3天更换一次新鲜培养基。典型的肌球体（myosphere）形态见图2E。</li>
				</ol>
			</li>
		</ol>
	</li>
	<li>检测肌球体分化情况
		<ol>
			<li>在进一步实验前，建议通过制备包埋于O.C.T.包埋剂中的肌球体切片，检测肌球体内成肌分化的效率，具体方法参见此前JoVE实验方案12。对成肌标志物如生肌素（myogenin，克隆号F5D，DSHB）和肌球蛋白重链（myosin heavy chain，克隆号MF20，DSHB）进行免疫荧光染色（见代表性结果）。 
				提示！ 为成功在EB切片上进行生肌素染色，关键步骤是使用0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）处理5分钟进行抗原修复。此外，本方案也可用于F5D与MF20抗体的双重染色。</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
3. 培养基配方
<ol>
	<li>ESC 培养基 
		DMEM-F12 
		1 mM L-谷氨酰胺 
		20% Knockout 血清替代物（KOSR） 
		0.1 mM 非必需氨基酸（NEAA） 
		50 U/ml 青霉素/链霉素（Pen/Strep） 
		0.1 mM β-巯基乙醇 
		8 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</li>
	<li>EB 培养基 
		DMEM F12 
		1 mM L-谷氨酰胺 
		15% 胎牛血清（FBS） 
		5% 马血清</li>
	<li>DM 培养基 
		DMEF F12 
		1X ITS 液体培养基添加剂 
		1X N-2 添加剂</li>
</ol>

<ol><li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+skeletal+muscle+regeneration+from+differentiating+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells.</a> Nat Med. 14, 134-143 (2008).</li>
<li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ES-+and+iPS-derived+myogenic+progenitors+restore+DYSTROPHIN+and+improve+contractility+upon+transplantation+in+dystrophic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 610-619 (2012).</li>
<li>Iacovino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cassette+exchange%3A+a+rapid+and+efficient+system+enabling+conditional+gene+expression+in+embryonic+stem+and+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene expression in embryonic stem and primary cells.</a> Stem Cells. 29, 1580-1588 (2011).</li>
<li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+engraftable+skeletal+myoblasts+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells.</a> Nat Med. 13, 642-648 (2007).</li>
<li>Goudenege, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblasts+derived+from+normal+hESCs+and+dystrophic+hiPSCs+efficiently+fuse+with+existing+muscle+fibers+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation.</a> Mol Ther. 11, 2153-2167 (2012).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> Embo J. 31, 301-316 (2012).</li>
<li>Albini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+of+human+embryonic+stem+cells+into+skeletal+muscle+cells+and+generation+of+contractile+myospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells into skeletal muscle cells and generation of contractile myospheres.</a> Cell Rep. 3, 661-670 (2013).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 5434-5438 (1989).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Ho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+embryonic+stem+cell+chromatin+remodeling+complex%2C+esBAF%2C+is+essential+for+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 5181-5186 (2009).</li>
<li>Gomes, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pluripotent+stem+cells+by+using+cryosections+of+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li>
<li>Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M. Human embryonic stem cell cardiogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarcova%2C+M+%22Human+Stem+Cell+Manual%3A+a+Laboratory+Guide%22">Human Stem Cell Manual: a Laboratory Guide</a>. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. H. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam. 227-237 (2007).</li>
<li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle%3A+the+role+of+MyoD1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

