Name: 半自动适应循环肿瘤细胞（CTC）分析临床和临床前研究中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 学习使用CellSearch系统检测和表征人类及小鼠异种移植血液中的循环肿瘤细胞（CTC）。该方法通过免疫磁分选和荧光标记实现CTC富集与计数，为肿瘤靶向治疗选择提供可靠的临床前研究工具。

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本研究得到了安大略癌症研究所（#08NOV230）、加拿大创新基金会（#13199）、前列腺癌加拿大基金会、强生肿瘤学公司、伦敦地区癌症项目以及伦敦卫生科学基金会通过John和Donna Bristol的捐赠（资助对象：A.L.A.）的资助。L.E.L. 获得弗雷德里克·班廷和查尔斯·贝斯特加拿大研究生奖学金博士奖项的支持。A.L.A. 获得加拿大健康研究院（CIHR）新研究员奖以及安大略省研究与创新部早期研究员奖的支持。

本文所述所有人类研究均在获得西安大略大学人类研究伦理委员会批准的方案下进行。所有动物研究均遵循加拿大动物护理委员会的建议，并在获得西安大略大学动物使用小组委员会批准的方案下开展。
1. 使用 CSS 从患者血液样本中进行标准 CTC 计数
1. 人类血液样本的采集及在制备仪器上的处理前准备
<ol>
	<li>采用标准的无菌静脉采血技术，将至少8.0 ml的人类血液采集至10 ml CellSave管（以下简称CTC保存管）中，该管含有乙二胺四乙酸（EDTA）及一种专有的细胞保存剂。采集后轻轻倒置管体5次，以防止血液凝固。样本可立即处理，或在室温下保存最多96小时。</li>
	<li>从冰箱中取出CSS试剂，在使用前使其恢复至室温。</li>
	<li>使用一次性10 ml移液管和自动移液器，从CTC保存管中吸取7.5 ml血液，并缓慢将血液加入已正确标记的制备仪器处理管中。</li>
	<li>向每个样品中加入 6.5 ml 稀释缓冲液。通过倒置样品 5 次进行混匀。以 800 × g 离心 10 分钟，离心时使用刹车 &#34;关闭&#34; 样本处理必须在制备后1小时内完成。按照样本制备仪上的屏幕提示，将所有患者样本加载到系统中进行处理。</li>
</ol>
2. 处理前在制备仪上进行对照制备
<ol>
	<li>轻轻涡旋震荡对照管，并倒置5次以混匀。</li>
	<li>小心取下对照管的管盖，将一支倒置的样本制备仪处理管置于去盖的对照管上方。迅速将对照管与处理管一同倒转，将内容物倒入处理管中。倒置状态下，轻弹对照管管壁，以释放残留液体。</li>
	<li>小心将倒置的对照管从处理管上取下，确保无液体损失，并将其放置一旁。使用1,000 μl移液器吸取管内及管盖中残留的液体，轻柔地转移至处理管中。</li>
	<li>根据样本制备仪屏幕上的提示，将对照样品加载至系统中进行处理。</li>
</ol>
3. 在分析仪器上扫描样品
<ol>
	<li>按照制备仪器上的屏幕提示，将所有样本从系统中卸载。将每个磁力装置卡盒松松地盖上盖子，并用手或实验台轻敲磁力装置，以释放卡盒边缘附着的气泡。待所有气泡完全去除后，将卡盒盖子拧紧，将磁力装置平放，并在室温下避光孵育至少20分钟。样本必须在制备后24小时内完成扫描。</li>
	<li>打开分析仪器并启动光源。待光源预热完成后（约15分钟），将系统验证卡盒加载到分析仪器上，并选择QC Test选项卡。按照屏幕提示执行必要的质量控制步骤。</li>
	<li>将样本加载到分析仪器上，并选择Patient Test选项卡。制备仪器中保存的所有信息将被显示。点击Start以启动样本扫描。系统将对磁力装置卡盒进行粗略对焦和边缘检测。</li>
	<li>根据需要使用方向键调整所有边缘。选择Accept。系统将进行精细对焦并开始样本扫描。</li>
	<li>完成对照样本扫描后，应使用预定义的标准对高浓度（CK+DAPI+CD45-APC+）和低浓度（CK+DAPI+CD45-FITC+）加标细胞的结果进行验证。完成患者样本扫描后，应依据预定义的CTC标准（CK+DAPI+CD45-）对捕获的循环肿瘤细胞（CTC）结果进行审核。</li>
</ol>
2. 使用 CSS 对用户自定义标志物进行 CTC 表征
1. 自定义标记物的制备与仪器初始化
<ol>
	<li>使用 Bond 一抗稀释液，按照以下公式将目标抗体稀释至所需浓度，并加入标记试剂杯中。其中工作浓度是指抗体加入样本后的最终浓度，而储备浓度是指抗体在试剂杯中的浓度。对于多个样本，请根据表1中的说明调整抗体体积。将标记试剂杯置于试剂盒的位置1，并将试剂盒装入 CSS 系统。 储备浓度 = (工作浓度 × 850 μl) / 150 μl 
	</li>
