Name: 小鼠膈肌功能诊断超声成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-21T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学习使用诊断超声成像技术在小鼠模型中评估膈肌收缩功能。该非侵入性方法可定量分析呼吸肌运动，为呼吸系统疾病的诊断和治疗研究提供重要数据支持。

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本工作得到俄克拉荷马大学通识基金G110、生物医学研究卓越基金以及俄克拉荷马州立大学-健康科学研究基金013000的资助。作者感谢Lauren Chen在准备本稿件过程中的协助。

所有涉及动物实验的操作均经俄亥俄州立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并依照其规定和指南进行。
1.&#160;小鼠麻醉
<ol>
	<li>准备一个干净的操作台，并在台面上铺有包裹着手术巾的恒温加热垫。加热垫温度应维持在 30 °C 至 34 °C 之间，以稳定动物的核心体温，同时减少动物可能产生的应激反应。</li>
	<li>将小鼠放入麻醉诱导舱，设置如下参数：氧气流速为 1.5 L/min，异氟烷蒸发器浓度设为 3.5%。完全镇静通常在 1 至 2 分钟内完成。若无诱导舱，可使用钟形罩，并在底部放置金属网，以避免动物直接接触异氟烷。</li>
	<li>一旦小鼠完全麻醉（表现为失去自主运动功能），应立即将其从诱导舱中取出。为动物连接鼻式面罩以维持麻醉状态。此时氧气流速应降至约 0.5 L/min，异氟烷蒸发器浓度应调节至 1.5% 至 2.5% 之间。
	<ol>
		<li>直接在角膜上涂抹少量眼用软膏，以减少眼部干燥8。此外，在麻醉过程中，小鼠应无足底回缩反射，黏膜应保持粉红色，呼吸应平稳。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2.&#160;诊断性超声成像操作的准备工作
<ol>
	<li>使用可移除的粘合剂（如外科胶带）将小鼠的每条腿固定在加热的手术台上。</li>
	<li>使用电动剃刀去除腹部至胸腔中部区域腹侧体表的毛发。涂抹脱毛膏以进一步清除剃刀未能去除的残留毛发。2–3 分钟后，用湿润的纱布垫擦去脱毛膏。</li>
	<li>用蘸水的纱布垫清除多余的毛发，并用 70% 酒精或其他等效消毒剂清洁剃毛区域。超声探头将放置于此区域以观察膈肌功能。若动物因脱毛出现轻微皮肤刺激，可给予局部镇痛剂。</li>
</ol>
3.&#160;诊断性超声成像方案
<ol>
	<li>打开超声设备，并根据需要通过百分比调节设备的输出功率，以获得最佳分辨率。</li>
	<li>在成像前将超声机设置为B（亮度）模式、M（运动）模式，或两者同时使用，以便清晰观察小鼠膈肌的收缩情况。</li>
	<li>在小鼠上腹部涂抹少量超声耦合剂，并将其向胸腔方向轻轻按摩。</li>
	<li>将超声探头置于该区域，并向上倾斜朝向心脏方向。调整探头位置，直至图像达到最佳分辨率。注意：本实验方案推荐使用微凸阵探头或线性相控阵探头，因其接触面积小且轴向分辨率优异9；需在带宽范围内调节频率，本实验可采用6.5-12 MHz的频率范围。</li>
	<li>按下冻结按钮，临时保存膈肌图像并查看选定的收缩图像。</li>
	<li>将记录保存为动态图像序列（cine loop），以便后续测量膈肌移动幅度及呼吸频率。注意：图像帧可保存在计算机内存或外接硬盘中，用于后续分析9。
	<ol>
		<li>使用超声软件内置的电子卡尺&#160;，精确测量膈肌从舒张到收缩的移动深度。</li>
		<li>将动态图像序列文件转换为MPEG格式，并通过计算记录时段内膈肌收缩次数来确定呼吸频率。或者，也可直接从M型图像中计数每分钟收缩次数（呼吸频率）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4.&#160;麻醉后动物恢复
<ol>
	<li>小鼠应在1小时内完全从麻醉中恢复。在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得将其无人看管。</li>
</ol>

