Name: 设置了一个体外模型（BBB）:在BBB抗渗性和受体介导的运输为中心 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: 学习建立大鼠血脑屏障体外模型，通过酶解处理与密度梯度离心分离脑微血管，利用星形胶质细胞共培养诱导内皮细胞分化，评估紧密连接蛋白表达与跨内皮电阻值，为中枢神经系统药物递送机制研究提供可重复的功能性平台。

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感谢Fonds Unique Interministériel（FUI/MEDUL项目）为VECT-HORUS提供的资金支持，以及法国国家科研署（ANR，TIMPAD、VECtoBrain、VEC2Brain、ADHOC和PREVENTAD合作项目）为VECT-HORUS和UMR7259实验室提供的资金支持。UMR7259实验室还感谢法国国家科学研究中心（CNRS）和艾克斯-马赛大学（Aix-Marseille Université）提供的资金支持。

1. 大鼠星形胶质细胞的制备
每次制备使用10只任一性别的新生Wistar大鼠。
<ol>
	<li>使用剪刀剪下大鼠头部以处死动物，并立即将其转移至超净台中的干燥培养皿内。取出脑组织（不含小脑），并立即放入含有冷解剖缓冲液的培养皿中：HBSS 加 1% 牛血清白蛋白&#160;（低内毒素 BSA）、青霉素 100 单位/ml&#160;和链霉素 100 µg/ml。</li>
	<li>将脑组织沿中线切开，分离两个大脑半球，并转移至盛有冰上解剖缓冲液的洁净培养皿中。在体视显微镜下剪除视神经并剥离脑膜。</li>
	<li>用 50 ml 冷解剖缓冲液对皮质组织块进行充分洗涤。</li>
	<li>取 3 只大鼠的皮质组织块置于 15 ml Falcon 管中，加入 6 ml 含 0.05% 胰蛋白酶–0.02% EDTA 的溶液，在 37 °C 下孵育 5 分钟，使用带蓝色枪头的 10 ml 一次性移液管反复吹打数次以实现组织解离。</li>
	<li>加入 24 ml DMEM 培养基，该培养基添加 10% 胎牛血清（FBS）以及青霉素 100 单位/ml 和链霉素 100 µg/ml，此培养基称为胶质细胞培养基（GCM），在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。所用 FBS 批次均经过筛选和验证，适用于星形胶质细胞培养物的生长与存活。</li>
	<li>将含有解离细胞的沉淀用 10 ml GCM 重悬，接种至一个 75 cm2 的 T 形培养瓶（T75）中。次日更换培养基以去除细胞碎片和 DNA。此后每周更换两次培养基。</li>
	<li>培养 1 周后，在 37 °C 条件下，使用转速为 60 rpm 的轨道摇床轻轻振荡胶质细胞 24 小时（在 GCM 中进行）。若 T75 培养瓶无法置于含 5% CO2 / 95% 空气、37 °C 的湿润培养箱中，则需在培养基中补充 5 mM HEPES。用缓冲液洗涤细胞两次，以去除未贴壁的的小胶质细胞。</li>
	<li>接种后三周，用不含钙和镁的 DPBS 洗涤细胞两次。加入 3 ml 预热的 0.05% 胰蛋白酶–0.02% EDTA 溶液，在 37 °C 孵育直至细胞层完全分散（通常约 5 分钟）。加入 10 ml GCM 以终止胰蛋白酶活性，将细胞悬液转移至 15 ml Falcon 管中，在 120 × g 条件下离心 8 分钟。</li>
	<li>将星形胶质细胞沉淀用含 90% FBS 和 10% DMSO 的冻存液重悬，分装至冻存管中（每管 2 × 106 个细胞），并储存于液氮中。</li>
</ol>
2. 大鼠脑微血管的分离
我们的实验方案已获得马赛医学院伦理委员会的批准，并符合国家和欧洲法规（欧盟指令第86/609号）。所有努力均旨在尽量减少动物痛苦并减少所用动物数量。
<ol>
	<li>每次制备及每位实验操作者使用3只五周龄的Wistar大鼠。</li>
	<li>第一周的星期一，准备2个T75培养瓶，分别用IV型胶原蛋白和纤连蛋白包被，两者浓度均为1 &#181;g/cm2 在无菌培养水（每T75培养瓶10 ml）中孵育，于37℃静置使其贴壁 &#176;直至微血管接种前均置于 C 条件下。</li>
	<li>第一周的周三上午，在逐渐增加的二氧化碳气流中对大鼠实施安乐死2 诱导嗜睡、姿势丧失和呼吸中断，随后进行颈椎脱位。用70%乙醇喷洒头部。用剪刀剪下头部，并在超净工作台内转移至干燥的培养皿中。</li>
	<li>从颅骨中取出脑组织，去除小脑和视神经，然后将脑组织转移至一个置于冰上预冷并盛有冷解剖缓冲液（HBSS 加 1% BSA、100 单位/毫升青霉素和 100 微克/毫升链霉素）的培养皿中 &#181;g/ml</li>
	<li>将脑组织沿中线切开，分离两侧大脑半球，并分离中脑与前脑。将前脑转移至冰上装有解剖缓冲液的干净培养皿中。</li>
	<li>在新的培养皿中加入几个半球，放入冷解剖缓冲液，在体视显微镜下小心去除前脑的脑膜，使用 N&#176; 5 把弯头镊子。然后清洗脑组织内部，去除髓鞘，获得皮质层。这些步骤应控制在 2 小时内完成，以确保组织保存和细胞存活。</li>
	<li>将3个大脑的皮层组织在7 ml的Dounce匀浆器中用6 ml冷解剖缓冲液进行分离，使用两种不同间隙的研杵各上下研磨10次， &#181;m 后接 20 &#181;m</li>
	<li>将悬液分装，每1 ml含相当于1个皮层组织的量，置于50 ml Falcon管中，在室温下以1,000 × g离心5 min。弃去上清液。</li>
	<li>用1 ml含有胶原酶/分散酶混合物（60）的酶溶液消化来自1个皮层的悬液 &#181;微克/毫升 – 0.3 单位/毫升，DNase I 型（35 &#181;g/ml – 20 K 单位/ml）和庆大霉素（50 &#181;g/ml）在37℃摇床中孵育30分钟 &#176;C.</li>
	<li>将1个皮层的1 ml消化液与10 ml 25% BSA/HBSS 1X混合，于室温下以3,600 × g离心15分钟，进行密度梯度分离。小心转移上层圆盘（髓鞘和脑实质）及上清液至一个新的50 ml Falcon管中，重复离心一次。将所得含有脑微血管的沉淀物置于4℃保存 &#176;C.</li>
	<li>小心弃去上层组织块和上清液。用1 ml冰冷的1× HBSS重悬含有脑微血管的两个沉淀物，并转移至一个洁净的50 ml Falcon管中。</li>
	<li>加入20 ml冷的HBSS 1X洗涤微血管，于1,000 x g离心5 min，弃去上清液。</li>
	<li>用与步骤2.9中所述相同的酶解液1 ml，将1个皮层的微血管在37℃下进一步消化1小时。 &#176;在摇床中于 C 条件下培养。</li>
	<li>然后，将来自3个皮层的已消化微血管混合至一个离心管中，再分装至两个50 ml Falcon离心管，使每管含有相当于1.5个皮层的微血管。加入30 ml冷解剖缓冲液，于室温下以1,000 x g离心5 min。</li>
	<li>将微血管沉淀物重悬于10 ml DMEM/F12培养基中，该培养基添加有20%牛血小板贫浆来源血清、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，2 ng/ml）、肝素（100 &#181;微克/毫升），庆大霉素（50 &#181;g/ml）和 HEPES（2.5 mM），命名为添加了嘌呤霉素（4 μg/ml）的内皮细胞培养基（ECM） &#181;g/ml</li>
	<li>从培养箱中取出2个已包被的T75培养瓶，吸除多余的包被液，将每根试管中的微血管分别接种至一个T75培养瓶中（每个T75培养瓶接种来自1.5个皮层的微血管）。</li>
</ol>
3. RBEC 原代培养细胞的纯化与增殖
<ol>
	<li>纯化：周三至周五，在培养基中加入 4 µg/ml 的嘌呤霉素。周四更换培养基。周五洗涤细胞，然后加入 2 µg/ml 的嘌呤霉素，持续至下周一。</li>
	<li>增殖：第二周的周一，洗涤细胞，并在培养基中添加胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠补充剂，直至第二周周三细胞达到 90% 汇合度。</li>
</ol>
4. 分化：实验设置 体外 血脑屏障模型
<ol>
	<li>第二周的星期一，准备滤膜（聚乙烯，12孔，孔径1.0） &#956;m）通过包被含有 IV 型胶原和纤连蛋白的混合物（浓度均为 0.5）&#181;g/cm2 在无菌培养水（500 &#181;上室加入混合液，下室加入1.5 ml无菌培养用水。在37℃下孵育，使其贴壁 &#176;C，直至RBEC接种。</li>
	<li>第二周的星期一，即共培养建立前五天，将星形胶质细胞从冻存管中于37℃解冻 &#176;C，转移至含有10 ml GCM的15 ml Falcon管中。在室温下以120 × g离心8分钟。</li>
	<li>将星形胶质细胞沉淀重悬于GCM中，并以30 x 10⁶个细胞/mL的密度接种3 每平方厘米细胞数2 在12孔板中。</li>
	<li>第二周的星期三，在用胰蛋白酶消化RBEC之前，用DMEM/F12培养基清洗预包被的滤膜两次。用ECM预填充室腔：下室加入1.5 ml，上室加入0.5 ml。</li>
	<li>第二周的星期三，用不含钙和镁的DPBS将RBEC洗涤两次。加入4 ml预热至37℃的0.05%胰蛋白酶-0.02% EDTA溶液 &#176;C，每T75培养瓶处理30秒。随后移除3.5 ml胰蛋白酶溶液，并在显微镜下观察。当细胞层开始从基质上脱落时，轻轻敲击T75培养瓶边缘，帮助细胞脱离，直至所有细胞悬浮。</li>
	<li>每T75培养瓶加入9 ml ECM，转移至15 ml Falcon管中。使用带黄色枪头的10 ml移液器，轻轻吹打细胞悬液4次，使细胞充分解离（避免产生气泡）。对悬液中的细胞进行计数（约3 x 106 细胞/T75），并立即以高密度接种于预先包被和预填充的滤膜上（160 × 103 细胞/滤器，因此约18个滤器/T75）（图8次日（星期四），更换上室培养基两次，以去除细胞碎片。</li>
	<li>第二周的星期四，即共培养建立的前一天，将星形胶质细胞培养基更换为1.5 ml分化培养基（含500 nM氢化可的松的ECM）&#160;可补充1/3来自先前共培养（内皮细胞与星形胶质细胞接触培养3天）中基础室的条件培养基。</li>
	<li>第二周的星期五定义为分化的第0天；将含有脑微血管内皮细胞（RBEC）的滤膜中的培养基更换为分化培养基。将含有RBEC的滤膜转移至含有星形胶质细胞的孔中。在此条件下， 体外 模型在3天内分化并表达与连接相关的蛋白质。</li>
	<li>模型在第三周的周一至周三期间保持其最佳分化状态，持续3天。</li>
</ol>