	<li>采集血液，按照上述使用 CSS 从患者血液样本中进行标准 CTC 计数方案制备样本并加载至前处理仪器。为启用自定义标记物添加，在仪器提示时选择用户自定义检测。输入标记物名称后选择保存。当样本加载到仪器上时，操作人员将被提示通过选择是或否来确定哪些样本需要添加自定义标记物。</li>
</ol>
2. 在分析仪器上扫描用户自定义标记物
<ol>
	<li>打开分析仪器，初始化光源，并按照第3.2节所述进行质量控制和系统验证 使用CSS对患者血液样本进行标准CTC计数 实验方案</li>
	<li>将样品加载到分析仪器上并选择 设置 选项卡。要初始化 FITC 通道，请选择 CellSearch 循环肿瘤细胞 作为 试剂盒编号 在……之下 测试方案 部分。在此菜单中，选择 CTC 研究，点击 编辑 按钮，并根据需要设置曝光时间。使用CSS CTC试剂盒时，建议曝光时间不超过1.0秒，以避免增加向其他用于CTC鉴定的荧光通道的串色。</li>
</ol>
3. 标准CSS方案在临床前小鼠模型中应用的调整
**改编自 Veridex 小鼠/大鼠 CellCapture 试剂盒（已不再 commercially available）
1. 小鼠血液采集与保存
<ol>
	<li>采血前，将约 30 μl 的 0.5 M EDTA 在 22 G 针头内来回推动，使针座中保留少量 EDTA。</li>
	<li>从先前注射了人源肿瘤细胞的小鼠中采集至少 50 μl 的小鼠血液 通过 原位、尾静脉或心脏内注射途径。通过隐静脉采血（用于系列循环肿瘤细胞分析）或心脏穿刺采血（用于终点循环肿瘤细胞分析）。拔出针头，将血液注入1 ml含EDTA的微量采血管中。通过倒置或轻弹管壁混匀，防止血液凝固。采血后可立即处理，或加入等体积CytoChex细胞保存液后于室温保存最多48小时。</li>
</ol>
2. CTC 富集
<ol>
	<li>从冰箱中取出CSS试剂，使用前使其恢复至室温。</li>
	<li>将相当于50 μl的全血转移至一支12 mm x 75 mm的流式细胞术管中。向每个样本中加入500 μl稀释缓冲液，冲洗管壁上残留的血液。如有必要，可进行短暂离心以收集残留血液。</li>
	<li>轻轻涡旋混匀抗EpCAM磁性液，用移液器将25 μl直接加入每个样本中。再加入25 μl捕获增强试剂，轻轻涡旋混匀。室温孵育15分钟。</li>
	<li>将样本管放入磁铁中孵育10分钟。样本管仍置于磁铁中时，使用玻璃移液器小心吸除上清液，避免触碰靠近磁铁一侧的管壁，并弃去液体。</li>
</ol>
3. 循环肿瘤细胞染色
<ol>
	<li>从磁力架上取下样本管，加入50 μl核酸染料、50 μl染色试剂、1.5 μl抗小鼠CD45-APC、5.0 μl抗人HLA-Alexa Fluor 488以及100 μl通透试剂，重悬细胞。对于多个样本，可将上述试剂预先混合，每管加入206.5 μl混合液。轻轻涡旋混匀，室温避光孵育20分钟。</li>
	<li>加入500 μl稀释缓冲液，轻轻涡旋混匀，将样本管放入磁力架中，孵育10分钟。样本管仍置于磁力架期间，使用玻璃移液管小心吸取残留液体，避免触碰靠近磁铁一侧的管壁，并弃去液体。将样本管从磁力架上取下，加入350 μl稀释缓冲液重悬细胞，轻轻涡旋混匀。</li>
</ol>
4. 磁性装置加载
<ol>
	<li>使用凝胶加样枪头，将样本管中的全部液体小心转移至磁力装置中的层析柱内。加样时枪头应置于层析柱底部，并在样品加入过程中缓慢上移枪头。</li>
	<li>待全部样品转移完成后，将磁力装置卡盒的盖子轻轻盖上，并用手或实验台轻敲磁力装置，以释放卡盒边缘附着的气泡，具体操作如第3.1节所述。 使用CSS对患者血液样本进行标准CTC计数.</li>
	<li>使用无菌的22 G针头，将气泡夹在针尖斜面与 cartridge 边缘之间，以排除所有气泡。待所有气泡完全去除后，牢固盖上 cartridge 盖子，将磁力装置水平放置，并在避光条件下孵育至少10分钟。样本须在制备后24小时内完成扫描。</li>
</ol>
5. 在分析仪器上扫描手动分离的样品
<ol>
	<li>打开分析仪器，启动光源，并按照第3.2节所述进行质量控制和系统验证 使用CSS对患者血液样本进行标准CTC计数 实验方案</li>
	<li>将样品加载到分析仪器上并选择 设置 选项卡。通过点击磁性设备数据按钮清除任何已存在的数据 样本制备格式 按钮。启用 FITC 通道，并将曝光时间设置为 1.0 秒，具体操作如第 2.2 节所述。 使用CSS对循环肿瘤细胞进行用户自定义标志物表征.</li>
	<li>点击 患者检测 标签页并选择 编辑 输入样本信息。选择 CellSearch 循环肿瘤细胞 作为 试剂盒编号 和 循环肿瘤细胞研究 作为 测试方案输入星号标示的其余必要信息。 保存 样本信息并点击 开始.</li>
</ol>