本文提出的方案描述了如何直接从人胚胎干细胞（hESCs）生成三维收缩性肌纤维簇（肌球体）。该策略具有前所未有的巨大潜力，可悬浮培养出微型肌肉，适用于作为“培养皿中的疾病”模型，用于筛选实验和发育研究。此外，从hESCs生成肌球体的方法简便，且在分化过程中无需进行任何荧光激活细胞分选（FACS）步骤，而此类分选通常会对回收细胞的得率产生负面影响。此外，在分化过程中进行分选操作会干扰细胞聚集体的形成，因为它需要将胚胎体（EB）解离为单个细胞。
该方法基于利用特定因子 MyoD 和 BAF60C 对人胚胎干细胞（hESCs）进行表观遗传重编程，这些因子在多能性胚胎干细胞中不表达。MyoD 和 BAF60C 提供一种“核心”蛋白复合物，可标记基因组位点，启动转录并激活骨骼肌发生程序。这两个因子通过慢病毒感染递送至细胞中，因此在所有细胞中实现两种因子的高效共感染至关重要。这可通过使用高滴度病毒或携带筛选标记的病毒来实现。培养条件在优化肌源性分化程度方面也起着重要作用。我们提出一种基于血清的分化方案，将表达 MyoD/BAF60C 的 hESCs 诱导为肌源性前体细胞簇，随后在无血清的限定培养基（含胰岛素-转铁蛋白-硒，ITS）中孵育，以促使肌源性前体细胞转化为骨骼肌肌管。然而，其他限定培养基也可能实现同等甚至更优的肌源性分化效果。该方案目前的一个局限性在于依赖使用胎牛血清，后者除含有多种动物蛋白和成分外，还存在批间差异。这可能导致肌源性转化效率降低或肌球体内部出现异质性。值得注意的是，并非所有由表达 BAF60C/MyoD 的 hESCs 产生的类胚体样结构均为肌球体；其中一些为完全由肌纤维组成的类胚体样聚集体。根据实验结束时对类胚体切片进行免疫染色的估计，正常情况下，表达 BAF60C 和 MyoD 的 hESCs 所产生的肌球体比例可在 30% 至 60% 之间。一种潜在的富集培养皿中肌球体的方法是使用肌源性报告系统，这将有助于剔除部分分化或未分化的类胚体样簇，仅保留肌球体。
最后，深入理解所引入因子发挥作用所需时间机制，将有助于改进递送方法。例如，如果 BAF60C 和 MyoD 仅需短暂表达即可“启动”细胞向正确方向分化，则可采用基于修饰 mRNA 递送的方法。相反，如果这些因子需要较长时间持续表达，待细胞启动其内源性蛋白表达后才能发挥作用，则建议采用附加体型载体策略，以避免基因组整合带来的变异性和不可控效应。最后，我们注意到，为实现人胚胎干细胞（hESC）向骨骼肌的转化，必须在 MyoD 表达之前或同时表达 BAF60C（绝不能在其之后）。BAF60C 需优先表达的要求，可能与其在基因组范围内通过调控 MyoD 染色质分布来预先设定表观遗传环境的作用密切相关6,15。因此，未来可通过能够促进 BAF60C 在 hESC 中表达的化合物或其他干预手段，进一步优化实验方案。

由于具有在保持多能性的同时自我更新的独特能力，人类胚胎干细胞（hESCs）被视为再生医学中不可或缺的资源。利用干细胞介导的病变肌肉再殖，以及由人类胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的骨骼肌生成，为 体外 疾病建模是旨在发现多种神经肌肉疾病治疗方法并阐明其发病机制的研究中的关键目标。然而，这些研究面临人胚胎干细胞（hESCs）难以转化为骨骼肌细胞，以及关于hESC向骨骼肌发生定向分化的分子调控机制信息匮乏的挑战。事实上，此前尝试从hESCs生成骨骼肌前体细胞的研究表明，只有经由拟胚体（embryoid body, EB）衍生的后代细胞或间充质细胞，在异位表达转录激活因子后才具备启动骨骼肌发生的潜能。例如 Pax3 或 Myf51-3 或通过暴露于特定的培养条件4-5. 

