Name: 脑Microslices的兴奋性刺激作为在体外中风模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 了解脑微切片兴奋性刺激技术，用于建立体外中风模型并研究神经毒性损伤机制。该方法利用成熟脑组织切片，保持细胞间相互作用，可维持至少两小时活性，为神经科学研究提供可靠平台。

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本工作得到了澳大利亚国家卫生与医学研究理事会、亨特医学研究所和纽卡斯尔大学研究基金的支持。&#160;

所有操作均经纽卡斯尔大学动物护理与伦理委员会批准，并遵循相关指南和法规，包括新南威尔士州动物研究法、新南威尔士州动物研究条例以及《澳大利亚科学用途动物护理与使用实践规范》。
1. 脑组织的解剖
<ol>
	<li>通过断头法处死十二周龄雄性大鼠。大鼠可通过击晕后断头法处死，或先用异氟烷（5%诱导，1.5–2%维持）在70% N₂O和30% O₂混合气体中麻醉后再进行断头。2 和 30% O2，然后断头处死。</li>
	<li>尽快将脑组织从颅骨中取出（理想情况下应在2分钟内完成）。</li>
	<li>通过徒手解剖去除皮层。解剖过程应尽可能迅速完成，并尽量减少对脑组织的损伤，以保持脑片的完整性。</li>
	<li>为了去除任何残留的皮肤、毛发和血液， 等等。将脑组织浸入少量（3–5 ml）37 °C 的 Krebs 缓冲液中（含 118 mM 氯化钠、4.7 mM 氯化钾、1.3 mM 氯化钙、1.2 mM 磷酸二氢钾、1.2 mM 硫酸镁、25 mM 碳酸氢钠、11.7 mM 葡萄糖、0.03 mM 乙二胺四乙酸二钠（EDTA），用 95% 氧气/5% 二氧化碳（碳合气）平衡，pH 7.4）。</li>
</ol>
2. 微切片的制备
<ol>
	<li>将脑组织置于McIlwain切片机的载物台上，载物台上已放置两张滤纸并用温热的Krebs缓冲液润湿。保持脑组织和滤纸湿润，但不可过于潮湿，以免滤纸表面出现自由流动的液体导致脑组织滑动。</li>
	<li>将脑组织切成250 µm厚的冠状切片。由于在离体神经组织中，营养物质、氧气和代谢废物需通过组织周围液体进行交换，而非通过血液供应，因此切片厚度不应超过400 µm，以确保充分的氧合和营养交换。</li>
	<li>将McIlwain切片机载物台旋转90°。</li>
	<li>将脑组织切成250 µm厚的矢状切片。本文中，这些脑切片（250 µm&#160;× 250 µm，长度因组织厚度而异）被称为微切片（microslices）。</li>
	<li>将微切片放入一个圆底试管中，加入10–15 ml 37 °C的Krebs缓冲液（所用Krebs缓冲液的体积取决于组织量）。</li>
</ol>
3. 微切片的平衡
<ol>
	<li>轻轻振荡，直至单个微切片悬浮，然后让其在重力作用下自然沉降。</li>
	<li>小心移除上清液（由于含有悬浮的细胞碎片，上清液会呈浑浊状），并向管中加入 10 ml 新鲜的 37 °C Krebs 缓冲液。</li>
	<li>重复此洗涤步骤四次，以去除大部分碎片。</li>
	<li>随后，在 37 °C 下轻轻振荡或翻转微切片以进行平衡，并在 1 小时内每 15 分钟更换一次 Krebs 缓冲液，共更换四次。</li>
	<li>此时，加入 2 ml 新鲜的 37 °C Krebs 缓冲液，使用带有平滑边缘的超宽孔径移液器吸头（可通过从 P1000 吸头末端剪去约 2 mm 制得），将 15–20 个微切片（150 µl 微切片悬液）转移至平底聚苯乙烯 5 ml 管中。将微切片均匀铺展在管底，形成单层，确保每个微切片距离含氧大气不超过几毫米。</li>
</ol>
4. 兴奋性毒性刺激
<ol>
	<li>将微切片在37 °C孵育，并使用位于微切片悬浮液表面正上方的供气管持续向150 µl微切片悬浮液表面通入碳氧混合气（避免机械扰动）。</li>
	<li>用150 µl含5 mM谷氨酸和100 µM甘氨酸的Krebs缓冲液（兴奋性毒性刺激：终浓度为2.5 mM谷氨酸和50 µM甘氨酸）或仅用150 µl Krebs缓冲液（对照未刺激组）处理微切片。此步骤可采用多种刺激方式（包括但不限于AMPA、NMDA+甘氨酸、KCl去极化以及氧糖剥夺）。</li>
	<li>在刺激后的不同时间点（0、30、60、90、120 和 300 秒）移除孵育液，并加入 300 µl 冰冷的匀浆缓冲液（30 mM Tris，pH 7.4，1 mM 乙二醇四乙酸，4 mM EDTA，100 µM 钼酸铵，5 mM 焦磷酸钠，25 mM 氟化钠，1 mM 正钒酸钠，1 mM 苯甲基磺酰氟，完全蛋白酶抑制剂混合物）。</li>
	<li>在冰上使用玻璃-聚四氟乙烯Dounce匀浆器匀浆微切片（20次；700 rpm）。</li>
	<li>将匀浆液在 -80 °C 下保存，并保存各种信号分子、死亡相关分子， 等等。 可通过蛋白质印迹法检测。</li>
</ol>

