测定蛋白酶体降解的植物无细胞系统

有针对性的蛋白质降解是一个重大的监管机制，细胞的功能。它发生通过一个保守的泛素-蛋白酶体通路，其高度多聚泛素链的靶蛋白，然后作为分子的"标签"为26S蛋白酶体。在这里，我们描述了用于蛋白质的蛋白酶体降解的简单和可靠的无细胞测定法。

以下实验的总体目标是分析无细胞系统中的蛋白质稳定性。这是通过用不同的农杆菌菌株接种 Oceana Biana 来实现的。含有二元构建体的目标蛋白。

然后从植物叶子中提取总蛋白。将叶子转移到微量离心管中，并在室温下孵育更长的时间。接下来，通过 SDS 丙烯酰胺、凝胶、电泳和电转印到硝酸纤维素膜上分离蛋白质样品。

为了使用特异性抗体检测目标蛋白质，根据 western blotting 分析获得的结果显示，在存在或不存在特异性蛋白酶体抑制剂的情况下，蛋白质具有稳定性。我们在这里描述了一种简单的方法，用于研究在无细胞系统中蛋白酶体降解途径的基本成分之一存在或不存在的情况下 INE 原型体囊底物的稳定性。因此，这些方法可以深入了解更安全的蛋白酶体降解。

它也可以应用于其他系统，例如研究调节蛋白质降解在不同细胞过程中的作用。在此演示中，使用了 NCOA hamana。该植物易于生长，对农杆菌高度敏感，叶子大，易于接种。

在长日照和 40% 至 65% 相对湿度的环境控制条件下，在含有前混 B 的花盆中种植一株植物 4 到 6 周。根据制造商的说明，偶尔使用市售产品给植物施肥。植物长大后，选择尺寸为 50 毫米 x 70 毫米或更大的叶子。

对于农杆菌接种，培养含有二元构建体的农杆菌菌株，在细胞离心后，在 28 摄氏度下在补充有适当抗生素的 YEP 培养基中表达测试蛋白质过夜，在浸润缓冲液中重悬至 600 纳米 0.5 的光密度，并在室温下孵育 2 小时。使用 1 毫升无针注射器将培养物浸润到叶子的 AAL 侧。渗透后，在相同的光照条件下将植物生长 72 小时 收获前，收获前 4 小时，用 10 微摩尔抑制剂或模拟物浸润接种农杆菌的叶区。

用相应的溶剂处理叶子，收获叶子的接种区域，通常为 200 至 400 毫克鲜重，然后在液氮中将它们研磨成细粉。然后将研磨的组织放入 500 微升降解缓冲液中，制备总蛋白提取物。通过在 12， 000 倍重力下连续离心 5 分钟来澄清提取物，以进行蛋白质降解反应。

将等体积的提取物（通常为 20 μL）转移到微量离心管中，并在室温下孵育更长的时间。通常，使用采样时间 0 以及 5、10、15、20 和 30 分钟的时间点。通过煮沸 SDS 凝胶样品缓冲液终止反应，然后通过蛋白质印迹分析它们。

首先使用 Bradford 方法测定蛋白质浓度，并在每个泳道上样 50 至 80 μg 总蛋白质，通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品。确保所有样品均等加载以进行加载控件。比较普遍存在的蛋白质种类的强度，例如推定的 rubis 大链，它们作为主带迁移，相对电泳迁移率约为 50 道尔顿。

根据标准方案将分离的蛋白质电转印到硝酸纤维素膜上后，在室温下用 5% 脱脂牛奶的 TBST 溶液封闭膜 1 小时。接下来，在 TBST 中的 1% 脱脂牛奶中将一抗表位抗体稀释至制造商推荐的浓度。将抗体与封闭膜在室温下孵育 1 小时，或在 4 摄氏度下轻轻搅拌过夜。

然后在室温下用 20 毫升 TBST 冲洗膜 15 分钟，然后冲洗两次，每次 5 分钟，同时轻轻搅拌。接下来，按照制造商的建议，在 TBST 的 1% 脱脂牛奶中稀释与辣根过氧化物酶偶联的二抗。在 TBST 中再次冲洗后，在室温下将二抗与膜孵育 1 小时，轻轻搅拌，用辣根过氧化物酶代表性实验显示植物防御相关蛋白不稳定，观察感兴趣的蛋白质。

通过 SCF 途径的 VBFF 盒蛋白的 Veep one 在 N hamana 中得到证明。蛋白质血液分析表明，当与 VBF 共表达时，Veep one 的量显著降低，但在没有 VBF 共表达的情况下保持相对稳定。VBF 对 Veep one 不稳定的蛋白酶体降解机制是从蛋白酶体抑制剂 MG 1 32 的抑制中推断出来的。

这些结果的定量表明 VBF 几乎完全抑制了 V 1，而 V 1 实际上被 MG 1 32 阻断。在 MG 1 32 存在下 V 1 水平略高，很可能是由于抑制内源性 VBF 同源物活性。看完这个视频，你应该对如何通过起始蛋白酶体途径研究蛋白质降解有一个很好的了解。

相同的实验设计可用于任何其他生物体，并且可以执行以回答其他问题，例如调节蛋白质降解在不同细胞过程中的作用。