<ol><li>Snyder, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementarity+of+ultrasound+and+fluorescence+imaging+in+an+orthotopic+mouse+model+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer.</a> BMC Cancer. 9, 106(2009).</li>
<li>Franchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+assessment+of+cardiac+function+in+a+mouse+model+of+renovascular+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension+Research%3A+Official+Journal+of+the+Japanese+Society+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Non-invasive assessment of cardiac function in a mouse model of renovascular hypertension.</a> Hypertension Research: Official Journal of the Japanese Society of Hypertension. , (2013).</li>
<li>Coatney, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+imaging%3A+principles+and+applications+in+rodent+research%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal+%2F+National+Research+Council%2C+Institute+of+Laboratory+Animal+Resources%22%5BJournal%5D)">Ultrasound imaging: principles and applications in rodent research.</a> ILAR Journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 42, 233-247 (2001).</li>
<li>Morenz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+air+trapping+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+by+low+frequency+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Detection of air trapping in chronic obstructive pulmonary disease by low frequency ultrasound.</a> BMC Pulmonary Medicine. 12, 8(2012).</li>
<li>Gilliam, L. A., Moylan, J. S., Ann Callahan, L., Sumandea, M. P., Reid, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin+causes+diaphragm+weakness+in+murine+models+of+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin causes diaphragm weakness in murine models of cancer chemotherapy.</a> Muscle & Nerve. 43, 94-102 (2011).</li>
<li>Ferreira, L. F., Campbell, K. S., Reid, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+sulfur-containing+antioxidants+in+delaying+skeletal+muscle+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+and+Science+in+Sports+and+Exercise%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of sulfur-containing antioxidants in delaying skeletal muscle fatigue.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 43, 1025-1031 (2011).</li>
<li>Zuo, L., Clanton, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+formation+in+the+transition+to+hypoxia+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species formation in the transition to hypoxia in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 289, 207-216 (2005).</li>
<li>Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+tracheal+instillation+of+solutes+into+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Hedrick, W. R., Hykes, D. L., Starchman, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHedrick%2C+WR+%22Ultrasound+Physics+and+Instrumentation%22">Ultrasound Physics and Instrumentation</a>. , 4th edn, Elsevier Mosby. 445 (2005).</li>
<li>von Sarnowski, B., Khaw, A. V., Kessler, C., Schminke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+microconvex+array+transducer+for+the+ultrasonographic+examination+of+the+intrathoracic+segments+of+the+supraaortic+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimaging%3A+Official+Journal+of+the+American+Society+of+Neuroimaging%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a microconvex array transducer for the ultrasonographic examination of the intrathoracic segments of the supraaortic arteries.</a> Journal of Neuroimaging: Official Journal of the American Society of Neuroimaging. 20, 246-250 (2010).</li>
<li>Stocksley, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStocksley%2C+M+%22Abdominal+Ultrasound%22">Abdominal Ultrasound</a>. , Cambridge University Press. 7-8 (2001).</li>
<li>Kremkau, F. W., Taylor, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifacts+in+ultrasound+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrasound+in+Medicine%3A+Official+Journal+of+the+American+Institute+of+Ultrasound+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Artifacts in ultrasound imaging.</a> Journal of Ultrasound in Medicine: Official Journal of the American Institute of Ultrasound in Medicine. 5, 227-237 (1986).</li>
<li>Kremkau, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Ultrasound%3A+Principles+and+Instruments%5BTitle%5D)+AND+%22Saunders+Elsevier%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Ultrasound: Principles and Instruments.</a> Saunders Elsevier. , 7th edn, 521 (2006).</li>
<li>Laing, F. C., Kurtz, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+ultrasonic+side-lobe+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">The importance of ultrasonic side-lobe artifacts.</a> Radiology. 145, 763-768 (1982).</li>
<li>Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+ultrasound+physics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Emergencies%2C+Trauma%2C+and+Shock%22%5BJournal%5D)">Clinical ultrasound physics.</a> Journal of Emergencies, Trauma, and Shock. 4, 501-503 (2011).</li>
<li>Gargani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+ultrasound%3A+a+new+tool+for+the+cardiologist%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Ultrasound%22%5BJournal%5D)">Lung ultrasound: a new tool for the cardiologist.</a> Cardiovascular Ultrasound. 9, 6(2011).</li>
<li>Sanders, R. C., Winter, T. Clinical Sonography A Practical Guide. , 4th edn, Lippincott Williams & Wilkins. 632 (2007).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本实验方案通过非侵入性、体内方法，建立针对小鼠模型膈肌活动的诊断性超声成像技术。麻醉设备的参数设置为近似值，由于个体小鼠对麻醉的反应可能存在差异，可针对每只动物进行轻微调整。为防止麻醉给药不当，需定期监测小鼠的生命体征，包括心率、呼吸频率和体温。此外，在进行超声扫描前必须去除毛发，因为未剃除的毛发可能导致图像模糊，影响对膈肌收缩的准确观察。
我们采用B型超声成像技术获取小鼠膈肌的二维（2D）横断面图像，并利用M型超声监测膈肌运动的动力学特征。在获取2D图像时，应使用微凸阵列探头，因为与传统的线性阵列探头相比，该探头能够提供更优的浅表解剖结构轴向分辨率10。此外，需要注意的是，随着焦距的延长，图像的电子聚焦性能会下降9。同时，在小鼠腹部应涂抹足量的超声耦合剂，以获得清晰的图像。耦合剂可减少皮肤与探头之间形成气泡的可能性，从而有助于生成高分辨率图像11。
尽管诊断性超声成像的应用前景广阔，但将其作为研究工具使用时仍存在一定的局限性。例如，操作者必须...