Michel Khrestchatisky 是 UMR7259 实验室主任，同时也是 VECT-HORUS 生物技术公司的联合创始人和科学顾问。

我们描述了一种可重复的周度实验方案，用于脑微血管的分离与接种，在经过纯化及大鼠脑微血管内皮细胞（RBEC）的培养后，进一步建立与原代大鼠星形胶质细胞的共培养体系，以构建一个 体外 具有典型血脑屏障特性的血脑屏障模型。
成功建立标准化 体外 BBB 培养需要在该过程的多个连续步骤中保持最佳条件。该模型经过优化以获得最低的旁细胞通透性，这仍是该领域的“圣杯”。 体外 BBB 模型，以及 (b) 针对外排和受体介导的转运机制进行了验证。
脑微血管内皮细胞的制备、纯化与增殖
培养脑微血管内皮细胞（RBEC）时最大的挑战在于实现不同培养批次间的可重复性。该方案的标准化需要高质量的解剖工具、高质量的试剂，并严格遵守试剂的有效期。实验人员必须熟练掌握在体视显微镜下进行显微解剖的技术，以快速去除大脑皮层表面的脑膜和大血管。在脑组织被分离并进行机械解离后，一个主要挑战是新鲜分离的脑微血管的最佳酶消化条件。所用酶的种类和质量至关重要。本研究采用高浓度且批次间差异较小的I型和II型胶原酶与dispase混合酶。此外，酶消化的时间以及酶浓度、组织重量与消化体积之间的比例也十分关键。最佳的脑微血管产量是在两次消化过程中，分别使用相当于一个脑的皮层组织加入1 ml&#160;酶混合液（胶原酶/dispase，60 µg/ml），消化时间分别为30分钟和1小时的条件下获得的。
同样关键的是清除污染细胞（星形胶质细胞和主要是周细胞）。这些细胞的增殖速度高于内皮细胞，且不能与内皮细胞形成紧密连接，从而阻碍了具有良好旁细胞限制性的均一细胞单层的建立。由于脑内皮细胞表达的外排泵（尤其是P-gp）水平显著高于微血管中其他类型的细胞，因此它们更能耐受对其他细胞具有毒性的P-gp配体药物浓度，而非内皮细胞则被清除。在培养的前两天使用4 µg/ml嘌呤霉素处理，随后再以2 µg/ml继续处理两天，可获得较高纯度的内皮细胞。该筛选过程还可优先保留毛细血管内皮细胞，而非小静脉、前毛细血管微动脉或较大微血管来源的内皮细胞，从而形成更紧密的单层结构。此外，使用无血小板血浆来源的牛血清是获得纯内皮细胞培养的必要条件47,48。这种血浆来源的血清缺乏血小板源性生长因子（PDGF），而PDGF对成纤维细胞、平滑肌细胞以及周细胞具有促有丝分裂作用。
我们观察到，使用小鼠IV型胶原和人纤维连接蛋白的混合物处理塑料器皿和滤膜，与传统推荐使用的鼠尾I型胶原相比，可显著提高细胞增殖产量，达2倍之多。细胞外基质可提供促进细胞增殖的重要信号，例如整合素以及生长因子（bFGF）的激活49。已有研究指出，培养基的缓冲液浓度和pH值对细胞旁通路紧密性具有积极影响50，我们发现添加5 mM HEPES缓冲液后，不同培养之间的重复性更佳。
脑微血管内皮细胞的分化：在插入式滤膜上建立共培养体系
待脑微血管内皮细胞经纯化并增殖培养6天后，可将其接种于滤膜上。高密度接种对形成完整单层细胞至关重要。推荐接种密度为160×10³个细胞/滤膜。3 每12孔板滤膜接种细胞数量足以在接种后24小时形成融合的单层细胞。然而，从其微环境中分离原代脑毛细血管内皮细胞在血脑屏障构建中存在悖论 体外 模型，因为已知原代细胞尤其是脑毛细血管内皮细胞受到其微环境及周围不同类型细胞所产生的诱导因子的强烈调控。单独培养的脑毛细血管内皮细胞会迅速去分化，并丢失部分特异性的脑内皮标志物。因此，原代内皮细胞应使用低代次（P1）细胞，并通过与星形胶质细胞共培养或使用星形胶质细胞条件培养基，至少部分地重建其与微环境的联系47,51这一点在星形胶质细胞分化过程中同样成立，因为脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞之间存在双向诱导作用。将原代脑微血管内皮细胞（RBEC）与星形胶质细胞共培养，可显著诱导内皮细胞间紧密连接（TJ）的形成。52,23重新诱导的分子机制在很大程度上仍不清楚，目前多个实验室正在开展研究，以鉴定星形胶质细胞分泌的特定调节因子，这些因子可能促进内皮细胞的最佳分化53,54脑内皮细胞分泌的因子，包括白血病抑制因子（LIF），已被证明可诱导星形胶质细胞分化55,56在建立共培养体系之前，星形胶质细胞被暴露于含有糖皮质激素受体激动剂氢化可的松和共培养条件培养基的分化培养基中。已知氢化可的松可增强脑微血管内皮细胞的紧密性，在血脑屏障模型中尤其常用于大鼠来源的细胞57 和小鼠58,59 内皮细胞。在内皮细胞/星形胶质细胞共培养体系中，于培养3天后收集下室的条件培养基，并冷冻保存以备后续使用。使用共培养条件培养基可将内皮细胞分化时间缩短至3天，并在随后2天内维持最佳的细胞旁通透性，同时提高了不同培养批次间的可重复性。
总体而言，我们所描述的方案可重复地获得超过 300 ohm · cm2&#160; 的跨上皮电阻（TEER），以及平均旁细胞通透系数 Pe(LY) 为 0.26 ± 0.11&#160;× 10-3 cm/min，与目前最优的基于原代细胞的血脑屏障（BBB）模型相当22,12。本论文中所描述的方案，结合所建议的微血管酶消化调控方法，可进一步拓展应用于大鼠脊髓60 和小鼠脑组织来源的内皮细胞。
分子与功能表征
除了诱导紧密连接外，星形胶质细胞还促进脑微血管内皮细胞中P-gp等外排转运蛋白的表达61我们确实展示了外排转运蛋白P-gp在血脑屏障模型中的表达，并通过生化方法证明了P-gp外排泵定位的极性，以及通过功能实验验证了P-gp的活性。在微血管的基底膜组分中检测到GLT-1的表达，但在培养的大鼠脑微血管内皮细胞（RBEC）中未检测到。我们推测，与体内情况相比，GLT-1在培养的RBEC中表达下调 在体 条件，因此无法通过蛋白质印迹分析检测。过量的谷氨酸具有神经毒性 体内 GLT-1 负责将谷氨酸从基底侧室（实质）转运至顶侧室（血液循环）。在星形胶质细胞培养中，GLT-1 的表达水平始终很低，可通过在培养基中添加谷氨酸诱导其表达62,63.
我们还证实了位于顶膜的内流转运体（如 LRP1、LDLR 和 TfR）的表达。TfR 和 LDLR 的功能已通过转铁蛋白-Cy3（Tf-Cy3）和 DiLDL 从单层细胞管腔侧至基底侧的结合与转运实验得到验证，该结果与此前在牛源模型中的研究一致。 体外 血脑屏障模型64有趣的是，已有研究表明，星形胶质细胞对脂质的需求会增加脑毛细血管内皮细胞上LDLR的表达65,66 进一步证实了星形胶质细胞与脑血管内皮细胞之间的生理串扰，包括 体外 我们选择使用荧光染料（如 Cy3 和 DiI）来示范运输过程，因为大多数实验室都具备荧光分光光度分析条件，该方法可用于验证 体外血脑屏障 模型。然而，荧光定量的灵敏度远低于放射性检测，需要增加实验次数以获得显著数据。理想情况下，转铁蛋白（Tf）和低密度脂蛋白（LDL）通常采用放射性碘（碘-125）标记，用于此类结合/摄取和转运实验。
