使用结构光照明显微镜成像大鼠原代海马神经元的树突棘

本实验的总体目标是以超分辨率成像树突棘。首先制备大鼠原代海马神经元，称为第一步；第二步是通过GFP转染及染色来可视化树突棘。随后，使用SIM显微镜对GFP标记的树突棘进行超分辨率成像。

最后一步是将原始图像数据重建为可用于后续图像分析的三维图像。最终，通过超分辨率成像表达绿色荧光蛋白（GFP）的原代海马神经元，以展示树突棘形态的细微变化。与传统的共聚焦显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够更详细地研究树突棘的形态结构。

该方法有助于研究神经科学领域的一些关键性持续问题，例如树突棘形态在分子和药理学依赖性条件下的改变。结构光照明显微镜基于将线性图案投射到样品上，由此可由计算机程序提取额外信息，从而获得更清晰的图像，使您能够观察线粒体（MI）以及细胞内的其他微小结构。对这一方法进行可视化演示至关重要，因为要获得有效重建的SIM图像，关键在于准确执行各个步骤，以确保原始数据具有高质量。

一个重要的准备步骤是在无菌超净工作台中对盖玻片进行包被。使用小型无菌镊子将单个盖玻片放入12孔板的各个孔中。然后向每个孔中加入500 µL多聚赖氨酸溶液，以完全浸没盖玻片。

洗涤孔板后，加入一毫升铺板培养基，将盖玻片置于组织培养孵育箱中，于接种细胞前最多孵育24小时。本操作步骤由本课题组的博士研究生 HU is SH 演示。分离大鼠胚胎脑组织后，使用精细镊子移除并弃去小脑。

在解剖显微镜下沿中线进行矢状切开，分离两个脑半球，用一对小镊子轻轻夹住中脑并将其移除。用另一对镊子保留包含皮层和海马体的脑半球其余部分。接下来，小心去除脑膜，重新调整组织方向，使海马体朝上。

海马体可通过其特有的C形结构进行识别。使用精细镊子将海马体解剖出来，并置于一个新的含有新鲜冷的1×H-BSS的30毫米培养皿中。在取出所有胚胎的海马体后，计数海马体的总数，然后将其切成小块。

将组织块收集到含有 3 毫升 1× H-BSS 的 15 毫升离心管中。离心并去除上清液后，每个海马体加入 6 微升胰蛋白酶。按照文本方案所述孵育并清洗海马体碎片后，用火焰抛光的巴斯德移液管缓慢吹打碎片 30 次，直至所有组织块均匀分散成单细胞。

注意避免产生任何气泡。随后，加入5毫升预热至37°C的铺板培养基。使用台盼蓝活体染色法计数细胞后，将每毫升铺板培养基中含50,000个细胞接种至12孔板的每个孔中，总体积为2毫升。

轻轻摇动培养板使细胞均匀分布后，将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。两到三天后，用含有10微摩尔氟脱氧尿苷（FUDR）的培养基替换0.5毫升铺板培养基。进行转染时，向神经元中加入脂质体转染试剂。

将溶液逐滴加入A DNA混合物中，室温孵育30分钟。在超净工作台内，距离30分钟DNA转染混合物孵育结束前10分钟，将原代或第一代培养板中的条件培养基用移液器转移至第二块12孔板中，并将该板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，与第一代培养板一同保存。

迅速将条件培养基更换为一毫升预热的孵育培养基，以防止细胞干燥。将两块培养板放回37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。30分钟DNA转染孵育结束时，DNA转染混合物即可加入细胞中。

将200微升DNA裂解混合液逐滴轻轻加入每个孔中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育45分钟。45分钟孵育结束后，用小型镊子轻轻提起载有神经元的盖玻片，将其浸入含有新鲜温热神经基础培养基的3厘米培养皿中清洗，然后放入孔中。

在第二个含有条件培养基的12孔板中。然后将转染的神经元在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育48小时。为免疫染色做准备，轻轻吸去含有盖玻片的孔中的培养基。

然后小心加入 500 µL 温热的 4% PFA，避免损伤树突。洗涤后，在室温下用 1% TBS-BSA 溶液封闭细胞 30 分钟，再次洗涤，再将用孵育液稀释的一抗加入，混匀后于室温孵育 1 小时。随后在 4°C 条件下轻轻振荡孵育过夜。

第二天早晨，除去一抗，从此步骤开始每次洗涤后均需将盖玻片避光保存。接着，加入用孵育液稀释的荧光标记二抗。混匀后室温孵育两小时。

然后用精细镊子去除二抗，并用TBS洗涤细胞。将盖玻片从孔中取出，用纸巾吸去多余的TBS。最后使用封片剂封片，并用指甲油封边。

开始SIM成像时，打开488纳米激光器、汞灯、载物台控制器、压电控制器以及用于透射光的卤素灯。启动SIM软件的and或nsim模式。在物镜上滴加一滴浸油后，检查油滴中是否存在气泡。

将带有海马神经元的盖玻片放置在显微镜载物台上。向上移动物镜，直至油镜接触样品。在采集过程中，记得用遮光罩覆盖载物台，以保护样品免受环境光影响，并尽可能调暗房间内的光线。

在SIM软件中，选择光学配置IFI，并选择一个空滤光片位，使用白光设置对样品进行目视检查以确定焦点。随后关闭白光，打开汞灯。打开快门并选择绿色滤光片，以寻找足够明亮的树突。

当观察到足够明亮的目标树突，并将视野中的目标区域居中后，关闭快门。将软件设置为光学配置 3D SIM 4 88，相机设置如下：将读出模式设为 em。

设置增益为1 MHz，16位。曝光时间设为100毫秒。激光功率设为5%，EM增益设为200。

将聚焦速度设置为超精细，聚焦于目标物体。快速调整相机设置如下：为获得30,040至5,000之间的强度值，将激光功率设为0%至20%，曝光时间设为50毫秒至2秒。

将读出模式设置为 em，增益为 1 兆赫兹、16 位。将 EM 增益设置为 0 到 300。

将转换增益设置为1倍至5.1倍。将实时显示格式设置为无Benning。将捕获格式设置为无Benning。

接下来，在 ND 序列面板中配置三个 DZ 堆栈的设置：将范围设置为两微米，步长设置为 120 纳米，并点击归零位置。然后在 lambda 部分选择光学配置 3D SIM 4 88。

选择3D SIM作为采集模式后，运行ND序列采集并保存原始数据，此处展示了使用共聚焦显微镜和SIM显微镜成像的树突及树突棘。图像由共聚焦和SIM图像重建获得。在调整颈长、颈直径和头直径等主要参数后，通过软件自动追踪树突并分类树突棘。

方框区域显示了一个树突棘分别通过共聚焦显微镜和SIM显微镜成像，并基于相应的Z轴层叠图像进行三维重建，展示了两种方法在分辨率和三维重建准确性上的差异。根据SIM更高的分辨率，对头部和颈部直径进行的定量分析表明，对于相同的树突棘，SIM显微镜测得的尺寸显著小于共聚焦显微镜，说明SIM能够检测到树突棘形态更细微的变化。在执行该操作过程中，重要的是要记住获取高质量的原始图像，以确保后续图像重建结果更加可靠有效。

结构照明显微镜也可用于活细胞成像，能够研究如海拉细胞、神经元或大肠杆菌等细胞的动态过程。观看本视频后，读者应能充分理解如何在超分辨率成像中对原代海马神经元样本进行制备、观察和成像。