近年来，诊断性超声成像技术已被应用于肾血管性高血压和胰腺癌的小鼠模型研究1,2.&#160;然而，这些技术尚未在啮齿类动物呼吸肌功能检测中得到广泛应用。因此，我们开发了一种诊断性超声成像方法，作为评估呼吸肌功能的有力工具 体内 小鼠膈肌活动能力的纵向评估
诊断性超声成像具有多项优势。例如，它具有无创性、安全性高、便于携带，且能够在相对较低的成本下实现实时测量3。特别是某些低频超声设备能够检测到气体潴留，这是慢性阻塞性肺疾病（COPD）在轻度至重度气流受限情况下的临床特征之一4。因此，诊断性超声成像可作为一种易于获取且可重复的筛查方法，用于呼吸系统疾病的实时监测。
诊断性超声成像技术通常应用于较大的动物或人类受试者。然而，针对小鼠模型的超声成像研究相对较少，这可能是由于在小型受试对象上实施超声检查存在技术挑战。本方案介绍了一种用于测量小鼠膈肌功能的创新性操作流程。此外，尽管已有若干关于啮齿类动物膈肌功能的研究，但大多数结果均是通过直接从安乐死动物体内分离肌肉条带来获得的5-7。相比之下，采用体内诊断性超声成像方法分析膈肌活动，可减少实验中所需牺牲的动物数量。此外，通过超声技术可在不牺牲动物的情况下，准确评估针对增强膈肌收缩力的长期治疗效果。
在我们的实验室中，我们开发了一种利用超声设备有效观察和分析小鼠膈肌活动的方法，该方法有助于理解膈肌功能 体内避免对动物使用侵入性方法，并有助于呼吸功能障碍的治疗方案开发。

<table><tbody><tr><td>兽用数字超声诊断成像系统</td><td>Edan</td><td>DUS 3 VET</td><td>超声参数包括：频率 6.5 MHz，深度 29 mm。注意：本方案可使用同等性能的超声设备</td></tr><tr><td>微凸阵探头</td><td>Edan</td><td>C611</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>GE Logiq i 便携式超声仪（HCU）&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE Logiq i 便携式超声仪（HCU）</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>GE 12 MHz 线阵探头</td><td>GE Healthcare</td><td>12L-RS</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>兽用麻醉蒸发器</td><td>Webster Veterinary</td><td>序列号：W422021</td><td>仅使用异氟烷（或同等麻醉剂）配合该蒸发器。自行组装定制的麻醉诱导室用于初始麻醉，维持麻醉则通过鼻罩实施</td></tr><tr><td>Isothesia（异氟烷，USP）</td><td>Butler Schein</td><td>29405 250ML PVL</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Enviro-pure 麻醉吸收罐</td><td>Surgivet Smiths Medical PM, Inc.</td><td>部件号：32373B10</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>超声耦合凝胶</td><td>HM Sonic</td><td>N/A</td><td>或同等产品&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Puralube 兽用眼膏</td><td>Puralube</td><td>NDC 17033-211-38</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Deltaphase 恒温加热垫</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>39DP</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>脱毛剂</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>电动剃毛器</td><td>Remington</td><td>HC-5015</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>手术胶带</td><td>3M Micropore</td><td>1530-1</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>纱布敷料</td><td>Dynarex</td><td>3262</td><td>或同等产品</td></tr></tbody></table>

小鼠膈肌功能的诊断性超声成像

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

啮齿类动物呼吸骨骼肌（尤其是膈肌）的功能分析通常通过侵入性外科手术分离肌肉条来进行。尽管这是一种评估肌肉功能的有效方法， 体外 膈肌活动，涉及非存活手术。将非侵入性超声成像应用于 体内 该方法具有优势，不仅减少了实验动物的牺牲数量，还适用于活体小鼠疾病进展的监测。因此，我们的超声成像方法可能有助于开发新型疗法，以缓解由多种呼吸系统疾病引起的肌肉损伤。特别是在阻塞性肺疾病的临床诊断中，超声成像有望与其他标准检测方法联合使用，以检测膈肌疲劳的早期迹象。在本实验方案中，我们描述了如何利用诊断性超声成像技术，在小鼠模型中准确评估膈肌收缩力。