我们还发现，采用本方案获得的已分化内皮细胞单层在TNF-α诱导的炎症刺激下可产生响应，表现为CCL2的释放和血脑屏障（BBB）的开放。CCL2（MCP-1）及其受体CCR2参与多种中枢神经系统（CNS）病理过程，如多发性硬化症、实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）67、CNS创伤68，并被公认为在神经炎症条件下介导白细胞向CNS迁移的重要因子69,70。由于BBB开放使得CCL2在上腔（顶侧）和下腔（基底侧）之间的浓度趋于平衡，因此在本实验方案中无法判断CCL2是否存在极性分泌。因此，我们对24小时时脑微血管内皮细胞（RBEC）在顶侧腔室中实际产生的CCL2量明显低估（图5A）。
血脑屏障的总体概述与局限性 体外 模型： I体内 与 体外 啮齿类与人类的比较
许多有前景的中枢神经系统药物已证明能有效通过血脑屏障 体外 因临床前模型预测性不足而在临床试验中失败 体外 血脑屏障模型通常基于从非人类物种分离的细胞。据我们所知，该 体外 血脑屏障模型在研究蛋白质网络、信号转导、转运蛋白和受体等机制性问题时可能更具预测性。每一个待研究的机制、通路或靶点 体外 必须通过互补的环境信号（其他细胞类型、化学物质、蛋白质）来表征其调控机制&#160;并合并 原位 采用相同动物物种的研究，以及在可能的情况下，采用从人类分离的微血管和内皮细胞进行的研究，但需遵循下文所述的限制与注意事项。
体外血脑屏障（BBB）模型应被视为独立的系统，与机体调控相隔离，但仍具备主要的体内特性，并具有响应环境信号进行调控的潜力。目前尚未提出一种“理想”的体外BBB模型71,72,73，因为内皮细胞单层缺乏神经-胶质血管单元（NGVU）中的多种重要组分，且脱离了血液和机体的调控。在最常见且“最容易构建”的基于星形胶质细胞诱导分化的内皮细胞体外BBB模型中，缺乏周细胞74,16或神经元17,18，或所使用的塑料包被物、细胞外基质成分、培养基及血清的不同，可能会影响蛋白质表达，从而与体内情况产生差异75。这些模型可能表达许多体内存在的转运体，但并非全部。在某些情况下，转运参数首先在分离的微血管（最接近体内状态）中验证，然后再在细胞培养系统中进行研究76,61。
分子生物学研究使得对分离的微血管以及来自相同物种或不同物种的低代次内皮细胞培养物中的基因和蛋白质表达进行表征成为可能，这些研究最常以小型动物（如小鼠和大鼠）或牛、猪与人类之间的比较为主77,78,75,15转录组学比较 体内 和 体外 脑微血管内皮细胞显示出大量差异表达的基因转录本，其中大多数往往显著下调 体外转录编码转铁蛋白受体（TfR）等内流转运蛋白以及参与囊泡运输的蛋白质的mRNA在培养的脑微血管内皮细胞中主要呈下调状态，提示此类细胞的内吞作用和囊泡运输功能普遍减弱。通过嘌呤霉素处理提高细胞纯度，以及氢化可的松处理，可能有助于恢复更“体内-样”基因表达谱77转录组学研究还揭示了物种间的重要差异，这些差异使得基于啮齿类动物来预测人类药物吸收情况变得更加复杂 体外 血脑屏障模型75. 体外 已有关于人脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养的血脑屏障模型的描述15尽管相关，但这些模型在常规应用中较难实施，因为它们需要对死后人体组织进行受控获取，且人脑微血管内皮细胞的质量和特性因供体的年龄、疾病状况以及可能的药物治疗而存在异质性。有必要进一步努力开发新的 体外 更准确地再现生理、解剖和功能特征的模型 体内 血脑屏障。涉及三种细胞类型的共培养体系限制性很强，似乎难以常规实施。迄今为止，最复杂的 体外 血脑屏障模型是动态的 体外 包含星形胶质细胞并具有血管样结构以及模拟血流的培养基流动的模型（DIV-BBB） 75,79,80,81,82,83,84,85当脑微血管内皮细胞受到流体作用时，所产生的剪切应力会激活细胞表面的机械感受器，进而调控多种参与内皮细胞生理功能的基因表达，如细胞分裂、分化、迁移和凋亡等。80. 在体内， 血流产生的剪切应力可导致细胞接触处的有丝分裂停滞，从而促进血管内皮细胞单层结构的形成80. 正常人脑微血管内皮细胞的基因组学与蛋白质组学分析揭示了剪切应力对血脑屏障内皮细胞生理功能的影响84剪切应力有助于细胞存活、内皮细胞黏附程度更高、外排泵的诱导以及转运蛋白的更好极化75，葡萄糖代谢的调控75,86，由CYP450酶介导的氧化反应75 通过上调编码紧密连接蛋白（如occludin和ZO-1）等细胞间连接元件的基因表达，调节细胞旁通透性87,75,80 因此，TEER值较高，约为1,500 - 2,000 ohm · cm2，最接近已知的 体内 参数79,80
在生物技术和制药行业中，由于药物的常规筛选甚至高通量筛选（HTS）的需求，以及减少动物实验的努力，推动了多种细胞系的开发，以替代难以常规建立的脑微血管内皮细胞原代培养。大多数情况下，通过质粒DNA转染或逆转录病毒载体感染，将永生化基因（如SV40或polyoma病毒大T抗原或腺病毒E1A）导入脑微血管内皮细胞的原代培养物中，从而获得可长期传代的细胞模型。88,89,75已开发出多种源自脑部的内皮细胞系，例如 RBE4、GP8/3.9、GPNT、RBEC1、TR-BBBs 或 rBCEC4 大鼠细胞系88,75小鼠 b.End3 细胞系90,75， PBMEC/C1–2 猪细胞系87,75，以及hCMEC/D3人细胞系89,75其他模型基于非脑源性细胞，例如Madin-Darby犬肾（MDCK）或Caco2细胞系12,75在不同的人类脑微血管内皮细胞系中，hCMEC/D3 自2005年建立以来，已被广泛引用并改进为血脑屏障（BBB）的研究模型。91,92与原代培养相比，细胞系具有优势和局限性。它们比原代培养更易于操作，具有更长的生命周期，特征明确，且有利于大规模实验之间的可重复性。然而，细胞系可能丧失组织特异性功能，失去微环境调控能力，并获得与原始细胞差异较大的分子表型。 体内75,89特别是，由细胞系生成的单层细胞紧密性降低，TEER值较低，且表现出转运蛋白谱的变异75,89因此，尽管动物实验或原代细胞研究更为复杂，但仍常被优先选用。