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</ol>

作者（A.L.A.）获得了由强生肿瘤公司提供的资助，该公司的母公司强生公司同时拥有强生诊断有限责任公司，后者生产了本文所使用的试剂和仪器。

尽管自2004年CellSearch系统（CSS）问世以来已开发出许多新型CTC技术，但该技术至今仍是市场上唯一获得临床批准的技术，因此被视为当前CTC检测与计数的金标准。本文表明，尽管CSS具有严格的质控标准，但仍可能受到主观判读偏差的影响，且在患者样本中识别CTC与在加标样本中识别CTC存在显著差异。研究识别出六类常见的分歧项，这些分歧项可能导致CTC分类错误。这些分歧项凸显了对每份经该仪器处理的患者样本需由多位评审人员共同判读的必要性。此外，加标样本与患者来源CTC之间的差异表明，任何新型CTC技术都必须在加标样本和患者样本中同时进行验证。同时，这些新技术必须通过加标样本和患者样本的分样本测试，与金标准CSS进行比较，因为仅在加标样本中实现高效的CTC捕获，并不一定反映其在患者样本中的实际捕获效率。
尽管CSS能够对捕获的CTC进行表征，但在高度可定制化的优化方面存在较大局限性。通常情况下，该仪器上可用于优化用户自定义标志物的唯一参数是抗体浓度以及荧光染料暴露于汞灯的时间。这种有限的优化能力在使用CSS处理用户自定义标志物时可能带来问题。本文提出了一种解决方案（此前已有详细描...

