in vivo 中通过多聚核糖体分级分离研究中枢神经系统翻译组

以下实验的总体目标是鉴定原代中枢神经系统组织中正在翻译的mRNA。该方案首先在环己酰亚胺存在下从小鼠中提取相关组织，随后进行机械匀浆，并在去垢剂中裂解。

接下来进行髓鞘漂浮，以去除会掩盖多核糖体图谱的组织中的脂肪类脂成分。含有核糖体及其相关mRNA的沉淀物在蔗糖梯度中沉降，以分离与核糖体结合的mRNA。随后对梯度进行分馏，获得多核糖体图谱，其中每个峰代表与特定数量核糖体或核糖体亚基结合的mRNA。

随后纯化含有多聚核糖体的组分，以获得可用于下游应用的RNA。该技术相较于现有方法的主要优势在于，它能够使用少量的中枢神经系统组织进行操作，并且在下游应用中具有高度的灵活性。该方法有助于回答神经系统翻译研究中的关键问题，例如不同条件下翻译水平的变化，以及翻译调控因子和序列基序的作用。

一般来说，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为体内中枢神经系统（CNS）组织通常有限，且组织中存在的核糖体亚基成分可能掩盖多聚核糖体谱型。对于经HBSS缓冲液（含环己酰亚胺）经心灌注的小鼠，应迅速开始组织提取。从背侧打开颅骨并取出脑组织，将脑组织转移至预冷的缓冲液A中，并立即对脑组织进行切碎处理。

接下来，进行胸段和腰段脊柱的椎板切除术。切除四厘米脊髓组织并转移至预冷的缓冲液A中，置于冰上。将分离的组织切碎以增加其对环己酰的摄取，然后在冰上孵育15分钟。

接下来，使用下置式匀浆器破坏组织，以确保细胞核保持完整。脑组织需用紧密研杵匀浆5次，然后将滤网中的组织转移至离心管中。脊髓组织需先用松散研杵匀浆5次，再用紧密研杵匀浆5次。

现在收集用于总RNA提取的样品，分别取200 µL脊髓组织和400 µL脑组织，迅速冷冻后于-80 °C保存。为去除未破碎的细胞核及组织碎片，将组织在500 ×g下离心10分钟。

收集含有附着核糖体的内质网的上清液，弃去含有细胞核的沉淀。接下来，通过加入NP-40和脱氧胆酸钠去垢剂至终浓度各为1%，裂解内质网膜片段以释放核糖体。将样品置于冰上孵育30分钟。处理神经系统组织的一个难点是，髓鞘及其他富含脂质的成分会干扰多聚核糖体图谱的分析。

为了解决这一问题，必须引入浮力密度梯度离心建模的步骤，以在开始之前去除这些组分。预先将超速离心机的吊桶和转子在 4°C 下预冷。现在将收集的裂解液与 1.22 倍体积的 2 摩尔蔗糖混合。

将每种混合物转移至聚乙烯超速离心管中，并用1.1摩尔蔗糖溶液将管内液体体积补足至10毫升。随后，小心地在管内液体上层覆盖0.9摩尔蔗糖溶液。接着将离心管放入预冷的离心吊桶中，并用缓冲液B平衡各管重量。将平衡后的吊桶装入预冷的转子中，在4摄氏度条件下以100,000 ×g离心3小时。在此过程中，核糖体和RNA将沉淀，而脂质则保留在上清中。

髓鞘漂浮离心后，弃去上清液，用缓冲液 B 溶解含有核糖体的沉淀。然后使用 NanoDrop 仪器测定核糖体溶液在 260 纳米处的吸光度。根据这些数值估算总 RNA 浓度。随后将样品转移至预先制备好的蔗糖梯度上。

注意不要破坏梯度，并设置一个空的梯度作为对照。用样品平衡预冷的离心桶，方法同前。然后在4°C条件下，以285,000 ×g离心一个半小时。

离心机运行期间，准备分馏装置。首先，设置紫外灯灵敏度。然后，将穿管针连接至分馏装置，并通过导管将其与装有60%蔗糖的瓶子相连。

通过中间的蠕动泵，以每分钟1毫升的速度将蔗糖泵入分级器中。检查是否存在引入气泡的漏气点，并拧紧相关密封部位。然后手动将梯度缓冲液泵入紫外检测器，以设定基线。

将样品从超速离心机中小心取出，避免碰撞，然后将其装入分级仪中，用穿刺器刺穿管底。开始泵入60%蔗糖溶液，以置换梯度液，使其流经紫外检测器并进入滴液分配器。在260纳米处记录吸光度曲线。

从滴液分配器中收集20个组分到2毫升离心管中。每个组分收集600 µL，并继续对每个组分的样品梯度进行处理，加入10% SDS使其终浓度为1% SDS，并充分混匀。然后使用酸性苯酚-氯仿提取法分离RNA。

首先加入等体积的室温酸性苯酚氯仿，然后将试管在65摄氏度下加热10分钟。加热后，在通风橱中小心打开小瓶以释放压力。随后在室温下以17,000 ×g离心20分钟，收集水相，水相可能位于蔗糖层上方或下方。

接下来，加入等体积的异丙醇、九分之一体积的醋酸钠以及1微升的糖蓝。在-80摄氏度下沉淀RNA至少1小时，然后通过离心收集沉淀。随后用预冷的80%乙醇洗涤沉淀一次，再次离心收集RNA沉淀，空气干燥后，将沉淀重悬于水中，并进行后续分析。

或者，样品可在负80摄氏度下保存至使用。空白蔗糖梯度在260纳米处显示一定的背景吸收，这是由于DTT的存在所致。在数据分析过程中可减去该背景值，以标准化样品数值；脑组织和脊髓组织的RNA谱图显示出特征性吸收曲线，与小核糖体亚基结合的mRNA沉降于较轻的组分，在谱图中出现较早。

随后是大核糖体亚基以及单个核糖体结合的mRNA，而结合了多个核糖体的mRNA则在后续组分中沉淀。用EDTA处理样品后，多核糖体峰消失，表明沉降谱图是由翻译过程引起的。此外，可将Ribotact和trap等其他方法与该技术联用，以开展针对特定细胞类型的翻译研究。

随着这一进展，该技术为神经生物学领域的研究人员探索翻译调控在神经元发育和疾病中的作用铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从少量中枢神经系统组织中进行多聚体分离，并纯化RNA以用于后续的下游实验应用。