许多用于治疗中枢神经系统（CNS）疾病的药物无法以具有治疗意义的浓度到达脑实质。血脑屏障（BBB）通过限制离子、肽、蛋白质甚至细胞非特异性地进出大脑，保护脑神经组织免受血浆成分波动和病原体的侵害，并维持脑实质的稳态1。
血脑屏障（BBB）的特性由特化的脑微血管内皮细胞与神经胶质血管单元（NGVU）中邻近组分（如神经元、胶质细胞（更准确地说是星形胶质细胞终足）以及包埋于基底膜中的周细胞）之间的紧密接触和相互作用所诱导并维持，该基底膜主要由IV型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖组成2,3。周细胞在毛细血管水平覆盖约22–32%的内皮细胞表面，在调控内皮细胞增殖、血管生成及炎症过程方面发挥重要作用。内皮细胞形成连续的单层结构，覆盖毛细血管内表面，其细胞间通过紧密连接（TJs）相连，这些连接在细胞顶端区域形成带状结构，有助于细胞极性的建立。星形胶质细胞调控血脑屏障的特性，并是多种重要调节因子的来源，如TGF-β、GDNF、bFGF和IL-6。缺乏GFAP且功能不完整的星形胶质细胞无法有效调控血脑屏障的特性4。神经元虽不直接参与血脑屏障的结构形成，但也能调节多种蛋白表达及血脑屏障功能的重要方面5。
为了进一步研究血脑屏障的结构、生理学和病理学， 体外 血脑屏障模型已被开发为研究工具。已从多种物种中提取脑血管内皮细胞以进行实施 体外 基于牛源低代次原代培养的血脑屏障模型6,7，猪8,9，大鼠10,11,12，小鼠13 以及人类14,15这些模型已知可模拟 体内 血脑屏障，特别是与大鼠或小鼠的胶质细胞和/或周细胞共培养时16,12和/或神经前体细胞分化的星形胶质细胞17 和/或神经元18“在实验室”模型通常使用啮齿类动物制备，因为它们便于 体外 / 体内 转基因模型来源的脑血管内皮细胞的实验与比较和/或研究19.
新开发的 体外 血脑屏障模型还被设计用于在潜在中枢神经系统药物候选物进入临床前，预测其进入大脑的能力 体内 测试15,20,21,3,6,22,11,23. 体外 血脑屏障（BBB）模型通常用于比较药物的转运情况：i）已知能够进入中枢神经系统（CNS）的药物，或在BBB上通透性低且无中枢作用的药物；ii）与在同种动物模型中测得的相同药物的表观渗透系数（Pe）进行比较。能够顺利通过BBB的药物多为脂溶性物质，主要通过脂质介导的自由扩散方式穿越脑血管内皮细胞膜（如咖啡因、卡马西平）。而一些被负向转运的药物，如地高辛、维拉帕米或环孢素A，则会被脑血管内皮细胞上的外排转运蛋白（如P-糖蛋白，P-gp）主动排出。然而，许多新开发的治疗分子属于生物药剂学范畴，例如重组蛋白、小干扰RNA（siRNA）或单克隆抗体。其中大多数无法穿越BBB，原因包括：i）缺乏特异性转运体；ii）内皮细胞紧密排列形成的屏障，阻止高分子量物质通过细胞旁路途径跨膜转运。鉴于上述限制，已采用“特洛伊木马”策略，利用针对BBB上已知受体的载体（如抗体、肽段），这些受体参与受体介导的转运或转胞吞作用（RMT），例如转铁蛋白受体（TfR）、胰岛素受体（Insulin receptor, IR）或低密度脂蛋白受体（LDLR）相关受体家族成员（LDLR、LRP1）。这些受体已在分离的脑毛细血管及血脑屏障中被证实存在。 体内24,25对这些受体（尤其是LDLR家族）的转录谱在脑内皮细胞、与星形胶质细胞共培养的脑内皮细胞以及直接从脑组织中分离的脑毛细血管中进行了分析和比较26. Pardridge24 使用针对转铁蛋白受体（TfR）的OX-26抗体开启该领域研究，随后开展了针对胰岛素受体和胰岛素样生长因子受体的抗体研究27,28。使用&#160;这些基于抗体的载体，ArmaGen Technologies 已开发出一种血脑屏障分子特洛伊马平台技术，用于将药物（包括蛋白质）递送通过血脑屏障29文献中已有大量数据表明，LRP1 在脑内皮细胞中表达，并作为强大的内吞/清道夫受体发挥作用。Western blot 分析表明，LRP1 在富含脑毛细血管的组分以及大鼠脑毛细血管内皮细胞中均有表达。30一些公司（如 Angiochem）利用源自抑肽酶的肽类载体靶向 LRP1，以促进药物高效穿过血脑屏障31然而，LRP1 也参与 Aβ 的主动转运及其从脑实质向血液的外排/清除过程32此类数据表明，LRP1 参与了跨越血脑屏障的双向转运，其作用取决于配体类型。biOasis 公司开发了 Transcend 技术，利用黑色素转铁蛋白作为载体，实现溶酶体酶和抗体等生物制剂跨越血脑屏障的递送33 而VECT-HORUS公司开发靶向LDLR的肽类载体34有数据表明，LRP和LDLR可用于转运不同的分子，例如溶酶体酶。35,36 或纳米颗粒复合物穿越血脑屏障37.
我们的研究领域是利用载体分子及载体化药物候选物向中枢神经系统（CNS）递送药物，以治疗中枢神经系统疾病。特别是，跨越血脑屏障（BBB）的药物递送需在神经炎症的背景下加以考虑。神经炎症的程度可能有所不同，但几乎普遍存在于所有中枢神经系统损伤和疾病中，包括脑炎、多发性硬化症、阿尔茨海默病等。神经炎症常伴随血脑屏障的炎症反应，并可能导致血脑屏障生理功能和通透性的改变，因为在病理状态下，细胞旁和跨细胞转运过程可能被显著增强。38,39,40,41,42,43例如，TNF-α、TWEAK 和其他细胞因子可调节炎症反应，相关实验研究 体外 血脑屏障模型已表明，其能够改变内皮细胞单层的细胞旁通透性38,39,40 并且TNF-α也会导致LDL跨细胞转运增加41全转铁蛋白42 和乳铁蛋白43.
我们的目标是建立并表征一种优化的、高度可重复的大鼠同基因型血脑屏障（BBB）模型，该模型采用原代脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞的共培养体系。我们分别使用5周龄和新生Wistar大鼠来制备脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞。其中一个挑战是建立一种能够实现“每周可重复”BBB模型制备的实验方案。为实现这一目标，整个制备流程的每一步均安排在每周固定的日期进行，从第一周的星期三开始进行脑微血管的制备。在过去三年中，几乎每周都进行了动物解剖操作。为进一步提高细胞培养的可重复性，我们建立了一套质量保证体系。所有试剂和化学品均录入数据库进行管理（包括入库日期、库存量、有效期等信息）。
该模型根据多种标准进行了表征，包括内皮细胞的排列与纯度、跨上皮电阻（TEER）、荧光素钠（LY）通透性、对促炎因子的反应、紧密连接蛋白的定性和定量表达、外排转运蛋白（如P-gp）的功能，以及参与跨内皮细胞单层转胞吞作用的受体（如转铁蛋白受体TfR或低密度脂蛋白受体LDLR）的功能。

