Name: 展现着多药耐药结核分枝杆菌扩增基因芯片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学习多重不对称PCR扩增基因芯片技术，用于检测多药耐药结核分枝杆菌的基因型。该方法将扩增与杂交整合于单一微流控反应室，简化操作流程，适用于资源有限环境，同时保持PCR分析灵敏度与芯片多重检测能力。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助号为 RC3 AI089106。
耐多药结核分枝杆菌（MDR-TB）的核酸由联合国儿童基金会/联合国开发计划署/世界银行/世界卫生组织热带病研究与培训特别规划署（TDR）提供，瑞士日内瓦。
我们感谢美国疾病控制与预防中心的 Tom Shinnick 博士在原型检测中所包含的特定基因和突变方面提供的指导。

对于遵循通用PCR预防措施的实验室而言，按照此处所述，在每个基底上包含多个扩增微阵列和垫圈，并在大型容器中同时批量清洗所有扩增微阵列，操作效率更高。已有可消耗性装置格式可用于完全封闭的扩增子检测中进行扩增后微阵列清洗步骤，相关报道见其他文献30,33。
1. 设置
<ol>
	<li>在适当的生物安全条件下，使用选定的方法从样本中提取和纯化核酸。要求核酸的纯度足以进行不对称多重 PCR 扩增。</li>
	<li>用去污溶液擦拭工作台面和设备，以准备操作区域。</li>
	<li>将扩增试剂置于冰上或冷块中保存。</li>
	<li>标记一个无菌的 1.5 ml 微量离心管用于扩增主混合液，并为每个样本分别标记一个无菌的 0.2 ml 微量离心管。</li>
	<li>试剂解冻后，短暂涡旋振荡，并用小型离心机短时离心将管内物质收集至管底。请勿涡旋 Taq 聚合酶。轻轻弹击管壁混匀，随后用小型离心机短时离心。</li>
	<li>根据表 1中所示的每样本反应体积配制扩增主混合液。为避免移液误差，主混合液的总体积应比待处理样本总数至少多出一个反应体积。注意：主混合液中需额外添加 Taq 聚合酶，其量超过多重 PCR 缓冲液中已提供的部分。只有在所有其他试剂混合完毕并将原装试剂管放回储存前，才向主混合液中加入扩增/抑制对照试剂。</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>每样本体积 (µl)</td>
			<td>终浓度 [ ]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mulitplex PCR Buffer with HotStar Taq Plus</td>
			<td>25</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牛血清白蛋白 (BSA)</td>
			<td>0.55</td>
			<td>0.6 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甲酰胺</td>
			<td>3.8</td>
			<td>7.6%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>额外 Taq 聚合酶</td>
			<td>0.8</td>
			<td>单位/µl （总计 4 单位）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDR-TB 引物混合物</td>
			<td>15.75</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无 RNase 水 H2O</td>
			<td>2.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>扩增/抑制对照</td>
			<td>1</td>
			<td>5.0 fg/µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计</td>
			<td>49</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 耐多药结核分枝杆菌扩增微阵列主混合液组成。
<ol start="7">
	<li>将主混合液涡旋振荡，并用小型离心机瞬时离心，使管内液体全部收集至管底。</li>
	<li>取49 µl主混合液与1 µl结核分枝杆菌（M. tuberculosis）DNA，加入上述第1.4步的各个样品管中。对于外部无模板对照（NTC），用1 µl分子生物学级水替代结核分枝杆菌（M. tuberculosis）DNA样品。加样完毕后，涡旋振荡并瞬时离心管子（或管组）。</li>
</ol>
2. 加载扩增微阵列
<ol>
	<li>将每种混合液/样品各 48 µl 加到相应微阵列的中心位置，注意不要触碰到微阵列本身。</li>
	<li>将盖玻片放置在微阵列垫圈和密封圈上方，并小心密封，避免在微阵列腔室内滞留气泡。气泡可能对扩增效率产生不利影响，并可能在后续微阵列图像中产生伪影或噪声。</li>
</ol>
3. 热循环
<ol>