据估计，仅在2013年，美国将有580,350人死于癌症，同时将有1,660,290例新发癌症病例被确诊1。其中大多数死亡发生在肿瘤转移之后2。目前尚缺乏有效治疗转移灶的手段，且对转移级联过程的理解仍有限，这使得疾病进展到这一阶段具有极高的致死性。已有研究表明，血液中存在循环肿瘤细胞（CTCs）与转移性疾病相关3。这些细胞极为稀少，其检出已被证实可提示转移性乳腺癌4、前列腺癌5和结直肠癌6患者的总体生存率。在这些患者中，每7.5 ml血液中检测到≥5个（乳腺癌和前列腺癌）或≥3个（结直肠癌）CTCs，提示预后较差，相比之下，相同血量中CTCs数量较少或未检出的患者预后较好。此外，在治疗过程中或治疗后CTCs数量的变化已被证明可作为治疗反应的预测指标，且通常比当前常用的技术更早提供信息7-10。
据估计，在转移性癌症患者中，循环肿瘤细胞（CTC）的出现频率约为每105-107个外周血单个核细胞中1个CTC，而在局部病灶患者中，该频率可能更低（约每108个细胞中1个）。由于这些细胞极为稀少，准确且可靠地检测和分析CTC具有较大挑战性11。已有多种方法（此前已有综述12-14）被用于富集和检测这些细胞，其原理主要基于CTC与血液其他成分之间的特性差异。通常情况下，CTC计数包含两个步骤：富集和检测。传统上，富集步骤依赖于CTC的物理特性差异（如细胞大小、密度、可变形性）或特异性蛋白标志物的表达（即 上皮细胞黏附分子[EpCAM]、细胞角蛋白[CK]）。在完成富集后，可通过多种方式对CTC进行检测，其中最常见的是基于核酸的检测方法和/或流式细胞术。这些策略各具特点，拥有不同的优势与局限性，但均缺乏标准化，而标准化是进入临床应用所必需的前提。因此，CellSearch系统（CSS）被开发出来，旨在利用荧光显微镜和基于抗体的技术，为人体血液中稀有CTC的检测与计数提供一种标准化的方法4-6。目前，该平台被认为是CTC计数的金标准，也是唯一获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床的技术15。
细胞筛选系统（CSS）是一个由两个组件构成的平台，包括：（1） CellTracks AutoPrep 系统（下文简称样本制备仪器），用于自动化处理人血液样本；以及 （2） CellTracks Analyzer II（下文简称分析仪器），用于在样本制备完成后对其进行扫描。为了将循环肿瘤细胞（CTC）与污染的白细胞区分开，制备仪器采用基于抗体介导的、以铁流体为基础的磁性分离方法，并结合差异性荧光染色技术。首先，系统使用与铁纳米颗粒偶联的抗 EpCAM 抗体对 CTC 进行标记。随后，将样本置于磁场中孵育，并吸除所有未标记的细胞。被选中的肿瘤细胞被重新悬浮后，再与差异性荧光染料共同孵育，该染料包含荧光标记的抗体和一种细胞核染色试剂。最后，将样本转移至一种名为 MagNest 的磁性 cartridge（下文简称磁性装置）中，并利用分析仪器进行扫描。
采用分析仪器，使用不同的荧光滤光片对制备好的样本进行扫描，每种滤光片均针对相应的荧光标记粒子进行了优化，物镜倍数为10倍。循环肿瘤细胞（CTC）被鉴定为表达抗EpCAM抗体、抗广谱细胞角蛋白-藻红蛋白（PE）（CK8、CK18和CK19）以及细胞核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的细胞。相反，污染的白细胞则被鉴定为表达抗CD45-别藻蓝蛋白（APC）和DAPI的细胞。扫描完成后，系统通过计算机识别出潜在的肿瘤细胞图像并呈现给用户。用户需根据上述定义的参数和差异染色特征，对这些图像进行定性分析，以判断哪些事件属于CTC。
除了提供循环肿瘤细胞（CTC）计数的标准化方法外，CSS 还可根据感兴趣的蛋白标志物对 CTC 进行分子表征。这种检测可在单细胞水平上进行，使用异硫氰酸荧光素（FITC）荧光通道，而该通道并非用于 CTC 鉴定所必需16。尽管该平台具备分子表征的能力，但相关实验方案的开发与优化过程尚未明确。制造商已开发出三种可用于 CSS 的商业化标志物，分别为表皮生长因子受体（EGFR）、人表皮生长因子受体 2（HER2）和胰岛素样生长因子 1 受体（IGF-1R）。多个研究团队已将 HER2 分析与 CSS 相结合，以展示 CTC 表征在指导临床决策以及可能改变现有治疗指南方面的潜力。例如，Fehm 等17&#160;发现，约三分之一 HER2 阳性原发性肿瘤的乳腺癌患者存在 HER2+ CTC。此外，Liu 等18&#160;最近报道，在 HER2+ 转移性乳腺癌患者中，高达 50% 的患者并未检测到 HER2+ CTC。曲妥珠单抗（Herceptin）是一种可干扰 HER2 受体的单克隆抗体，已被证实对 HER2 表达水平足够的肿瘤患者具有显著疗效，是 HER2+ 原发性肿瘤患者常用的治疗手段19–21。然而，这些研究提示，曲妥珠单抗的使用可能尚未达到最优，而 CTC 的分子表征可能有助于预测治疗反应。最终，CTC 表征有望提升个体化医疗水平。
循环肿瘤细胞（CTC）研究的独特之处在于其主要采用了一种从床旁到实验台（bedside-to-benchtop）的研究路径。与传统的从实验台到床旁（benchtop-to-bedside）的研究方法不同，后者往往需要多年时间才能影响患者诊疗，而该方法使CTC能够迅速进入临床应用。然而，由于对CTC生物学基础的理解尚不充分，临床医生在制定治疗决策时仍对其分析结果持谨慎态度。因此，必须采用合适的转移性肿瘤小鼠临床前模型以及配套的CTC分析技术，以深入探究这些尚未解决的问题。总体而言，目前用于研究转移级联过程的临床前模型主要有两种&#160;类型：(1) 自发性转移模型，可用于研究转移级联过程中的所有步骤；以及 (2) 实验性转移模型，仅可用于研究转移过程后期的步骤，例如血管外渗和继发性肿瘤形成22。自发性转移模型通常将肿瘤细胞注射至合适的原位部位（例如，将前列腺癌细胞注射至前列腺以研究前列腺癌），随后给予足够时间使其形成原发性肿瘤，并自发转移至骨、肺和淋巴结等继发部位。相比之下，实验性转移模型则是将肿瘤细胞直接注射入血液循环系统（例如，通过尾静脉或心脏内注射，使细胞靶向特定组织），从而跳过了内渗和向继发器官播散的初始阶段22。