<table><tbody><tr><td>BSA 第 V 组分，低内毒素</td><td>PAA</td><td>K45-011-500g</td><td>4 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>-20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>-20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DMEM 高糖</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td>4 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10270-098</td><td>-20 &amp;deg;C / 1 年</td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液 (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>4 &amp;deg;C / 1 年</td></tr><tr><td>小鼠 IV 型胶原酶 (10 x 1 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td>356233</td><td>-20 &amp;deg;C / 1 个月</td></tr><tr><td>人血浆纤连蛋白 (5 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td>356008</td><td>-20 &amp;deg;C / 1 个月</td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪刀，直头 (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>剪刀，直头 (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 镊子 (11 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 镊子，尖端宽度 0.8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 镊子，弯头尖端宽度 0.8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶/分散酶混合物 (2 x 5 mg)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 401 054 001</td><td>-20 &amp;deg;C / 3 个月</td></tr><tr><td>DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100 mg</td><td>-20 &amp;deg;C / 1 年</td></tr><tr><td>庆大霉素 (10 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td>4 &amp;deg;C / 1 年</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>31331-028</td><td>4 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>来自血小板贫乏血浆的牛血清 (500 ml)</td><td>Clinisciences</td><td>BT-214-100</td><td>-20 &amp;deg;C / 1 年</td></tr><tr><td>bFGF (10 &amp;micro;g)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>-20 &amp;deg;C / 6 个月</td></tr><tr><td>猪黏膜肝素钠盐 I 型</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td>4 &amp;deg;C / 1 年</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833-10 mg</td><td>-20 &amp;deg;C / 6 个月</td></tr><tr><td>ITSX</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>4 &amp;deg;C / 1 年</td></tr><tr><td>用于 12 孔板的聚乙烯悬挂式细胞培养插件</td><td>Millipore</td><td>PIRP15R48</td><td>孔径：1 &amp;micro;m&lt;br/&gt; 表面积：1.1 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1 g</td><td>-20 &amp;deg;C / 1 年</td></tr><tr><td>小鼠抗 CD31 / PECAM&amp;nbsp;</td><td>Chemicon</td><td>MAB1393，克隆 TLD-3A12 (1 mg/mL)</td><td>1/200 - 4% 多聚甲醛固定</td></tr><tr><td>兔抗冯·维勒布兰德因子</td><td>Chemicon</td><td>AB7356</td><td>1/200 - 4% 多聚甲醛固定</td></tr><tr><td>小鼠抗结蛋白</td><td>Chemicon</td><td>MAB3430</td><td>1/200 - 4% 多聚甲醛固定</td></tr><tr><td>小鼠抗波形蛋白</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>08-0052 克隆 V9, (58 &amp;micro;g/ml)&amp;nbsp;</td><td>1/50 - 4% 多聚甲醛固定</td></tr><tr><td>小鼠抗 Claudin-5</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>35-2500, (500 &amp;micro;g/ml)</td><td>1/200 - 4% 多聚甲醛固定</td></tr><tr><td>兔抗 ZO-1</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>61-7300 (250 &amp;micro;g/ml)</td><td>1/200 - 4% 多聚甲醛固定</td></tr><tr><td>兔抗 Occludin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>71-1500 (250 &amp;micro;g/ml)</td><td>1/200 - 4% 多聚甲醛固定</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488、594 标记的二抗</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>1/800</td></tr><tr><td>荧光黄 CH，二锂盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L0259</td><td>-20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>人 TNF-α</td><td>PeproTech</td><td>300-01A</td><td>-20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>大鼠 MCP-1 ELISA 试剂盒</td><td>PeproTech</td><td>900-K59</td><td>4 &amp;deg;C / -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>小鼠抗 P-糖蛋白</td><td>Covance, Eurogentec</td><td>SIG-38710-1000，克隆 C219 (1mg/mL)</td><td>1/400 - 4% 多聚甲醛固定&lt;br/&gt; 1/200（Western blot）</td></tr><tr><td>兔抗 GLT-1</td><td>Abcam</td><td>ab41621</td><td>1/1,000（Western blot）</td></tr><tr><td>罗丹明 123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83702</td><td>4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>盐酸维拉帕米</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V4629</td><td>4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>环孢素 A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30024</td><td>4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>单克隆抗 a2 巨球蛋白受体（CD91, LRP1），靶向氨基酸 4291-4344 区段内的 EGF 重复序列</td><td>American Diagnostica</td><td>3501 (100 &amp;micro;g/ml)</td><td>1/5 - 4% 多聚甲醛固定</td></tr><tr><td>小鼠抗 LDLR</td><td>R&amp;D systems</td><td>AF2255 (200 &amp;micro;g/ml)</td><td>1/50 - 4% 多聚甲醛固定</td></tr><tr><td>大鼠转铁蛋白-Cy3</td><td>Gentaur</td><td>JOR160050</td><td>4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DiILDL</td><td>Invitrogen</td><td>L-3482</td><td>4 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