	<li>所有微阵列样品加载完毕后，将基板放置于平板式热循环仪的加热块上。确保加热盖处于“关闭”状态。若设备来自Akonni Biosystems公司，则已预先验证合格可供使用。否则，必须严格验证平板式热循环仪是否能够对所有微阵列基板提供均匀且一致的加热效果。</li>
	<li>打开热循环仪软件，选择合适的程序，输入反应体积为“50 µl”，然后启动运行。此处描述的热循环程序包括以下步骤：
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>热循环步骤</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>88 °C</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>88 °C</td>
			<td>30 sec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>55 °C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>65 °C</td>
			<td>30 sec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>重复步骤 (2–4) 共 50 个循环</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>65 °C</td>
			<td>3 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>55 °C</td>
			<td>3 hr</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
</li>
	<li>热循环总循环数以及扩增后55 °C的孵育时间是可变参数，用户可根据具体实验需要或实际情况进行调整。由于MDR-TB预混液可产生不对称（主要为单链）扩增子，通常建议设置比常规指数式PCR扩增程序更多的热循环次数，以获得更佳效果。</li>
	<li>热循环与杂交程序完成后，结束运行，取出扩增用微阵列，关闭软件，并关闭热循环仪。</li>
</ol>
4. 清洗与干燥
<ol>
	<li>为同时清洗最多24个基质，需准备至少250 ml的1× SSPE – 0.1% Triton X-100洗涤缓冲液，以及两个各含至少250 ml去离子水或Milli-Q级水的容器。洗涤缓冲液可预先配制。</li>
	<li>使用平头镊子小心地从每个扩增微阵列室中移除盖玻片和垫圈。此步骤是凝胶元件阵列最易受到物理损伤的环节。应采用适当的PCR污染防控措施，防止扩增的核酸在工作环境中扩散。</li>
	<li>将微阵列基质放入组织学玻片架中，并将所有玻片置于盛有洗涤缓冲液的洗涤容器内，用盖子盖好容器。</li>
	<li>在室温下轻轻振荡洗涤微阵列10分钟。</li>
	<li>将微阵列依次在两份去离子水或Milli-Q级水中各浸洗三次，然后自然晾干。</li>
</ol>
5. 成像
不对称的 MDR-TB 引物混合物可生成 Cy3 标记的扩增子。凝胶元件微阵列可使用任何能够检测 Cy3 的标准微阵列成像仪进行成像。以下成像程序专用于 Akonni 公司提供的 MDR-TB 主混合液、Dx2100 便携式现场成像仪及自动化分析软件。
<ol>
	<li>确保成像仪的以太网电缆已连接到计算机。</li>
	<li>打开成像仪电源。电源开关位于仪器背板上。当成像仪通电后，前面板上的蓝色LED灯将亮起。</li>
	<li>开启计算机。</li>
	<li>在计算机桌面上，双击软件图标以启动自动图像分析软件。</li>
	<li>等待软件与成像仪相机建立连接。连接成功后，“分析”按钮将变为可用状态，屏幕左下角会显示“连接成功”提示信息。</li>
	<li>插入干燥的扩增微阵列，使微阵列面向远离用户的方向，并朝向物镜。如果微阵列相对于镜头和相机的方向不正确，自动分析软件将无法在荧光图像上正确放置网格。</li>
	<li>关闭访问门。计算机屏幕上将显示预览图像。</li>
	<li>从下拉菜单中选择MDR-TB分析脚本，并输入所需的曝光时间（单位为毫秒）。对于凝胶元件扩增微阵列，通常的起始曝光时间为100–500毫秒。</li>
	<li>预览图像中饱和的像素将以红色显示。请调整曝光时间，以尽量减少单个斑点内的饱和像素数量。</li>
	<li>点击“分析”以获取并分析荧光图像。软件将自动在图像上放置针对MDR-TB检测的特定网格，提取各斑点的积分强度和背景值，并报告药物耐药性及基因分型结果。自动分析通常需要几秒钟。对于存在划痕、灰尘、荧光伪影或微阵列特征物理损伤等复杂情况的图像，软件可能需要长达1分钟才能完成分析。</li>
	<li>分析完成后，点击“保存”，选择目标文件夹，输入文件名，然后点击“确定”。底层微阵列数据将以.xls文件格式保存，可根据需要导出用于离线分析。</li>
	<li>分析完成后，从成像仪中取出扩增微阵列，然后点击“新建”以启动下一次分析。</li>
	<li>数据采集结束后，关闭软件，关闭计算机，并关闭成像仪电源。</li>
</ol>