迄今为止，在体内模型系统中开展的大多数CTC分析均采用基于流式细胞术23的方法，或经改造的人源CTC检测技术（例如 AdnaTest）24。尽管这些方法具有一定价值，但均无法充分反映采用金标准CellSearch系统（CSS）进行CTC计数的结果。鉴于CSS已获得临床批准、具有标准化流程并被广泛使用，若能开发一种适用于体内建模的CTC捕获与检测技术，且该技术采用与CSS相同的样本制备、处理及鉴定标准，则将具有显著优势，因其结果可与患者样本结果直接比较。然而，由于CSS自动化平台对样本体积有最低要求，无法用于处理微量血液样本。此外，Eliane 等25&#160;的前期研究已表明，样本中若混入小鼠上皮细胞（这些细胞同样符合标准CTC定义 [EpCAM+CK+DAPI+CD45-]），可能导致小鼠鳞状上皮细胞被误判为CTC。为解决上述问题，研究人员开发了一种改进技术，该技术结合了CSS CTC试剂盒的试剂与手动分离流程。在检测体系中加入FITC标记的人类白细胞抗原（HLA）抗体，可有效区分人源肿瘤细胞与小鼠鳞状上皮细胞。
本文描述了用于处理患者血液样本的标准、商业化开发并优化的CSS方案，以及可能遇到的常见问题，包括可能导致循环肿瘤细胞（CTC）错误分类的不一致因素。此外，还介绍了CSS检测方法的定制化应用，用于分析捕获的CTC中用户自定义的蛋白质特征，以及一种可比较的改进型CSS技术，该技术可用于在转移性小鼠模型中从小体积血液样本中富集和检测CTC。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD44-FITC</td><td>BD Pharmigen</td><td>555478</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD44-PE</td><td>BD Pharmigen</td><td>555479</td><td></td></tr><tr><td>抗人 HLA-Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td>311415</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Bond 一抗稀释液</td><td>Leica</td><td>AR9352</td><td></td></tr><tr><td>CellSave 保存管</td><td>Veridex</td><td>952820 (20 支装) 79100005 (100 支装)</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch CTC 对照试剂盒</td><td>Veridex</td><td>7900003</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch CTC 试剂盒</td><td>Veridex</td><td>7900001</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch CXC 对照试剂盒</td><td>Veridex</td><td>7900018RUO</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch CXC 试剂盒</td><td>Veridex</td><td>7900017RUO</td><td></td></tr><tr><td>仪器缓冲液</td><td>Veridex</td><td>7901003</td><td></td></tr><tr><td>Streck 细胞保存剂（又称 CytoChex）</td><td>Streck</td><td>213350</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml 血清移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;micro;l 移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;micro;l 移液器吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm 流式管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l 加样吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l 移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 G 针头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 英寸一次性巴斯德移液管</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 血清移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>毛细血管采血管（EDTA）</td><td>BD Microtainer</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch 分析仪 II</td><td>Veridex</td><td>9555</td><td>包含磁铁和验证卡盒</td></tr><tr><td>CellSearch AutoPrep 系统</td><td>Veridex</td><td>9541</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagCellect 磁力架&amp;nbsp;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAG997</td><td></td></tr><tr><td>小型乳胶吸球</td><td>VWR</td><td>82024-550</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