建立一个 体外 大鼠血脑屏障（bbb）模型：重点关注bbb的不可渗透性与受体介导的转运

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

血脑屏障（BBB）特异性调控血液与神经组织之间的分子和细胞转运。我们的目标是建立并表征一种高度可重复的大鼠同源性 体外 使用原代大鼠脑微血管内皮细胞（RBEC）与星形胶质细胞共培养构建血脑屏障模型，用于研究跨内皮单层细胞转胞吞作用中涉及的受体。星形胶质细胞经胰蛋白酶消化后通过机械分离获得，并冻存以备后续共培养使用。RBEC来源于5周龄大鼠大脑皮层。脑组织去除脑膜和白质后，经酶消化进行机械解离。随后，将组织匀浆在牛血清白蛋白中离心，以分离血管片段与神经组织。血管片段再经二次酶消化以释放内皮细胞。残留的污染细胞（如周细胞）通过将微血管片段接种于含嘌呤霉素的培养基中进一步清除。随后将细胞传代至滤膜上，与生长于培养板底部的星形胶质细胞进行共培养。RBEC高表达紧密连接（TJ）蛋白，如occludin、claudin-5和ZO-1，且这些蛋白典型地定位于细胞边界。脑内皮单层细胞的跨内皮电阻（TEER）可达300 ohm·cm，表明其紧密连接具有高度完整性。2 平均而言，荧光黄（LY）的内皮通透性系数（Pe）重现性良好，平均值为 0.26 ± 0.11 x 10-3 cm/min。单层排列的脑微血管内皮细胞表达外排转运蛋白P-糖蛋白（P-gp），对P-gp配体罗丹明123表现出极性转运，并显示出转铁蛋白-Cy3和DiILDL特异性穿越内皮细胞单层的运输能力。综上所述，我们提供了一种建立 体外 由于采用了质量保证方法，该血脑屏障模型具有高度可重复性，适用于血脑屏障转运蛋白和受体相关研究。

本研究的目的是验证一种方法的可重复性 体外 涉及大鼠同源性内皮细胞与星形胶质细胞共培养的血脑屏障模型。内皮细胞单层具有高TEER值和低LY通透性。检测了特定紧密连接蛋白的表达、对炎症的生理反应以及转运体和受体的功能性。