<ol><li>Lemaire, J. -F., Casenghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+diagnostics+for+tuberculosis%3A+fulfilling+patient+needs+first%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Int.+AIDS+Soc%22%5BJournal%5D)">New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first.</a> J. Int. AIDS Soc. 13, 40(2010).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Tuberculosis+diagnostic+technology+landscape%22">Tuberculosis diagnostic technology landscape</a>. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).</li>
<li>Notomi, T., Okayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucl. Acids Res. 28, e63(2000).</li>
<li>Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicase-dependent+isothermal+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Helicase-dependent isothermal DNA amplification.</a> EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).</li>
<li>Pritchard, C. G., Stefano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+detection+of+viral+nucleic+acid+at+subattomole+levels+using+Q+beta+replicase%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biol.+Clin%22%5BJournal%5D)">Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase.</a> Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).</li>
<li>Compton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+sequence-based+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid sequence-based amplification.</a> Nature. 350, 91-92 (1991).</li>
<li>Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal%2C+in+vitro+amplification+of+nucleic+acids+by+a+multienzyme+reaction+modeled+after+retroviral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).</li>
<li>Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+chip+array+for+differentiation+of+mycobacterial+species+and+detection+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Chin.+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance.</a> Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).</li>
<li>Troesch, A., Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+species+identification+and+rifampin+resistance+testing+with+high-density+DNA+probe+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).</li>
<li>Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+TB-biochip+oligonucleotide+microarray+system+for+rapid+detection+of+rifampin+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).</li>
<li>Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+defined+Mycobacterium+tuberculosis+populations+using+RNA+amplification+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies.</a> BMC Genomics. 9, 94(2008).</li>
<li>Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+mycobacterium+species+isolates+by+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).</li>
<li>Park, H., Jang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+genotyping+of+Mycobacterium+species+from+clinical+isolates+and+specimens+by+oligonucleotide+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).</li>
<li>Yao, C., Zhu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rpoB%2C+katG+and+inhA+gene+mutations+in+Mycobacterium+tuberculosis+clinical+isolates+from+Chongqing+as+determined+by+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray.</a> Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).</li>
<li>Sun, A. H., Fan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+rpoB+gene+mutations+in+rif-resistant+M.+tuberculosis+isolates+by+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Environ.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray.</a> Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).</li>
<li>Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+drug-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+with+a+scanning-frame+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray.</a> Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).</li>
<li>Fu, L., Shinnick, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+action+of+INH+on+a+highly+INH-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strain+using+Genechips%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips.</a> Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).</li>
<li>Fu, L. M., Shinnick, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+exploration+of+the+drug+action+of+capreomycin+on+Mycobacterium+tuberculosis+using+Affymetrix+oligonucleotide+GeneChips%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect%22%5BJournal%5D)">Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips.</a> J. Infect. 54, 277-284 (2007).</li>
<li>Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+pncA+genotyping+of+pyrazinamide-resistant+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).</li>
<li>Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hybridisation+on+oligonucleotide+microarrays+for+analysis+of+drug-resistant+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis.</a> Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).</li>
<li>Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+and+allele+specific+PCR+detection+of+point+mutations+in+Mycobacterium+tuberculosis+genes+associated+with+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance.</a> J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).</li>
<li>Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+mapping+of+mutations+of+pyrazinamide-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strains+with+a+scanning-frame+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).</li>
<li>Yue, J., Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rifampin-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strains+by+using+a+specialized+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).</li>
<li>Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+CombiChip+Mycobacteria+Drug-Resistance+detection+DNA+chip+for+identifying+mutations+associated+with+resistance+to+isoniazid+and+rifampin+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).</li>
<li>Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+macroarrays+for+the+identification+of+MDR+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).</li>
<li>Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+the+genotype+MTBDR+line+probe+assay+for+detection+of+resistance+to+rifampin+and+isoniazid+in+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis+with+low-+and+high-level+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).</li>
<li>Padilla, E., Gonzalez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+the+new+version+of+the+INNO-LiPA+Mycobacteria+and+GenoType+Mycobacterium+assays+for+identification+of+Mycobacterium+species+from+MB%2FBacT+liquid+cultures+artificially+inoculated+with+mycobacterial+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains.</a> J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).</li>
<li>Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnostic+performance+of+the+GenoType+MTBDRplus+Version+2+line+probe+assay+is+equivalent+to+that+of+the+Xpert+MTB%2FRIF+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay.</a> J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).</li>
<li>Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+line+probe+assay+for+rapid+identification+of+pncA+mutations+in+pyrazinamide-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).</li>
<li>Chandler, D. P., Bryant, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+amplification+microarrays+for+infectious+disease+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics.</a> Microarrays. 1, 107-124 (2012).</li>
<li>Vincent, V., Rigouts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TDR+Tuberculosis+Strain+Bank%3A+a+resource+for+basic+science%2C+tool+development+and+diagnostic+services%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Tuberc.+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services.</a> Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).</li>
<li>Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-volatile+copolymer+compositions+for+fabricating+gel+element+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays.</a> Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).</li>
<li>Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plastic%2C+disposable+microfluidic+flow+cell+for+coupled+on-chip+PCR+and+microarray+detection+of+infectious+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents.</a> Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).</li>
<li>Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplicon+secondary+structure+prevents+target+hybridization+to+oligonucleotide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).</li>
<li>El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+sloppy+molecular+beacon+probes+for+identification+of+Mycobacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).</li>
<li>Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+molecular+detection+of+tuberculosis+and+rifampin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