循环肿瘤细胞（ctc）半自动化检测技术在临床与临床前研究中的应用转化

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

绝大多数癌症相关死亡发生在转移性疾病出现之后。这一致死性极高的疾病阶段与循环肿瘤细胞（CTCs）的存在密切相关。这些稀有细胞已被证实对转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌具有重要的临床意义。目前临床检测和计数CTCs的金标准是经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的CellSearch系统（CSS）。本文概述了该平台所采用的标准操作流程以及两种&#160;用于患者循环肿瘤细胞蛋白质表征的用户自定义标记物优化详细流程的额外适配方案，以及采用标准CSS试剂在极少量血液样本中捕获循环肿瘤细胞的可比方案，用于研究 体内 转移的临床前小鼠模型。此外，还强调了健康供体血液中添加组织培养细胞与患者血液样本之间在CTC质量上的差异。最后，概述了若干常导致CTC分类错误的不一致项目。综上所述，这些实验方案将为关注转移及CTC相关临床前与临床研究的平台使用者提供有价值的参考资源。

标准CTC计数检测
CSS 的敏感性和特异性已在文献中得到充分记录。然而，为了验证 CTC 回收率的一致性，采用标准 CSSCTC 方案在 CSS 上处理了加标（1,000 个 LNCaP 人前列腺癌细胞）和未加标的人类健康志愿者血液样本。正如预期，未加标样本中未检测到 CTC，检出率为 0.00±0.00%；加标样本的 CTC 回收率为 86.9±4.71% （图1A）加标样本获得的CSS图像质量理想，循环肿瘤细胞（CTCs）易于与非CTCs区分。然而，在处理癌症患者样本时，CTCs的识别略具挑战性，许多细胞体积较小，且较难与非CTCs区分。 （图1B）此外，在审阅患者样本时，发现了6类事件，这些事件在评审者之间通常存在不一致。 （图1C）这6个类别包括， (1) 未达到的小事件 4 µm CTC分类的尺寸要求； (2) CK 和/或 DAPI 染色较弱的样本； (3) 由强CK-PE...

循环肿瘤细胞（CTCs）在多种转移性癌症中具有预后价值。本文描述了作为金标准的CellSearch系统（CSS）CTC计数平台，并强调了常见的分类错误。此外，还介绍了两种&#160;经过改进的实验方案，可用于利用该技术对CTC进行用户自定义标志物表征，以及在转移性小鼠模型中进行CTC计数。