我们此前已证实，SWI/SNF 复合物组分 BAF60C（由 SMARCD3），是转录机制中的关键组分，可介导 MyoD 对肌肉特异性基因位点的激活6我们最近发现，BAF60C 的特异性缺失可使人胚胎干细胞（hESCs）对 MyoD 介导的骨骼肌生成激活产生抵抗性7 在表达BAF60C的体细胞中通常可观察到的现象8-10，这一过程通常被称为成肌转化。在特定培养条件下，BAF60C的强制表达可使MyoD直接激活人胚胎干细胞（hESCs）中的骨骼肌发生过程，其中BAF60C与MyoD共同施加一种表观遗传标记，促使hESCs向成肌细胞谱系定向分化7值得注意的是，先前的蛋白质组学分析显示，在ESC中，SWI/SNF复合物组分中特异性缺失BAF60C11. 我们利用这一知识，诱导人胚胎干细胞（hESCs）向肌源性谱系发生表观遗传学定向分化，从而获得均一的骨骼肌成肌细胞群体。这些细胞可聚集形成三维收缩性结构（肌球体），其功能上可模拟微型骨骼肌。7. 事实上，我们从人胚胎干细胞（hESCs）生成骨骼肌前体细胞的方法依赖于hESCs在表观遗传水平上向成肌谱系的定向分化，这种分化潜能处于表型潜伏状态，直到细胞暴露于分化信号（如细胞聚集及在分化培养基中培养）时才被激活（参见具体实验方案）。该策略使得具有表观遗传学上已定向为骨骼肌谱系的同质性hESCs群体得以扩增，并可用于形成三维收缩性肌球体，这些肌球体可重现骨骼肌的组织学和功能特性。此类肌球体为构建可应用于“培养皿中的疾病”模型的微型肌肉组织提供了首个实验证据。当由患者来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）生成时，这些肌球体不仅有望揭示长期存在的发育生物学问题及罕见病的发病机制，还具备作为高通量药物筛选工具的巨大潜力。我们还注意到，对肌球体进行分析的一个直接检测手段是如JoVE实验方案中Gomes所述，通过切片进行免疫组织化学染色。 等12

<table><tbody><tr><td>6孔板</td><td>康宁</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>6孔低吸附培养板</td><td>康宁</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>GFR Matrigel</td><td>BD生物科学</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>MEFs（生长停滞）&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Invitrogen</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>1 mM L-谷氨酰胺（100倍浓缩）</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（100倍浓度）</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>NEAA（100倍浓缩液）</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>ITS液体培养基添加剂</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>N2补充剂&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>HS</td><td>Invitrogen</td><td>16050114</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;https://www.stemgent.com/products/193">人胚胎干细胞克隆 &amp;和恢复补充剂&lt;/a&gt;</td><td>Stemgent</td><td>01-0014-100</td><td></td></tr><tr><td>bfgf</td><td>Sigma</td><td>4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>抗MyoD</td><td>BD 生物科学</td><td>554130</td><td></td></tr><tr><td>抗肌球蛋白重链（Anti-MyHC）</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>抗肌细胞生成素</td><td>DSHB</td><td>F5D</td><td></td></tr></tbody></table>

通过表观遗传重编程由人胚胎干细胞生成肌球体

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

从人类胚胎干细胞（hESCs）中获得均一且大量扩增的骨骼肌细胞群体，是细胞治疗以及建立人类神经肌肉疾病“培养皿中的疾病”模型的必要条件。然而，由于目标细胞群体丰度低、异质性高，以及缺乏形成三维收缩结构的实验方案，干细胞在神经肌肉疾病中的应用受到显著限制。我们设计了一种通过在hESCs中异位引入特定因子——肌肉决定因子MyoD和SWI/SNF染色质重塑复合体组分BAF60C——从而将hESCs重编程为骨骼肌细胞的方案。本文描述了该方案的具体步骤，用于生成由hESC衍生的成肌细胞，并促进其聚集成具有三维结构的微小球状体（myospheres），后者在功能上可模拟微型骨骼肌7。