扩增微阵列的多重检测能力最终取决于多重不对称PCR的效率，而非微阵列本身。根据我们的经验，在扩增微阵列体系中，通常可轻松实现10至12对独特引物的多重扩增。因此，开发新检测方法时仍需遵循常规的引物与探针设计原则，但还需额外考虑溶液相核酸与固定化微阵列探针之间可能发生的相互作用、热循环仪的热传导效率，以及在含有PCR引物和低分子量扩增副产物的PCR缓冲液中探针的杂交行为。由于多种技术原因，诸如全基因组扩增等高度多重化的扩增方法并不适用于单腔室扩增微阵列方案，其中包括随机六聚体与固定化探针之间的干扰，以及长片段双链扩增子杂交效率低下等问题。此外，在操作便捷性、总分析时间与检测限之间存在相互制约关系，用户在设计定制检测方案或使用本文所述的耐多药结核病（MDR-TB）检测方法时需权衡考虑。例如，减少扩增循环次数甚至省略扩增后杂交步骤可显著缩短总分析时间，但会降低检测灵敏度。相反，若要实现稳定可靠的每10个基因拷贝的检测限，则可能需要增加扩增循环次数或延长杂交时间，从而导致总分析时间超过单个工作班次的时长。
本文所述的基因、突变、成像仪、分析软件和报告算法旨在说明扩增微阵列方法与系统，而非对...