建立一个 体外 大鼠血脑屏障（BBB）模型：重点关注BBB的不可渗透性与受体介导的转运

血脑屏障（BBB）特异性调控血液与神经组织之间的分子和细胞转运。我们的目标是开发并……

本实验的总体目标是建立一种高度可重复的大鼠血脑屏障体外模型。该模型的制备首先在体视显微镜下剔除视神经、小脑和脑膜，随后分离两个大脑半球并进行解剖，以获得干净的皮层组织。第二步是通过酶消化处理及基于密度的离心法，从皮层组织中分离出微血管。接下来，将微血管接种并用嘌呤霉素孵育，以去除寄生虫等污染细胞，从而纯化内皮细胞。纯化的脑微血管内皮细胞持续增殖，直至细胞汇合度达到90%。最后一步是通过将细胞接种于插入式滤膜的上室，并与先前制备并接种的大鼠星形胶质细胞共培养，诱导大鼠脑内皮细胞分化。最终，可通过特定紧密连接蛋白的表达以及参考化合物从上室穿过内皮细胞单层的通透性指数来表征已分化的脑微血管内皮细胞单层。体外血脑屏障模型（例如本文所述模型）有助于研究关键分子的细胞分布，并揭示血脑屏障功能的基本细胞与分子机制。特别是，此类模型可使我们深入探究血脑屏障受体及其在内吞运输和转胞吞作用中的参与情况。体外血脑屏障（BBB）模型主要用于研究我们开发的肽类载体对特定受体的靶向作用。为了促进药物经血脑屏障向中枢神经系统（CNS）递送，我们采用一种称为受体介导的转胞吞作用（receptor mediated transcytosis）的方法，也被称为“特洛伊木马”策略。直观的可视化描述至关重要，因为初次接触该方法的研究人员需要具备解剖技能，并需借助显微镜快速而准确地操作，以确保细胞制备过程中组织的存活率。另一个关键点是过早终止脆弱区域以及远端鲑鱼区域，以避免在实验过程中屏障打开。最后，这一思路将展示该方案中的具体细节，这些细节将区分红色标记与可视化方案，从而证明该操作由本人及同事完成。开始此操作时，用 IV 型胶原和纤连蛋白在无菌培养用水中以每平方厘米 1 微克的浓度包被两个 T75 培养瓶，并将其置于 37°C 培养箱中孵育，直至进行微血管接种。两天后，取出三只五周龄Vista大鼠颅腔内的脑组织，转移至盛有冰上预冷的解剖缓冲液的培养皿中。在解剖显微镜下分离脑组织，去除小脑和视神经。随后在体视显微镜下将每侧脑组织沿中线切开，分离左右两个大脑半球。用另一刀切口去除中脑，并将全部四个脑组织转移至冰上装有解剖缓冲液的干净培养皿中。随后，将其中一个前脑转移至盛有冷解剖缓冲液的新培养皿中，用镊子固定，小心地从前脑边缘剥离脑膜。随后，将前脑翻转，小心地剥离脑膜，避免撕裂。确保前脑完全清除脑膜，并切断残留的视神经部分。此步骤的目的是去除白质层，从而获得一层皮层组织。首先在前脑边缘处用镊子夹住，然后小心地沿表面拖动镊子，注意不要撕破皮层表面。接着将脑组织翻转，检查是否已完全去除脑膜，确保无残留脑膜或较大的表面血管。接下来，从颅骨中取出三只脑组织后，整个解剖过程应控制在两小时以内，以保证组织的保存质量和细胞存活率。将三只大脑的皮层转移至7毫升下部匀浆器中的6毫升冷解剖缓冲液中，随后使用较大间隙的首个研杵进行10次上下研磨，再使用较小间隙的第二个研杵进行10次上下研磨，以解离皮层组织。然后将6毫升细胞悬液转移至一个新的50毫升Falcon管中，并用24毫升冷解剖缓冲液冲洗下部匀浆器，将悬液分装至三个Falcon管中，使每管含有相当于一个皮层的组织量。随后，在室温下以1000 ×g离心5分钟。观察沉淀物可见粉红色梯度，代表皮层的微血管部分。弃去上清液，将一个皮层的沉淀物与含有胶原酶混合液（collagenases dyse、DNA酶I型）及庆大霉素的1毫升酶解溶液进行匀浆。将试管置于37摄氏度摇床中孵育30分钟。然后将1毫升消化液与10毫升25% B-S-A-H-B-S-S 1×混合，轻轻涡旋混匀后，在室温下以3,600 G离心15分钟，进行密度梯度离心分离。密度梯度离心后，沉淀物中含有微血管，而上层漂浮物包含髓鞘、脑实质及残留的微血管。小心地将上层漂浮物和上清液转移至干净的50毫升Falcon管中。注意不要吸出微血管沉淀，轻轻涡旋试管，并在第二次离心过程中重复密度梯度离心。将含有微血管的最终沉淀置于 4 摄氏度保存。在第二次密度梯度离心后，小心弃去上层圆盘和 snat 混合物，并用 1 毫升冰冷的 HBSS 1× 将两次离心所得的含有微血管的沉淀重新悬浮。接着，用20毫升冰冷的1×HBSS缓冲液洗涤微血管，并在1000 ×g条件下离心5分钟。然后弃去上清液，注意不要丢失微血管。取一个皮质组织来源的微血管沉淀，加入1毫升相同的酶解溶液，轻轻涡旋混匀试管，使沉淀充分匀浆。将微血管在37摄氏度下于摇床中继续消化一小时。随后，将来自三个皮层的已消化微血管混合至一个离心管中。再次将混合物分装至两个50毫升的Falcon离心管中，使每管含有相当于一个半皮层的微血管。然后在室温下，以1000 G离心五分钟。在铺板微血管之前，从培养箱中取出两个已包被的T75培养瓶，吸除多余的包被液。弃去上清液，将微血管沉淀物重悬于1毫升ECM中，并用补充有4微克/毫升的ECM将每管定容至10毫升。使用嘌呤霉素开始纯化过程，并将微血管接种于培养瓶中。随后将培养瓶置于37°C、5% CO2的培养箱中，使微血管黏附于胶原-纤连蛋白基质，以继续进行纯化。微血管接种后24小时，用新鲜的ECM洗涤细胞碎片，并将培养基更换为添加4 μg/mL嘌呤霉素的ECM，继续在37°C、5% CO2培养箱中培养至第5天。微血管接种后24小时，内皮细胞开始在胶原-纤连蛋白基质上迁移并铺展。至第5天完成纯化过程时，用新鲜的ECM洗涤细胞碎片，并将培养基更换为添加2 μg/mL嘌呤霉素的ECM。为促进增殖，继续使用嘌呤霉素处理三天。第8天时，洗涤细胞并添加胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠。从此时起持续补充至培养基中，直至培养物在第10天达到90%融合度。第8天，通过在无菌培养用水中加入终浓度均为每平方厘米0.5微克的胶原IV型和纤连蛋白混合液，对三个12孔板的滤膜进行包被处理。首先，在下室加入1.5毫升无菌培养用水。然后向上面的隔室中加入0.5毫升混合液。在37摄氏度下孵育，使基质黏附，直至同一天接种内皮细胞，即在共培养建立前五天。在37摄氏度下从冻存管中解冻星形胶质细胞，并将细胞转移至含有10毫升GCM的15毫升离心管中，进行离心。在室温下以120 ×g离心八分钟。然后将星形胶质细胞沉淀重悬于GCM中，并以每平方厘米30,000个细胞的密度接种。在第10天，于使用胰蛋白酶解离RBEC之前，将12孔板放入37°C、5% CO2的培养箱中。用 DMM F 12 培养基清洗预编码滤膜，用 ECM 预填充小室，并将其放回培养箱，待同日进行 RBEC 接种。用不含钙和镁的 DPBS 清洗 RBEC 两次。每瓶 T 75 培养瓶加入 4 毫升预热至 37 摄氏度的胰蛋白酶 EDTA 溶液，作用 exactly 30 秒后，移除 3.5 毫升胰蛋白酶 EDTA 溶液。确保胰蛋白酶EDTA始终覆盖内皮细胞层。随后在显微镜下观察细胞脱落情况。当细胞层开始从基质上脱离时，轻轻敲击T75培养瓶边缘，直至所有细胞悬浮。向每个T 75培养瓶中加入3毫升ECM，并转移至50毫升离心管中。重复此步骤两次，通过冲洗培养基以收集全部细胞。用带黄色枪头的10毫升移液器将细胞悬液轻轻吹打4次，使细胞充分分散。计数悬液中的细胞，并于次日将细胞以高密度接种至预先编码并加好培养基的滤膜上。更换上室培养基两次，以去除细胞碎片，避免在换液过程中破坏细胞单层。轻微倾斜培养板，且吸液时切勿触及细胞单层，始终保留部分培养基覆盖于细胞单层上方，以避免换液过程中细胞单层干燥。每次仅洗涤六个插入式培养小室。接种后24小时，细胞单层需达到融合状态。然后在同一天，即共培养建立前的一天，在第12天用1.5毫升添加了补充剂的分化培养基替换星形胶质细胞的培养基，该时间点定义为分化的第一天。将含有RBEC的滤膜中的培养基更换为分化培养基。随后，在此条件下，将RBEC滤膜转移至含有星形胶质细胞的孔中。体外模型在三天内即可分化并表达连接相关蛋白，最佳分化状态可持续再维持三天。此处的细胞单层经免疫染色以显示汇合的脑微血管内皮细胞单层，呈现无重叠的形态特征以及典型的内皮细胞纺锤形形态，同时表达紧密连接蛋白ZO-1和occludin。12孔板中血脑屏障模型的紧密性通过检测荧光黄的转运来评估。结果以通透性或通透系数（PE）表示，单位为10⁻³厘米/分钟，当荧光素钠（LY）的PE值超过0.6 × 10⁻³厘米/分钟时，认为屏障具有通透性或处于开放状态。在过去几十年中，大量出版物和综述提供了来自不同物种的静态和动态体外血脑屏障（BBB）模型的相关信息。然而，这些模型仍然难以操作，屏障质量的可重复性仍是亟待解决的主要目标之一。观看本视频后，科研人员应能充分掌握如何构建和表征体外血脑屏障模型的方法。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