循环肿瘤细胞（CTC）半自动化检测技术在临床与临床前研究中的应用转化

大多数癌症相关死亡发生在转移性疾病出现之后。这一致死性极高的疾病阶段与……

本实验旨在对人源及小鼠异种移植血液样本中的循环肿瘤细胞进行高灵敏度的检测、计数与表征。首先，从人类和/或小鼠癌症模型中采集血液样本，并通过针对EPCA阳性细胞的阳性富集策略，在污染的白细胞背景中富集循环肿瘤细胞（CTC）。随后，通过CTC与白细胞的差异染色，识别并计数CTC。在实验室中对这些稀有的循环肿瘤细胞进行所需的分子表征，以协助临床中为癌症患者选择靶向治疗方案。利用Cell Search系统获得的结果表明，循环肿瘤细胞（CTC）分析可有效应用于人源和小鼠异种移植血液样本。在Cell Search系统上开发更多用户自定义的循环肿瘤细胞表征方案，最终可能有助于为患者选择靶向治疗。此外，适用于小鼠异种移植模型的类似循环肿瘤细胞（CTC）检测方法将有助于加深我们对这些细胞基本生物学特性的理解。从CTC保存管中采集7.5毫升血液样本，并缓慢转移至处理管中。向每份血液样本中加入6.5毫升稀释缓冲液。颠倒混匀5次，然后在800 × g条件下离心10分钟。对于对照样品的制备，保持制动器处于关闭位置，轻轻涡旋离心管5秒钟，再颠倒混匀5次。随后，取一支倒置的处理管，取下瓶帽，迅速一次性将样品转移。轻轻弹击对照管的管壁，以实现最大程度的样品转移。小心移去倒置的对照管，确保不损失任何液体。收集管内和管盖中剩余的内容物，并轻柔地加入处理管中。按照制备仪器上的屏幕提示，将所有对照样本和患者样本加载到系统中进行处理。按照制备仪器上的屏幕提示，将所有样本从系统中卸下。现在将每个磁力装置卡盒轻轻盖上盖子，并轻敲以释放边缘的气泡。然后牢固盖上滤芯盖子，将磁力装置平放，并在避光条件下孵育至少20分钟。打开分析仪器并启动光源。将系统验证滤芯加载到分析仪器上。选择质控测试选项卡，并按照屏幕上的说明执行必要的质量控制措施。然后，将样本加载到分析仪器上，并选择患者测试选项卡。点击“开始”以启动样本扫描。使用方向键调整所有边缘至合适位置，然后选择“接受”。为制备用户自定义标记物，用Bond一抗稀释液稀释目标抗体。将标记物试剂杯放入试剂盒的第一个位置，并将试剂盒装入细胞搜索系统，以启用自定义标记物添加。当制备仪器提示时，选择用户自定义检测。输入标记物名称，然后选择保存。样品处理完成后，将样品加载到分析仪器上，并选择设置选项卡。为初始化 ZI 通道，请在测试方案部分选择细胞搜索 CTC 作为试剂盒 ID。在此菜单中，选择 CTC 研究。点击编辑按钮，并根据需要设置曝光时间。采集至少50微升小鼠血液至1毫升EDTA微量保存管中，通过倒置混匀以防止凝血。为富集循环肿瘤细胞（CTC），将相当于50微升全血的样本转移至流式细胞术管中。向每个样本中加入500微升稀释缓冲液。轻轻涡旋将血液从管壁上冲洗下来，使抗化学发光液体充分混匀，然后向每个样本中加入25 µL。同时，向每个样本中加入25 µL捕获增强试剂。轻轻涡旋混匀样本，并在室温下孵育15分钟。接下来，将样本管放入磁力架中静置10分钟。小心吸取残留液体，避免触碰靠近磁铁一侧的管壁，并弃去液体。将样本管从磁力架上取下，加入50 µL核酸染料、50 µL染色试剂、1.5 µL抗人CD45 APC、5.0 µL抗人HLA-DR PE-Cy7和100 µL透化试剂，轻轻涡旋混匀，避光孵育20分钟。室温下。然后加入 500 µL 稀释缓冲液并涡旋混匀。将样本管轻轻放入磁力架中，静置 10 分钟。小心吸除残留液体并弃去。然后将沉淀物重悬于 350 µL 稀释缓冲液中，轻轻涡旋混匀。用凝胶上样枪头吸取样品，并将其转移至磁力装置；操作时从 cartridge 底部开始，边加样边缓慢抽出枪头。去除气泡后，使用无菌的22号针头牢固地盖紧滤 cartridge，将磁力装置水平放置，并在避光条件下孵育至少10分钟。将样本加载到分析仪器上，选择设置选项卡。为清除已有数据，请点击格式化样本按钮。选择细胞搜索CTC作为试剂盒编号，CTC研究作为检测方案。在此菜单中，确保已选择适当的曝光时间。选择患者检测标签页，然后选择编辑。输入样本信息时，请按提示填写其余必要的信息。然后保存样本信息并点击“开始”进行验证。循环肿瘤细胞回收实验中，使用细胞搜索系统及标准的细胞搜索CTC方案，对 spiked 的人前列腺癌细胞以及来自健康志愿者供体的未spiked人血样进行了处理。如预期所示，未加标本样品中无循环肿瘤细胞。加标本样品的CTC回收率为86.9%。从加标本样品获得的这些细胞搜索图库图像质量优良，CTC易于与非CTC区分。在癌症患者中，CTC的鉴定略具挑战性，许多细胞体积较小，且较难与非CTC区分。此外，在审阅患者样本时，观察者之间常出现六类判断不一致的事件，分别为微小事件、ZI 阳性事件、细胞角蛋白或 DAPPY 染色微弱、图像像素化、细胞角蛋白串色以及过大或不重叠的 dpi。在使用已知对肿瘤干细胞标志物 CD44 显示 98±4% 阳性率的细胞系开发用户自定义标志物时，必须考虑 CTC 试剂盒的选择。基于 FCI 的 CTC 试剂盒仅将 69.3% 的 CTC 分类为 CD44 阳性。然而，使用基于 PE 的 CX C 试剂盒时，98.8% 的 CTC 被分类为 CD44 阳性。对任何用户自定义标记物的适当优化，均需使用该标记物的高抗原密度、低抗原密度及阴性细胞系进行验证，以确保检测的灵敏度和特异性。本实验评估了经调整的小鼠细胞搜索方案的灵敏度和特异性。正如预期，使用两种检测方法对 spiked 样本进行检测均未发现 CTCs，并且 CTC 回收率。使用改良的小鼠试剂盒和标准自动化系统获得的结果具有可比性，而采用手动改良小鼠方案所获得的图像与使用标准自动化技术所观察到的图像无差异。在该实验中加入HLA-Fits E可确保轻松区分人源肿瘤细胞与小鼠鳞状上皮细胞、对掺入的小鼠血液样本进行连续稀释，并分析预期细胞数量与回收细胞数量之间的相关性。验证该技术在分离少量循环肿瘤细胞（CTC）时的灵敏度与标准CSS方案相当。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从人源及人源化异种移植小鼠血液样本中进行自动化与手动CTC富集操作。此外，您还应更深入地理解设计和优化循环肿瘤细胞（CTC）表征方案所需的各个步骤，以便将其与细胞搜索系统联合使用。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