早期发现病例并迅速开展治疗被认为是减少结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）传播最有效的控制策略1。目前结核病领域已形成广泛共识，即需要一种可在护理现场（POC）或接近护理现场的检测方法，以同时诊断结核病（TB）及药物耐药性（DR）。诸如赛沛公司（Cepheid）的 GeneXpert&#160;以及其他核酸扩增检测技术，已显著缩短了大量结核病患者的诊断时间，并可快速报告利福平耐药情况或提示对其他一线或二线药物产生耐药性的特定突变2。尽管实时和等温核酸扩增检测技术旨在识别导致耐多药结核病（MDR-TB）的耐药突变，但其可检测的突变谱通常不足以根据患者的耐药谱制定个体化的治疗方案；此外，由于光学串扰、扩增反应及报告化学体系的复杂性等技术限制3-7，此类方法所能检测的基因位点或突变数量也受到制约。因此，亟需具有更高多重检测能力的技术，以弥补当前耐多药结核病现场诊断中的已知不足。
微阵列和世界卫生组织（WHO）推荐的Hain线探针检测方法能够应对诊断耐多药结核病（MDR-TB）中“多个基因、多种突变”的挑战8-29。然而，这些基于杂交的多重检测平台采用多步骤、复杂且涉及开放扩增子的操作流程，需要操作者具备较高的分子生物学技术训练水平和操作熟练度。扩增微阵列30的设计旨在解决上述微阵列工作流程和操作中的部分问题。其简化的流体原理是在单一微流控腔室内完成核酸靶标的扩增、杂交和检测。用户使用移液器将核酸样本和扩增主混合液加入流体腔室，并启动热循环程序。对于本研究所示的批量处理方法，微阵列随后在整体溶液中进行清洗、干燥并成像。本研究通过一种用于检测rpoB（30种突变）、katG（2种突变）、inhA（4种突变）、rpsL（2种突变）、embB（1种突变）、IS1245、IS6110以及内部扩增和杂交对照的MDR-TB微阵列检测，验证了扩增微阵列的功能。针对每一个目标突变，均包含至少一对匹配的微阵列探针（野生型（WT）和单核苷酸突变型（MU））。所用多药耐药M. tuberculosis的纯化核酸来自TDR结核菌株库31。凝胶元件微阵列在玻璃基底上通过共聚反应制备，基本方法如文献所述32，但本研究中聚合混合物使用4%单体和每种探针0.05 mM。使用前，阵列周围安装50 µl密封垫圈。在完成热循环、杂交和洗涤步骤后，使用Akonni便携式分析仪对扩增微阵列进行成像。通过固定圆算法从原始.tif图像中获取经背景校正的积分信号强度。每个凝胶元件的噪声计算为局部斑点背景标准差的三倍。通常认为当信噪比（SNR）值≥3时，基因靶标可被检测到。为了确定每个基因或密码子是否存在特定突变，根据SNR值计算判别比值：(WT-MU)/(WT+MU)。判别比值&#60;0表明该位点存在耐药突变，而比值&#62;0则表明为野生型序列。