设置了一个<em&gt;体外</em大鼠血脑屏障&gt;模型（BBB）：在BBB抗渗性和受体介导的运输为中心

本视频介绍了一种利用荧光素钠分子评估体外血脑屏障通透性的通透性检测方法。...

血脑屏障模拟物通透性检测：一种用于评估示踪分子在血脑屏障模拟物中通透性的体外检测方法

本视频展示了一种利用膜插件上培养的星形胶质细胞和内皮细胞构建的体外血脑屏障（BBB）模型来研究物质渗透的方法，实验中使用了游离的FITC和负载FITC的铁蛋白。FITC标记的铁蛋白可与内皮细胞表面的受体结合，并穿过膜屏障进入下室，而游离FITC的渗透受到限制，主要保留在上室。...

研究FITC和FITC-铁蛋白通过体外血脑屏障模型的渗透性

体外荧光素异硫氰酸酯标记的载药铁蛋白穿过大鼠血脑屏障的渗透性研究：一种用于纳米制剂分子递送研究的模型

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维持血脑屏障的完整性对于中枢神经系统的稳态至关重要。本方案描述了 体外...

体外 检测血脑屏障网状血管形成与破坏的实验方法

本方案的目的是提供一种优化的流程，用于建立一个 体外 基于原代猪脑微血管内皮细胞（pBECs）的血脑屏障（BBB）模型。该模型具有高度可重复性和紧密性，适用于药物发现中的转运及细胞内 trafficking 研究。...

改进的建立方法 体外 基于猪脑内皮细胞的血脑屏障模型

本文介绍了一种利用腹腔注射荧光示踪剂并结合灌注技术的小鼠脑血管通透性检测方法，适用于血脑屏障功能障碍的动物模型。一侧半脑用于通透性的定量评估，另一侧用于示踪剂的可视化或免疫染色。该实验流程可在10只小鼠中于5至6小时内完成。...

一个 在体 内 利用荧光标记示踪剂检测小鼠血脑屏障通透性实验

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一种简单且可重复的制备新鲜分离大鼠脑微血管膜样本的方法

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一种模拟人类血脑屏障的三重共培养细胞系统

血脑屏障（BBB）在维持稳定且健康的脑环境方面起着至关重要的作用。BBB功能障碍与多种神经系统疾病相关。我们开发了一种源自干细胞的三维血脑屏障模型，用于研究脑血管病理、血脑屏障完整性，以及遗传因素和疾病如何改变血脑屏障。...

血脑屏障的重建 体外 用于建模及治疗性靶向神经系统疾病

本方案描述了一种可靠且高效的 体外...

bEnd.3 血管内皮细胞屏障功能完整性记录 通过 跨内皮电阻力检测

学习建立大鼠血脑屏障体外模型，通过酶解处理与密度梯度离心分离脑微血管，利用星形胶质细胞共培养诱导内皮细胞分化，评估紧密连接蛋白表达与跨内皮电阻值，为中枢神经系统药物递送机制研究提供可重复的功能性平台。

建立一个体外大鼠血脑屏障（BBB）模型：重点关注BBB的不可渗透性与受体介导的转运

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