小鼠膈肌的典型超声图像如图1A所示。记录了小鼠膈肌的最大垂直位移。该距离通过超声软件内置的电子卡尺精确测量膈肌从松弛到收缩时的运动深度而计算得出。表1展示了来自三只不同小鼠的膈肌收缩距离测量结果。将动态图像序列文件转换为MPEG格式后，通过计算6秒记录时间内膈肌收缩的次数来确定呼吸频率。该分析可使用B模式进行。或者，M模式可提供膈肌垂直运动及呼吸频率的可视化图像，如图1B所示。这些结果表明，该方法能够有效准确地观察小鼠膈肌收缩。此外，通过记录膈肌功能，本方案还可评估两个重要参数：膈肌位移幅度和呼吸频率。该成像方法适用于健康与病变膈肌组织之间的直接比较。然而，图2展示了进行诊断性超声成像时可能出现的潜在成像伪影。
<img alt="超声成像，动态肝脏分析；A：腹部扫描；B：随时间变化的波形与距离图。" fo:content-width="5in" fo:src="/file...

诊断性超声成像已证实可用于有效诊断人类及动物的多种呼吸系统疾病。我们展示了一项由Zuo博士实验室采用的全面超声检查方案，专门用于分析小鼠模型的膈肌运动学。该技术也是一种非侵入性研究手段，可提供关于小鼠呼吸肌功能的定量信息。

啮齿类动物呼吸骨骼肌（尤其是膈肌）的功能分析通常通过侵入性方法分离肌肉条后进行……

本实验的总体目标是演示如何在小鼠模型中准确评估膈肌收缩力。首先使用超声成像，对小鼠进行麻醉并去除其腹部毛发。随后步骤为涂抹超声耦合剂，并利用超声探头获取清晰的膈肌图像。最终，通过使用软件中的电子卡尺，该结果可显示膈肌位移和呼吸频率。与侵入性肌电图等现有方法相比，该技术的主要优势在于其非侵入性，并可减少实验中牺牲的动物数量。该技术的应用前景涵盖呼吸肌功能障碍的诊断及潜在治疗。尽管该方法可用于研究小鼠模型中膈肌的收缩力，但它也可应用于其他系统，例如临床模型，以评估疾病进展和治疗效果。准备一个洁净的手术操作台，并将等温加热垫用手术毛巾包裹后置于台上。应使用加热垫来稳定动物的核心体温，同时减少动物可能产生的应激反应。应将小鼠放入麻醉诱导室中，设置氧气流速为1.5升/分钟，并使用3.5%气化的异氟烷。通常在两分钟内开始出现镇静作用，表现为自主运动功能丧失。随后通过鼻罩气体输送维持麻醉状态。麻醉动物后，直接在角膜上涂抹少量眼用软膏，以减少麻醉期间的眼睛干燥。小鼠不应出现足蹬反射。黏膜应始终呈粉红色，且动物应保持稳定呼吸。使用可移除的粘合剂（如外科胶带）将麻醉后的小鼠每条腿固定在加热的手术台上。使用电动剃须刀，剃除从腹部至胸腔中部之间腹侧体表的大部分毛发。然后涂抹脱毛膏以去除残留的毛发。两到三分钟后，用湿润的纱布垫擦去脱毛膏。此外，用水和纱布去除多余的毛发。接着，用70%酒精或等效消毒剂擦拭剃除毛发的区域四次，并开启超声设备。由于此类探头具有较小的接触面积和优异的轴向分辨率，微凸阵列或线性相控阵换能器是理想选择。将超声频率调节至6.5至12兆赫兹的范围。随后将仪器的模式、亮度和运动模式共同设置，以获得膈肌收缩的最佳成像效果。接下来，在上腹部涂抹少量超声耦合剂，并将耦合剂向胸腔方向按摩涂抹。将超声探头置于凝胶上，并向上倾斜对准心脏。调整探头位置以优化图像分辨率。此操作具有一定难度，但随着练习会逐渐变得容易。在麻醉过程中，务必注意监测动物的呼吸，以确保检查结果不受影响。按下冻结按钮，可暂时保存膈肌图像并查看选定的收缩。将记录保存为 cyl 循环，以便后续测量膈肌移动度和呼吸频率。成像结束后，小鼠应在30分钟内完全从麻醉中恢复。在动物恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不得将其无人看管。为在M模式下分析数据，使用超声软件自带的电子卡尺测量膈肌从舒张到收缩的运动深度和速率。或者，在B模式下，将CINA循环文件转换为MP4文件，并通过计算记录期间膈肌收缩的次数来确定呼吸频率，也可在B模式下使用电子卡尺测量膈肌移动的深度。记录一只小鼠膈肌的最大垂直位移，并按照方案中所述方法使用电子卡尺计算距离。此类测量在三只不同的小鼠上进行。例如，在将 CIL 循环文件转换为 MP4 文件后，通过计算六秒记录时间内膈肌收缩的次数来确定呼吸频率。该分析采用 B 模式进行。此外，M 型超声可提供膈肌垂直运

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