<table><tbody><tr><td>MDR-TB 扩增微阵列，带垫圈和预切割盖玻片</td><td>Akonni Biosystems</td><td>咨询</td><td></td></tr><tr><td>多重 PCR 试剂盒，包含含 HotStar Taq Plus 的 2X PCR 缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>#206143</td><td></td></tr><tr><td>Taq 聚合酶</td><td>Qiagen</td><td>#201207</td><td></td></tr><tr><td>无 RNA 酶水</td><td>Qiagen</td><td>#206143&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#BP227-500</td><td></td></tr><tr><td>20 mg mL&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt; 非乙酰化牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#3B6917</td><td></td></tr><tr><td>5X 浓缩 MDR-TB 引物混合液</td><td>Akonni Biosystems</td><td>咨询</td><td></td></tr><tr><td>500 fg uL&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt; 扩增与抑制对照品</td><td>Akonni Biosystems</td><td>咨询</td><td></td></tr><tr><td>20X SSPE</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#BP1328-4</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>消毒喷雾&amp;nbsp;</td><td>Current Technologies, Inc.</td><td>#BRSPRAY128</td><td></td></tr><tr><td>70% 异丙醇</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>#8416</td><td></td></tr><tr><td>微阵列成像仪，配备自动图像与数据分析软件</td><td>Akonni Biosystems</td><td>100-20011</td><td></td></tr><tr><td>带平板模块的热循环仪</td><td>Akonni Biosystems</td><td>100-10021</td><td></td></tr><tr><td>高通量洗涤站及玻片架</td><td>ArrayIt</td><td>HTW</td><td></td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#10-300</td><td></td></tr><tr><td>迷你涡旋振荡器</td><td>VWR</td><td>#3365040</td><td></td></tr><tr><td>迷你离心机</td><td>VWR</td><td>#93000-196</td><td></td></tr><tr><td>喷笔压缩机套件</td><td>Central Pneumatic</td><td>#95630</td><td></td></tr></tbody></table>

展示一种多重耐药性mycobacterium tuberculosis扩增微阵列

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

简化微阵列工作流程是开发可在资源有限环境中常规使用的耐多药结核分枝杆菌（MDR-TB）微阵列诊断方法的必要第一步。扩增微阵列技术将不对称PCR扩增、目标片段大小筛选、目标标记以及微阵列杂交整合于单一溶液中，并在单个微流控腔室内完成。本文演示了一种批量处理方法，采用9重不对称预混液与低密度凝胶单元微阵列，用于耐多药Mycobacterium tuberculosis（MDR-TB）的基因分型。该方案可在6小时内完成，且对至少相当于1,000个细胞的基因组DNA实现准确的基因分型。在芯片上整合洗涤步骤是可行的，这将实现完全封闭的扩增子检测方法与系统。扩增微阵列的多重检测能力最终受限于可组合至单一预混液中的引物对数量，而非固定于阵列上的探针数量。同样，总分析时间可根据具体应用目的、研究问题及所需的检测限灵活调整缩短或延长。然而，该通用方法通过减少手动操作密集且耗时的处理步骤，显著简化了终端用户所面对的微阵列工作流程，并为将基于微阵列的诊断技术转化为常规临床实践提供了简化的生物化学与微流控路径。

定性图像分析可帮助识别在自动化图像分析软件生成的数据表中难以发现的实验噪声或变异来源。因此，通过目视检查确认以下几点非常有用：1）所有凝胶元件完整无损；2）整体背景无荧光伪影，以免影响各个信号与噪声比（SNR）值；3）阵列上无气泡形成或扩增/杂交不均的迹象；4）软件已准确识别出微阵列图像上的所有斑点。MDR-TB扩增微阵列图像示例见图1，展示了高质量阵列以及在热循环过程中因物理损伤或气泡导致的伪影。标准的微阵列图像分析软件通常即使面对如图1B所示的低质量图像，也能放置网格并提取积分强度和背景数据，因此研究人员有责任建立微阵列图像质量控制的标准和指标，以决定是否接受或剔除特定图像用于后续分析。探针的冗余设计可能有助于缓解这些问题。然而，一个完全自动化的MDR-TB扩增微阵列诊断报告算法会将来自图1B的检测结果判定为“无效”。
野生型 H37Ra 基因组 DNA 稀释系列的扩增微阵列信噪比（SNR）值如表2所示。当每反应加入6.25 pg基因组DNA（...