图1A展示了从人胚胎干细胞（hESCs）生成肌球体的实验方案示意图。需要控制的关键步骤（由箭头指示）包括hESCs中感染的效率以及肌球体内肌源性转化的效率。
在我们的实验中，我们利用了一种编码BAF60C并携带GFP荧光的慢病毒载体。我们通常在感染BAF60C后72小时进行FACS分选，以富集表达BAF60C的细胞群体。当细胞融合度达到约70-80%时，我们使用MyoD慢病毒进行感染。第一次感染后，细胞通常需要两到三天才能达到该融合度。
图1B显示了外源基因相对于未感染hESC的诱导倍数表达水平。图1C展示了所引入因子在蛋白水平的表达与分布情况。BAF60C的表达通过GFP荧光显示，而MyoD的表达则通过MyoD抗体免疫荧光检测。我们将第0天定义为开始将感染的hESC分化为类胚体聚集体的日期。在DM培养基中培养15天后，取部分肌球体（通常为一整孔）包埋于O.C.T.化合物12中并切片，进行肌源性标志物的免疫荧光染色，以评估肌源性转化效率。图1D展示了在理想的肌源性分化条件下，肌生成素（myogenin）和肌球蛋白重链（myosin heavy chain）的代表性染色结果。肌球体可能呈现不同或异常的形态，可能是与较小肌球体融合所致。从第10天开始，可在肌球体中观察到偶发性收缩现象（见视频1和2）。
<img alt="成肌细胞分化过程；基因表达分析；免疫荧光图谱；干细胞研究。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. A) 从人胚胎干细胞（hESCs）生成肌球体的实验流程示意图。B) 通过qRT-PCR检测携带BAF60C和MyoD基因的病毒转导hESCs（H9-BM）中外源基因的mRNA水平，并以空载转导的hESCs（H9-ctr）为对照，表示为诱导倍数。C) 免疫荧光图像显示MyoD染色（红色）以及由于载体中含有IRES-GFP元件而产生的BAF60C荧光信号（绿色）。D) 对肌球体切片进行免疫荧光染色，检测Myogenin（MYOG）、肌球蛋白重链（MyHC），并用DAPI复染（详见免疫荧光实验细节）。比例尺为100 µm。
<img alt="hESC 准备和心肌球生成过程；细胞分化显微镜图像。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 从感染阶段（第一部分）到分化阶段（第二部分）不同实验步骤中细胞形态的代表性图像。 比例尺为 100 µm。在第 1 天至第 5 天形成的类胚体样结构大多呈圆形（D），而按照 图 1A 所示方案培养超过 15 天的心肌球在形态上不规则，且在培养中表现出异质性；参见 E 和 F 中的两个示例。

本文介绍一种基于表观遗传重编程的实验方案，可将人类胚胎干细胞（hESCs）定向诱导为均一的骨骼肌前体细胞群体；在允许性培养条件下，这些前体细胞可形成具有收缩功能的三维肌纤维簇（肌球体），从而重现人类骨骼肌的生物学特征。

