展示一种多重耐药性Mycobacterium tuberculosis扩增微阵列

以下实验的总体目标是利用扩增微阵列对耐多药结核分枝杆菌进行基因分型。该方法通过在单个微流控反应腔室内的微阵列上进行多重不对称PCR来实现。在此过程中，样本被同时扩增、标记、按大小筛选、转化为单链，并与微阵列进行杂交。

接下来，在微阵列洗涤后，通过读取仪检测是否存在结核分枝杆菌，以及其是否含有已知导致对利福平、异烟肼、乙胺丁醇或链霉素耐药的DNA突变。该方法相较于现有的微阵列反向探针或核酸杂交方法的优势在于，扩增微阵列显著简化了用户对检测的操作流程，同时兼具PCR的分析灵敏度和微阵列的多重检测能力。在进行该实验时，需准备一个使用去污染溶液擦拭干净的洁净工作区，并确保核酸纯度足以满足多重PCR的要求。

解冻并混匀所有储备液后，配制PCR主混合液。配制该混合液时，应至少多准备一份额外体积，用于本实验所示的TB检测。此外，还需在主混合液中额外添加T聚合酶。

除了随货提供的试剂混合物外，将1微升样品DNA加入49微升主混合液中。小心地将每种反应混合物各48微升加至相应微阵列的中心位置，切勿接触微阵列本身。

然后小心地覆盖并密封微阵列，操作不当。盖上盖玻片时可能引入气泡，从而导致产生假象、蒸发、扩增效果差或杂交不均一。上述任何一种情况都可能导致错误的结果。

接下来，将微量样品加入热循环仪中。当反应管紧贴加热块时，必须关闭加热盖选项。对于遵循通用PCR操作规范的实验室，每个载玻片上可同时包含多个扩增微阵列，并且可以并行处理多个检测，从而提高效率。

现在运行适当的热循环程序。该程序包含50个扩增循环，虽然看似较多，但由于反应产生的是以单链扩增子为主的产物，因此需要如此高的循环数。反应完成后，取出微阵列并关闭热循环仪。

使用平头镊子小心打开芯片室。取下玻片、盖玻片和垫圈。此步骤可能损坏芯片，因此操作需格外谨慎。

拆卸垫圈组件可能导致微阵列发生物理损伤。务必小心，避免弯曲或折弯盖玻片，并特别注意防止镊子划伤微阵列表面。现在将微阵列基底转移至组织学切片架中。在室温下用洗涤缓冲液轻轻振荡浸泡基底10分钟，随后用去离子水再进行两到三次洗涤。

在进行成像之前，将微阵列干燥。本演示中可使用温和的压缩空气气流来实现此目的，参数针对MDR TB检测以及Econ DX 2100便携式现场成像仪设定。成像仪上的蓝灯表示设备已准备就绪。

打开计算机。启动由 conni 提供的系统软件，并等待软件提示已与相机建立连接。然后，将干燥的微阵列芯片插入成像仪中。

将芯片朝向镜头并远离使用者。此时软件将从下拉菜单中提供预览图像。选择 MDR TB 分析脚本。

输入一个介于100至500毫秒之间的曝光时间。过曝的像素将被读取。调整曝光以使其最小化。

当将饱和度设置为最小化过曝时，开始分析。软件会在图像上放置 MDRT TB 网格，对得分、样本和背景强度进行采样，然后报告药物耐药性和基因分型结果。分析完成后并保存结果，从成像仪中取出芯片，并启动新的分析会话以分析下一个阵列。

对每张处理后的微阵列继续进行分析，并每次保存数据。定性图像分析有助于揭示实验噪声或变异性的来源，而这些在自动图像分析软件生成的数据表中往往难以识别。

此处显示的是一个高质量的芯片，无伪影。多种伪影可能导致气泡产生，从而形成晕圈。尽管存在芯片伪影，软件仍能从扫描中获取数值。

尽管诊断报告算法识别出该阵列中的数值为无效，但仍进行了分析。使用野生型 H 37 RA 基因组 DNA 的系列稀释样本作为微阵列 PCR 模板，其中 6.25 皮克相当于 1,250 个细胞。所有探针均被检测到。

信噪比（SNR）值高于三即为阳性结果，而记录到的数值远高于此阈值。接下来，对世界卫生组织的参考分离株进行了基因分型。芯片上存在的单核苷酸多态性被检测为耐多药结核分枝杆菌（MDR TB）基因组中的相应突变。

检测邻近突变的多个实例也十分明显。文本方案中提供了相关讨论。掌握该技术后，根据DNA浓度、特定检测方法、PCR仪的效率与均一性以及所需的分析或临床灵敏度和特异性，操作时间大约为三小时半至六小时半。

此外，可根据所需的性能特征灵活调整扩增循环次数以及扩增后杂交时间的长短。