<ol><li>Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+challenges+and+opportunities+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, challenges and opportunities in stroke.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).</li>
<li>Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+of+excitotoxic+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death.</a> Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).</li>
<li>Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cAMP%2FPKA+and+MAPK+signaling+in+neuronal+cells+is+dependent+on+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage.</a> Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).</li>
<li>Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+effect+of+protein+synthesis+inhibitors+on+potassium+deficiency-induced+apoptotic+cell+death+in+immature+and+mature+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures.</a> J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).</li>
<li>Kristensen, B. W., Noraberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+excitotoxic+profiles+of+ATPA%2C+AMPA%2C+KA+and+NMDA+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).</li>
<li>Lecrux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneously+hypertensive+rats+are+highly+vulnerable+to+AMPA-induced+brain+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions.</a> Stroke. 38, 3007-3015 (2007).</li>
<li>Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+influx+pathways%2C+not+calcium+load%2C+determine+neuronal+vulnerability+to+calcium+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity.</a> J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).</li>
<li>Morrison, B. 3rd, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+central+nervous+system+models+of+mechanically+induced+trauma%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).</li>
<li>McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Neurochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Practical Neurochemistry.</a> , Churchill Livingstone. London. (1975).</li>
<li>Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha+CaMKII+is+differentially+regulated+in+brain+regions+that+exhibit+differing+sensitivities+to+ischemia+and+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).</li>
<li>Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3H%5DMK-801+binding+in+immature+and+mature+chicken+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).</li>
<li>Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+glutamate+receptor+stimulated+inositol+phospholipid+metabolism+and+45Ca%282%2B%29-accumulation+in+posthatch+chicken+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).</li>
<li>Sharps, E. S., McCarl, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+performance+liquid+chromatographic+method+to+measure+32P+incorporation+into+phosphorylated+metabolites+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells.</a> Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).</li>
<li>Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurment+of+the+ADP%3AATP+ratio+in+human+leukaemic+cell+lines+can+be+used+as+an+indicator+of+cell+viability%2C+necrosis+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis.</a> J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).</li>
<li>Rodnight, R., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+tissue+metabolism%3A+3.+Study+of+tissue+fragments+with+little+or+no+added+aqueous+phase%2C+and+in+oils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils.</a> Biochem. J. 57, 649-661 (1954).</li>
<li>Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+assembly+in+the+absence+of+added+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microtubule assembly in the absence of added nucleotides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).</li>
</ol>

作者声明，本论文所开展的工作不存在任何利益冲突。

在此，一种 体外 一种用于制备微切片的技术，可用于研究兴奋性毒性及缺血介导的细胞死亡在完整成熟脑组织中的分子机制。该技术可产生具有活性的组织（图1-3），其代谢特征与较大的器官型脑片相似15此外，该微切片模型与兴奋性毒性介导的脑损伤后观察到的反应高度一致。 体内1090秒 体外 AMPA、NMDA 或谷氨酸对脑微片进行刺激，可在多种分子中诱导出相同的反应例如&#160;CaMKII、GluN2B 和 GluA1）作为90秒的阻断期 体内10这进一步验证了本文所述的脑片模型是一种有效的方法，可用于研究缺血和兴奋性毒性介导的细胞死亡所涉及的分子机制。
与任何实验技术一样，该操作流程可以进行多种调整，而这些调整可能会影响也可能不会影响实验结果。根据经验，本文详述的方案代表了获得最高组织产量和微切片活性的最佳条件。该方案可适用于多种物种（已成功制备大鼠、小鼠和鸡的微切片），以及任何脑区（...