从人类胚胎干细胞（hESCs）生成均一且数量充足的骨骼肌细胞群体是细胞治疗……所必需的

本实验的总体目标是生成由人胚胎干细胞衍生的骨骼肌细胞组成的肌球体（myos spheres），即类似胚状体（EB）的结构。该过程通过使用慢病毒感染细胞并表达Baf60C来实现细胞重编程。实验的第二步是用第二种病毒——MyoD慢病毒——感染相同的细胞。随后，将感染的细胞在含血清的培养基中诱导形成类似胚状体（EB）的聚集体，持续五天。接着，将EB培养基更换为无血清的分化培养基，聚集体继续培养两周，发育为肌球体（myos spheres）。最后，利用免疫荧光技术对OCT包埋的聚集体切片进行可视化观察。该技术的主要优势在于能够高效地诱导骨骼肌细胞分化，且与来源于间充质或中胚层前体细胞的方法类似，无需进行因子分选，因此适用于三维培养系统。在感染前一天，向六孔板中的人胚胎干细胞培养基中加入人胚胎干细胞克隆与复苏添加剂，稀释1000倍，使其终浓度为2微摩尔。次日，用高滴度的Bath-60 CGFP慢病毒感染人胚胎干细胞。首先，通过加入1毫升胰蛋白酶并孵育5分钟，将一个孔中的细胞解离为单细胞悬液。随后收集悬液并转移至15毫升离心管中。加入9毫升已配制的培养基，同时等待将1毫升mt.SIR, one中的细胞在1,200 RPM下离心5分钟。加入终浓度为每毫升6微克的poly brain以及终浓度为2微摩尔的人胚胎干细胞恢复添加剂。然后将细胞重悬于该溶液中，并转移至一个6孔低吸附培养板的单个孔中。接着以感染复数为1亿的浓度加入60°C浓缩病毒。将培养板与病毒一起孵育3小时。然后收集细胞，并将其分装到两个经基质胶包被的培养板孔中。向每孔加入2 mL的mt、SIR培养基，其中一种添加2 µM的补充物，随后在37°C条件下培养过夜。次日，更换为新鲜培养基。感染开始48小时后，细胞似乎已经出现聚集现象。通过检测荧光来评估感染效率。持续每天更换培养基，直至细胞达到80%融合度，然后使用相同方案将细胞解离并再次用myo D病毒转导细胞。每天更换培养基，维持感染的细胞，直至在本次生长点前一天达到80%汇合度。将MES以每平方厘米1000个细胞的密度接种于基质胶包被的培养板上，以将感染的细胞传代至MES板。第二天。使用三联ALI解离细胞，并将细胞转移至15毫升离心管中。加入9毫升人胚胎干细胞培养基，离心沉淀细胞。在1,200 RPM条件下离心5分钟。重悬，将沉淀的细胞重悬于6毫升新鲜的人胚胎干细胞培养基中。现在从两块滋养层细胞培养板中移除培养基，并将感染后的细胞加入其中。将细胞孵育数天。当细胞融合度达到80%时，弃去全部培养基，加入1毫升胶原酶IV。在37摄氏度下孵育5分钟后，每毫升加入1毫克胶原酶。用一毫升人胚胎干细胞培养基替换胶原酶。然后在解剖显微镜下，使用10毫升移液器吸头刮下细胞集落，将集落转移至15毫升离心管中，静置使其沉降。三分钟后，吸去上清液，并将细胞重悬于人胚胎干细胞培养基中。然后以1:4的比例将细胞接种至甲醇处理的培养板中。感染的细胞需达到较高数量，并形成高质量的克隆集落，方可进行此步骤。吸去每孔中的培养基，加入1毫升胶原酶IV。以每毫升一毫克的浓度加入，与之前相同，五分钟后用 EB 培养基替换以终止胶原酶反应。然后迅速在显微镜下刮取集落。使用 10 毫升移液器吸头，可将细胞解离成小的细胞团块。将这些细胞团块收集到一个15毫升离心管中，静置约3分钟后，吸去上清液，用3毫升EB培养基重悬细胞，然后将全部细胞转移至一个6孔低吸附培养板的单个孔中。将培养板置于培养箱中过夜培养，次日观察是否存在较大的细胞集落团块。如果发现有细胞团块，可通过将细胞悬液反复吹打通过5毫升移液管数次来分散。若存在大量游离的单个细胞，则通过沉降法收集细胞团块，并更换为新鲜的EB培养基。培养5天后每隔一天更换一次培养基。收集细胞聚集体，加入2毫升PBS洗涤一次，静置使细胞在常重力条件下沉降。随后弃去PBS，每孔加入3毫升DM培养基，在接下来的15天培养期间将细胞返回原培养板孔中继续培养。每三天更换一次培养基。在此期间，将形成中胚球。人类胚胎干细胞被携带GFP荧光的bath 60 C病毒感染。72 小时后，对细胞进行分选。表达 BAF60C 的细胞培养至约 75% 汇合度，然后用 MyoD 慢病毒进行感染。通过定量实时 PCR 检测感染细胞中外源基因的表达。检测了蛋白水平的表达和分布情况。其中，GFP 代表 baf60c 的表达，使用肌细胞生成素 D（myo D）抗体检测 myo D 的表达。在人胚胎干细胞开始形成类胚体聚集体 15 天后进行观察。部分肌球体被包埋在OCT包埋剂中并进行切片，切片对成肌细胞和肌球蛋白重链标志物呈阳性染色。从第10天开始，可观察到肌球体中出现零星的收缩现象。一些肌球体呈现出不同或异常的形态，可能是由于肌球体之间发生融合所致。该技术将推动疾病建模与治疗领域的研究，因为肌球体可由患有不同肌肉疾病的患者的多能干细胞生成。因此，肌球体为药物筛选和疾病发病机制研究提供了合适的疾病模型。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

Myospheres的产生从人类胚胎干细胞通过表观遗传修饰

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利用转录因子重编程小鼠胚胎成纤维细胞以诱导造血程序

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通过表观遗传重编程由人胚胎干细胞生成肌球体

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