脑微切片的兴奋性毒性刺激作为一种方法 体外 卒中模型

本实验的总体目标是通过对新鲜分离脑组织制备的脑微切片施加细胞毒性刺激，以建立体外脑卒中模型。该过程首先从新鲜分离的脑组织中制备微切片，第二步是通过轻柔振荡使微切片达到平衡状态。

平衡后，微切片即可接受多种实验处理。最终结果表明，微切片在制备后至少两小时内仍保持活性。与现有的其他技术（如原代胚胎神经元培养）相比，本技术的主要优势在于利用了成熟脑组织的切片，其中包含多种细胞类型，因而更能代表完整的脑组织。

第一步是获取新鲜的脑组织。将脑组织浸入少量温热的Krebs缓冲液中。为去除残留的皮肤、毛发或血液，使用两片用温热Krebs缓冲液润湿的滤纸制备Macle Wain切碎器。

准备就绪后，将脑组织置于切片机的载物台上。操作过程中，用温热的克雷布斯缓冲液保持脑组织和滤纸湿润，以防止脑组织滑动。注意避免液体在表面过多积聚。

将脑组织切成250微米厚的冠状切片。接着，将载物台旋转90度，制备250微米厚的矢状切片。此步骤完成后，脑切片被称为微小切片（micro slices）。

将微切片放入圆底管中，加入10至15毫升温热的Crebs缓冲液。轻轻振荡试管，直至单个微切片悬浮，然后静置使其在重力作用下自然沉降。小心移除上清液（由于悬浮的细胞碎片，上清液会呈浑浊状），并向试管中加入10毫升新鲜的温热Crebs缓冲液。

重复洗涤步骤四次，以彻底去除大部分碎片。将微切片在37摄氏度下轻轻振荡或翻转平衡，并在总共一小时内每15分钟更换一次Krebs缓冲液。此后，加入2毫升新鲜的37摄氏度Krebs缓冲液，将15至20片微切片转移至一个平底聚苯乙烯5毫升试管中。

使用边缘光滑的超宽孔径移液吸头，将微切片均匀地在管底铺成单层，确保每一片微切片距离氧合环境不超过几毫米。正确排布后，将微切片置于37°C水浴中孵育，以保证充分的氧气供应。为获得最佳效果，需持续通过气体管线向微切片悬液通入碳合气体（carbogen），气体管线应置于液面正上方，避免气体直接接触微切片造成机械性破坏。

必须正确地对微切片进行通气。气体管路与微切片悬浮液表面之间需保持适当的距离至关重要。可将多条管路融合在一起，以实现多个刺激同时进行。

同时，可以使用多种刺激方法。在此示例中，微切片接受AMPA刺激。用细胞毒性刺激物或仅用Krebs缓冲液处理微切片。

作为刺激组的对照，在刺激后的不同时间点去除孵育液，并在所需时间点更换为300微升冰上预冷的匀浆缓冲液。刺激后，将微切片置于冰上，使用玻璃-聚四氟乙烯（Teflon）下冲式匀浆器进行匀浆，随后将匀浆液于-80摄氏度保存，直至进行后续分析。

呼吸速率结果表明，从鸡前脑采集的微切片在制备后两小时内仍具有活性。微切片中高ATP和低ADP水平也符合活细胞的特征。在此示例中，检测了组织钾含量，发现解剖后略高于背景值；在用Krebs缓冲液孵育后，钾含量上升；而加入WABE和EGTA后，组织钾含量下降，表明微切片通常具有主动泵入钾离子的能力，且钾含量并非来源于死亡组织或间质空间中滞留的钾。

在此实验中，从雄性大鼠的纹状体和感觉皮层制备微小脑片，并使用高钾克雷布斯缓冲液进行去极化处理。胶质细胞凝集素N二B的磷酸化速率在皮层与纹状体之间存在差异，而胶质细胞凝集素A一的磷酸化速率在这两个区域之间则相似。一旦掌握该技术，若操作正确，可在约两小时内完成。