最常见的中风类型是缺血性中风，当脑血管发生阻塞时即出现该病症。血流中断所导致的组织缺血会引起细胞膜广泛去极化、兴奋性神经递质释放以及细胞内钙离子持续升高，进而激活细胞死亡通路1。这一过程被称为“兴奋性毒性”，是多种病理状态（包括中风）引起神经元死亡的共同通路2。抑制兴奋性毒性及其他神经元死亡级联中的信号通路，是减轻中风后神经元损伤的一种有前景的策略。
确定兴奋性毒性及缺血性脑卒中中所涉及的精确分子机制在使用整体动物系统时可能较为困难。因此，原代胚胎神经元及“类神经元”（例如 神经母细胞瘤和腺癌永生化细胞系等细胞培养系统常被使用。这些模型的主要优势在于易于操作、相对经济，并且可以方便地检测和量化细胞死亡。然而，所采用的培养条件可能会改变信号通路 3,4，且与成熟脑组织相比，未成熟神经元和永生化细胞系可表达不同的受体和信号分子 5-8此外，培养的神经元仅能用于研究一种细胞类型（或两种，若使用共培养系统），而完整的脑组织具有异质性，包含多种相互作用的细胞类型。器官型脑片培养系统（脑组织的薄片外植体）也可用于此类研究，这些模型能够保留细胞在体内所处的异质性群体环境，从而允许对其进行研究 体内然而，使用该技术时从每只动物获取的组织量有限，且脑片无法像永生化细胞系那样进行长期培养，中长期培养还可能导致脑片中信号通路和受体发生改变。尽管可以利用成熟脑组织制备器官型脑片，但来自未成熟脑组织的脑片更易于培养，因此更为常用。因此，有必要开发能够模拟或代表完整成熟脑组织、易于操作且可用于研究神经元信号通路的模型。
在此，一种 体外 一种涉及完整神经组织的技术，可用于阐明兴奋性毒性或缺血性损伤后细胞死亡相关的分子机制。该技术可减少实验所需的动物数量，具有良好的可重复性，并能产生代谢行为与较大体积的器官型脑片相似的存活组织。此外，神经元环路、细胞间相互作用以及突触后区室部分保持完整。所使用的生理缓冲液有助于细胞膜“重新封闭”，并使细胞恢复原有的膜电阻。 9该脑切片模型能够真实模拟兴奋性毒性介导的脑损伤后所观察到的反应 10可用于研究中风相关的分子机制。

<table><tbody><tr><td>断头台</td><td></td><td></td><td>用于动物断头处死</td></tr><tr><td>外科手术器械</td><td></td><td></td><td>镊子、剪刀、镊子 &lt;em&gt;等等。&lt;/em&gt;用于脑组织的取出与解剖</td></tr><tr><td>麦克尔文切片机</td><td>McIlwain切片机由多家公司生产或销售，包括Mickle Engineering、Harvard Apparatus、Campden Instruments和Ted Pella。</td><td></td><td>用于生成 100-400 &amp;#181;脑切片</td></tr><tr><td>圆底塑料管</td><td>格雷纳</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td>为了保持组织在37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>加湿器/通气装置</td><td></td><td></td><td>用于将微切片置于湿润且充氧的环境中保存</td></tr><tr><td>平底聚苯乙烯管</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜恩斯匀浆器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

脑微切片的兴奋性毒性刺激作为一种方法 体外 卒中模型

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

研究缺血性中风等神经病理状况所涉及的分子机制时，使用整体动物系统可能会存在困难。因此，通常采用原代或“类神经元”细胞培养系统。虽然&#160;这些系统相对易于操作，是可用于便捷量化多种功能结果（如细胞死亡）的有用模型系统。然而，在培养的未成熟神经元中所研究的结果和通路（如兴奋性毒性介导的细胞死亡通路）并不一定与成熟脑组织或完整组织中观察到的相同。因此，有必要建立能够研究成熟神经组织中细胞机制的模型。我们已开发出一种 体外 一种可用于研究完整神经组织中多种分子通路的技术。本文所述技术采用大鼠皮层组织，但该技术可经调整后用于多种物种（如小鼠、兔、豚鼠和鸡）或脑区（例如海马、纹状体）的组织。 等等。）。此外，可采用多种刺激/处理方法（例如，兴奋性毒性刺激、抑制剂给药， 等等。综上所述，本文所述的脑切片模型可用于研究兴奋性毒性介导的脑损伤中涉及的多种分子机制。