半自动适应循环肿瘤细胞（CTC）分析临床和临床前研究中的应用

从癌症患者血液中分离循环肿瘤细胞，且不造成细胞损伤。通过使用E-选择素的双分子层表面以及针对上皮标志物的抗体，实现肿瘤细胞的分离。纳米管涂层可特异性促进癌细胞黏附，从而获得较高的捕获纯度。...

快速分离患者血液样本中具有活性的循环肿瘤细胞

本视频介绍了循环肿瘤细胞（CTC）免疫荧光检测技术，该技术用于表征非小细胞肺癌患者样本中循环肿瘤细胞上的生物标志物。该检测可用于监测肿瘤及免疫反应的动态变化，这些变化可能反映患者对化疗、放疗以及潜在的免疫治疗的响应情况。...

循环肿瘤细胞免疫荧光检测：一种表征循环肿瘤细胞的技术

循环肿瘤细胞（CTCs）已被证实对肿瘤转移具有重要作用。本文介绍了一种从同基因型小鼠肝细胞癌（HCC）转移模型的全血中分离并扩增循环肿瘤细胞（CTCs）的方法。...

从小鼠癌症模型中分离与扩增循环肿瘤细胞

本文介绍了一种利用聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PIPAAm）包被的微滤膜有效捕获活体循环肿瘤细胞（CTC）并实现温度响应性释放的实验方案。该方法可从患者血液中捕获CTC，并随后释放具有活性的CTC，用于后续的芯片外培养、分析与表征。...

从血液中捕获并释放可存活的循环肿瘤细胞

本方案旨在从含有非靶标背景细胞的混合物中分离并制备稀有靶细胞，用于单细胞水平的分子遗传学表征。所获得的DNA质量与未经处理的单细胞相当，适用于单细胞分析（包括基于筛查和靶向分析的应用）。...

靶细胞预富集与全基因组扩增用于单细胞下游分析

本文介绍了一种整合性工作流程，用于鉴定循环肿瘤细胞（CTCs）的表型和分子特征。我们将活细胞免疫染色与单个及成簇CTCs的机器人显微操作相结合，并利用基于单细胞的技术进行后续分析，评估其定植转移的能力。...

循环肿瘤细胞的显微操作用于下游分子分析及转移潜能评估

循环肿瘤细胞（CTC）的表征是转化研究中的一个热门课题。本方案描述了一种半自动免疫荧光（IF）检测方法，用于对非小细胞肺癌（NSCLC）患者样本中的CTC进行PD-L1表征及计数。...

通过免疫荧光法对非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞进行半自动PD-L1表征与计数

培养循环肿瘤细胞（CTCs）可通过检测特定标志物表达、评估耐药性以及定植肝脏等能力，从而对癌症进行更深入的功能学表征。总体而言，CTCs培养有望成为一种有前景的临床工具，用于个体化医疗，以改善患者的治疗预后。...

循环肿瘤细胞系：基础与转化研究的创新工具

临床微流控芯片是一种重要的生物医学分析技术，可简化临床患者血液样本的预处理，并对循环肿瘤细胞（CTCs）进行免疫荧光染色 原位...

用于分离多种循环肿瘤细胞的临床微流控芯片平台

本实验方案描述了一种实验工作流程，可实现 离体...

经预处理肿瘤细胞异基因共培养体系中人类T细胞活性的分析

循环肿瘤细胞（CTCs）对于癌症进展和转移的研究至关重要。本文介绍了一种高通量、一体化的CTC富集与单个CTC测序方案，在提高捕获效率和CTC纯度的同时，降低了污染风险和测序成本，从而推动了精准肿瘤学研究及临床应用的发展。...

基于微流控的高通量循环肿瘤细胞分选与单细胞测序技术

学习使用CellSearch系统检测和表征人类及小鼠异种移植血液中的循环肿瘤细胞（CTC）。该方法通过免疫磁分选和荧光标记实现CTC富集与计数，为肿瘤靶向治疗选择提供可靠的临床前研究工具。

循环肿瘤细胞（CTC）半自动化检测技术在临床与临床前研究中的应用转化

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