扩增微阵列将不对称PCR扩增与微阵列杂交整合于同一反应腔室中，显著简化了终端用户的微阵列操作流程。简化微阵列操作流程是开发适用于资源有限环境的微阵列诊断技术的必要第一步。

展示一种多重耐药性Mycobacterium tuberculosis扩增微阵列

简化微阵列工作流程是开发可在资源有限地区常规使用的耐多药结核病（MDR-TB）微阵列诊断方法的必要第一步。

以下实验的总体目标是利用扩增微阵列对耐多药结核分枝杆菌进行基因分型。该方法通过在单个微流控反应腔室内的微阵列上进行多重不对称PCR来实现。在此过程中，样本被同时扩增、标记、按大小筛选、转化为单链，并与微阵列进行杂交。接下来，在微阵列洗涤后，通过读取仪检测是否存在结核分枝杆菌，以及其是否含有已知导致对利福平、异烟肼、乙胺丁醇或链霉素耐药的DNA突变。该方法相较于现有的微阵列反向探针或核酸杂交方法的优势在于，扩增微阵列显著简化了用户对检测的操作流程，同时兼具PCR的分析灵敏度和微阵列的多重检测能力。在进行该实验时，需准备一个使用去污染溶液擦拭干净的洁净工作区，并确保核酸纯度足以满足多重PCR的要求。解冻并混匀所有储备液后，配制PCR主混合液。配制该混合液时，应至少多准备一份额外体积，用于本实验所示的TB检测。此外，还需在主混合液中额外添加T聚合酶。除了随货提供的试剂混合物外，将1微升样品DNA加入49微升主混合液中。小心地将每种反应混合物各48微升加至相应微阵列的中心位置，切勿接触微阵列本身。然后小心地覆盖并密封微阵列，操作不当。盖上盖玻片时可能引入气泡，从而导致产生假象、蒸发、扩增效果差或杂交不均一。上述任何一种情况都可能导致错误的结果。接下来，将微量样品加入热循环仪中。当反应管紧贴加热块时，必须关闭加热盖选项。对于遵循通用PCR操作规范的实验室，每个载玻片上可同时包含多个扩增微阵列，并且可以并行处理多个检测，从而提高效率。现在运行适当的热循环程序。该程序包含50个扩增循环，虽然看似较多，但由于反应产生的是以单链扩增子为主的产物，因此需要如此高的循环数。反应完成后，取出微阵列并关闭热循环仪。使用平头镊子小心打开芯片室。取下玻片、盖玻片和垫圈。此步骤可能损坏芯片，因此操作需格外谨慎。拆卸垫圈组件可能导致微阵列发生物理损伤。务必小心，避免弯曲或折弯盖玻片，并特别注意防止镊子划伤微阵列表面。现在将微阵列基底转移至组织学切片架中。在室温下用洗涤缓冲液轻轻振荡浸泡基底10分钟，随后用去离子水再进行两到三次洗涤。在进行成像之前，将微阵列干燥。本演示中可使用温和的压缩空气气流来实现此目的，参数针对MDR TB检测以及Econ DX 2100便携式现场成像仪设定。成像仪上的蓝灯表示设备已准备就绪。打开计算机。启动由 conni 提供的系统软件，并等待软件提示已与相机建立连接。然后，将干燥的微阵列芯片插入成像仪中。将芯片朝向镜头并远离使用者。此时软件将从下拉菜单中提供预览图像。选择 MDR TB 分析脚本。输入一个介于100至500毫秒之间的曝光时间。过曝的像素将被读取。调整曝光以使其最小化。当将饱和度设置为最小化过曝时，开始分析。软件会在图像上放置 MDRT TB 网格，对得分、样本和背景强度进行采样，然后报告药物耐药性和基因分型结果。分析完成后并保存结果，从成像仪中取出芯片

demonstrating-multi-drug-resistant-mycobacterium-tuberculosis

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

展现着多药耐药<em&gt;结核分枝杆菌</em&gt;扩增基因芯片

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Xpert MTB/RIF 检测整合了样本去污染、免手动操作、仪器内置样本处理以及超灵敏的半巢式 PCR 技术，可在约两小时内对咳出的痰液或浓缩痰沉淀物中的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

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展示一种多重耐药性Mycobacterium tuberculosis扩增微阵列

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