采用本方案制备的微切片具有活性，可用于制备微切片的物种包括多种动物（例如大鼠、小鼠和鸡）。已采用三种独立指标评估活性：呼吸速率（图1）、腺苷酸核苷酸比值（图2）以及组织钾含量（图3）。通过这些指标证明，微切片在制备后至少2小时内仍保持活性。
脑组织微切片可用于检测多种刺激（例如 KCl 去极化 [图4]、AMPA、NMDA、谷氨酸刺激10）后各类信号分子的变化，也可用于比较不同脑区中细胞信号分子的反应（图4）。此外，还可利用该方法检测各种抑制剂或药物处理对这些分子的影响（如激酶抑制剂10、谷氨酸受体激动剂11、反式-鹅膏氨酸12）。
<img alt="蛋白质与呼吸速率关系图；代谢...

我们建立了一种脑切片模型，可用于研究兴奋性毒性介导的脑损伤所涉及的分子机制。&#160;该技术可获得具有活性的成熟脑组织，在部分保留神经元回路、细胞间相互作用及突触后区室的同时，减少了实验所需的动物数量。

研究缺血性中风等神经病理状况所涉分子机制时，使用整体动物系统可能面临诸多困难。

本实验的总体目标是通过对新鲜分离脑组织制备的脑微切片施加细胞毒性刺激，从而建立体外卒中模型。该过程首先从新鲜分离的脑组织中制备微切片，第二步是通过轻柔振荡使微切片达到平衡状态。平衡后，微切片即可接受多种实验处理。最终结果表明，微切片在制备后至少两小时内仍保持活性。与现有的其他技术（如原代胚胎神经元培养）相比，本技术的主要优势在于利用了成熟脑组织的切片，其中包含多种细胞类型，因而更能代表完整的脑组织。第一步是获取新鲜的脑组织。将脑组织浸入少量温热的Krebs缓冲液中。为去除残留的皮肤、毛发或血液，使用两片用温热Krebs缓冲液润湿的滤纸准备好麦氏切碎器（macle wain chopper）。准备就绪后，将脑组织放置在切片机的载物台上。操作过程中，用温热的克雷布斯缓冲液保持脑组织和滤纸湿润，以防止脑组织滑动。注意避免液体在表面过多积聚。将脑组织切成250微米厚的冠状切片。接着，将切片台旋转90度，制备250微米厚的矢状切片。此步骤完成后，脑切片被称为微切片。将微切片放入一个圆底管中，加入10至15毫升温热的Crebs缓冲液。轻轻振荡试管，直至单个微切片悬浮，然后静置使其在重力作用下自然沉降。小心移除上清液（由于含有悬浮的细胞碎片，上清液会呈浑浊状），并向试管中加入10毫升新鲜的温热Crebs缓冲液。重复洗涤步骤四次，以彻底清除大部分碎片。将微切片置于37摄氏度下，通过轻柔振荡或翻转进行平衡，并在总共一小时内每15分钟更换一次Krebs缓冲液。此后，加入2毫升新鲜的37摄氏度Krebs缓冲液，将15至20个微切片转移至一个平底聚苯乙烯5毫升试管中。使用带有光滑边缘的超宽孔径移液吸头，将微切片均匀地在管底铺成单层，确保每一片微切片距离氧合环境不超过几毫米。正确排布后，将微切片置于37°C水浴中孵育，以提供充分的氧合。为获得最佳效果，持续通过气体管线在微切片悬液上方通入碳合气（carbogen），气体管线位置应略高于液面，以避免气体直接接触造成微切片的机械性损伤。微切片必须正确通气。气体导管应置于距离微位点悬浮液表面适当距离的位置，这一点至关重要。可将多根导管融合在一起，以实现多个刺激同时进行。同时，可以使用多种刺激。在此示例中，微切片接受AMPA刺激。用细胞毒性刺激物或仅用Krebs缓冲液处理微切片。作为刺激组的对照。在刺激后的不同时间点，移除孵育液，并在所需时间点加入300微升冰上预冷的裂解缓冲液。刺激后，在冰上使用玻璃-聚四氟乙烯匀浆器对微切片进行匀浆，并将匀浆产物于-80摄氏度保存，直至进行后续分析。呼吸速率表明，从鸡前脑采集的微切片在制备后最多可维持活性达两小时。微切片中高 ATP 和低 ADP 水平也符合活细胞的特征。在此示例中，检测了组织的钾含量，发现解剖后略高于本底水平，但在 Krebs 缓冲液孵育后钾含量升高；加入 WABE 和 EGTA 后，组织钾含量下降，表明微切片通常具有主动泵入钾离子的能力，且钾含量并非来源于死亡组织或间质空间中滞留的钾。在此研究中，从雄性大鼠的纹状体和感觉皮层制备微小脑片，并使用高钾克雷布斯缓冲液进行去极化处理。谷氨酸N2B亚基的磷酸化速率在皮层与纹状体之间存在差异，而谷氨酸A1亚基的磷酸化速率在这两个区域之间则较为相似。一旦掌握该技术，若操作正确，可在约两小时内完成。

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脑Microslices的兴奋性刺激作为<em&gt;在体外</em&gt;中风模型

光血栓法是一种快速、微创的技术，可高度可重复地在特定感兴趣区域诱导产生小而界限清晰的梗死灶。该方法特别适用于研究转基因小鼠中脑可塑性相关的细胞和分子反应。...

光血栓性缺血：一种用于小鼠卒中研究的微创且可重复的光化学皮层损伤模型

本文介绍了一种内嗅-海马体脑片器官型培养的实验方案，该方法可重现缺血性脑损伤的多个方面。通过在研究神经元变化的同时，对神经血管系统的变化进行观察，该方案成为研究脑损伤后神经组织可塑性变化的多功能工具。...

内侧颞叶-海马器官型脑片培养中神经血管重塑的分析

本文介绍了一种通过局部注射不可逆的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抑制剂（L-Nio）在小鼠白质中诱导局灶性脑卒中的方法。文中展示了两种立体定位手术变体、逆行神经元示踪、新鲜组织标记与分离技术，拓展了该技术的潜在应用范围。...

一种用于研究轴突变性及白质神经生物学的多功能小鼠皮层下白质卒中模型

我们提出一种方法，该方法能够 为神经退行性变早期事件提供进一步见解，并基于已建立的 离体 脑技术，结合了以下优势 体内 和 体外...

使用替代方法研究神经退行性变早期事件 离体 大鼠脑切片

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，能够迅速响应其环境变化并发生形态学改变。本方案描述了如何利用双光子显微镜研究小鼠急性脑切片中小胶质细胞突起向血清素或三磷酸腺苷（ATP）的趋化反应。...

双光子成像技术观察急性脑切片中小胶质细胞突起对ATP或5-羟色胺的趋化反应

本文描述了鼻周皮层-海马体脑片的制备方法。在逐步且受控的血清剥夺条件下，这些脑片会表现出逐渐发展的类似癫痫样活动，可被视为一种癫痫发生的离体模型。该系统是监测自发性活动动态变化的优良工具，也可用于评估癫痫发生过程中神经炎症特征的进展。...

内嗅皮层-海马器官型脑片培养中的癫痫发生模型

本文介绍光化学血栓性脑卒中模型，该模型通过在给予光敏染料后利用激光照射，经完整颅骨诱导永久性微血管闭塞，从而产生脑卒中。...

小鼠卒中模型构建：光栓法诱导局灶性皮层损伤

本方案旨在提供一种将带血管蒂的颞肌瓣移植至缺血性脑组织软脑膜表面的脑-肌-血管融合术，用于治疗非烟雾病性急性缺血性卒中。通过小鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型，评估该方法在促进血管新生方面的有效性。...

小鼠大脑中动脉闭塞诱导卒中后脑肌吻合术治疗模型

本方案详细描述了一种优化的慢性颅窗结合微血管栓塞小鼠模型的逐步操作方法，适用于 体内 使用荧光聚苯乙烯微球进行双光子显微成像。...

用于微血管栓塞的小鼠模型 体内 使用荧光聚苯乙烯微球的双光子显微镜技术

越来越多的证据表明，缺血预处理（PC）——即对脑组织施加一次非损伤性的缺血刺激——可对后续的致损伤性缺血攻击产生短暂的保护作用。我们在C57Bl6/J小鼠中建立了双侧颈总动脉阻断（BCCAO）作为预处理刺激，以诱导对短暂性局灶性脑缺血（由大脑中动脉阻断，MCAO引起）的早期缺血耐受（IT）。...

双侧颈总动脉阻断作为诱导局灶性脑缺血早期缺血耐受的充分预处理刺激

了解脑微切片兴奋性刺激技术，用于建立体外中风模型并研究神经毒性损伤机制。该方法利用成熟脑组织切片，保持细胞间相互作用，可维持至少两小时活性，为神经科学研究提供可靠平台。

脑微切片的兴奋性毒性刺激作为一种方法体外卒中模型

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