Name: 测定蛋白酶体降解的植物无细胞系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T17:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学习利用植物无细胞系统测定蛋白酶体降解的方法，通过农杆菌侵染本氏烟草叶片提取总蛋白，结合SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹技术分析蛋白质稳定性。该方法为研究泛素-蛋白酶体途径中的蛋白质调控机制提供了可靠的实验手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

此项工作获得玛丽·居里COFUND项目“U-Mobility”的资助，该项目由马拉加大学和欧盟共同资助th 第七框架计划（FP7/2007-2013）资助协议编号246550。本实验室的工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）、美国农业部/国家食品与农业研究所（USDA/NIFA）、美国国家科学基金会（NSF）、美以双边农业研究与发展基金（BARD）和美国-以色列双边科学基金会（BSF）向V.C.提供的资助。

1. 蛋白质表达
<ol>
	<li>表达系统的选择 
	选择最适合在特定模式生物/细胞中表达目标蛋白的系统，即载体及载体递送方法。请注意，本实验要求目标蛋白在细胞中表达至易于检测的水平，这通常通过大量细胞的瞬时转化来实现。例如在植物中，最佳方法是使用双元质粒作为表达载体，并以农杆菌作为递送系统。</li>
	<li>双元表达载体的构建 
	将目标蛋白的编码序列单独或以与表位标签融合的形式克隆至表达载体中。使用适用于所选表达系统的载体，并采用标准分子生物学方法进行基因克隆。对于农杆菌介导的基因递送，应使用双元载体，并通过标准实验流程将其导入农杆菌菌株（如EHA105），以便后续接种植物组织。</li>
	<li>植物物种的选择 
	选择用于表达目标蛋白的植物物种。需注意，尽管任何可被农杆菌介导遗传转化的植物物种均可使用，但我们首选的植物物种为Nicotiana benthamiana，该物种易于培养，对农杆菌高度敏感，且具有较大的叶片，便于接种操作。</li>
	<li>植物培养 
	将一株植物在环境可控的条件下（例如生长室中），使用Pro-Mix BX培养基质，种植于20 cm × 20 cm × 20 cm的花盆中，光照周期为长日照（即每日16小时、130–150 µE m⁻² s⁻¹光照、23°C，随后8小时黑暗、20°C），相对湿度保持在40–65%。 
	1.5.2 根据产品说明书，偶尔施用市售肥料。待植物生长后，选取叶片大小为50 mm × 70 mm或更大（长度测量不包括叶柄）的叶片用于农杆菌接种。</li>
	<li>农杆菌接种 
	将携带表达目标蛋白双元构建体的农杆菌菌株（见步骤1.3）在YEP培养基（1%蛋白胨、1%酵母提取物、0.5% NaCl）中，于28°C过夜培养，并添加适当的抗生素（例如，对于基于pPZP-RSC2的载体，添加100 mg/L链霉素和10 mg/L利福平）24-25。 
	1.6.2 离心收集菌体，重悬于侵染缓冲液 [10 mM MgCl2、10 mM Mes（pH 5.6）、100 µM乙酰丁香酮] 中，使OD600 = 0.5，室温孵育2小时。使用1 mL无针注射器将菌液注入叶片的远轴面；注意叶片接种时仍附着于植株上。 
	1.6.3 侵染后，将植株在16小时130–150 µE m⁻² s⁻¹光照、23°C / 8小时黑暗、20°C的光照条件下继续培养72小时，随后进行收获。</li>
	<li>蛋白酶体抑制剂的应用 
	为验证目标蛋白通过蛋白酶体途径降解，可使用特异性蛋白酶体抑制剂MG132和乳胞素28-29，以减少甚至阻断其降解。在收获前4小时（见步骤2.1），向已接种农杆菌的叶片区域分别注入10 μM MG132（EMD Millipore）或10 μM乳胞素（Sigma-Aldrich），或以相应溶剂作对照处理，即0.1% DMSO或蒸馏水。</li>
</ol>
2. 无细胞提取物的制备
<ol>
	<li>叶片采集 
采集叶片的接种区域，通常为约 200–400 mg 的鲜重，置于液氮中研磨成细粉。或者，可直接在降解缓冲液中使用珠磨法处理组织（例如，使用Biospec珠磨器或TPC Advanced Technologies牙科银汞合金振荡器）（见步骤2.2）。</li>
	<li>蛋白质提取 
将研磨后的组织加入500 μL降解缓冲液[50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、100 mM NaCl、10 mM MgCl2、5 mM DTT、5 mM 腺苷5′-三磷酸和1×蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich）]中，制备总蛋白提取物。需注意，蛋白酶抑制剂混合物主要作用于丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶，不会干扰26S蛋白酶体。通过两次连续离心（12,000 × g，每次5分钟）澄清提取物。</li>
	<li>蛋白质降解反应 
取等体积的提取物（通常为20 μL）转移至微量离心管中，在室温下孵育不同时间。通常取0分钟，以及5、10、15、20和30分钟的时间点。通过在SDS凝胶加样缓冲液中煮沸终止反应，并通过蛋白质印迹法进行分析。</li>
</ol>
3. 通过免疫印迹检测蛋白质降解
<ol>
	<li>凝胶电泳 
	3.1.1 按照标准方案30，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品，并将分离后的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上。 
	3.1.2 使用Bradford法（Bio-Rad）测定蛋白质浓度，每道上样50–80 µg总蛋白。确保所有样品上样量相等。对于上样对照，可通过检测一种普遍存在的蛋白质（如迁移位置约为50 kDa的RuBisCo大亚基）的信号强度进行比较；该蛋白可在考马斯亮蓝染色的凝胶或经Ponceau S或荧光染料SYPRO Ruby染色的硝酸纤维素膜上观察到。</li>
	<li>封闭 
	用含5%脱脂奶粉的TBST（10 mM Tris-HCl，140 mM NaCl，0.05% Tween 20，pH 7.4）在室温下封闭膜1小时。</li>
	<li>一抗孵育 
	将针对表位的一抗用含1%脱脂奶粉的TBST按制造商推荐浓度稀释，在室温下与封闭后的膜孵育1小时，或在4ºC轻柔振荡孵育过夜。</li>
	<li>洗涤 
	用20 ml TBST在室温下轻轻振荡洗涤膜一次15分钟，再洗涤两次，每次5分钟。</li>
	<li>二抗孵育 
	按制造商推荐方法，将辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（例如抗兔IgG）用含1%脱脂奶粉的TBST稀释，在室温下与膜轻柔振荡孵育1小时。</li>
	<li>检测 
	再次按照步骤3.4所述方法洗涤膜。最后一次TBST洗涤后，使用HRP化学发光底物显色，最常用的是ECL试剂盒进行目标蛋白的检测。&#160;</li>
</ol>

<ol><li>Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+control+in+ubiquitin-dependent+proteolysis%3A+don%E2%80%99t+Skp+the+F-box+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis.</a> Trends Genet. 14, 236-243 (1998).</li>
<li>Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+and+cullin%2Fring+H2-based+ubiquitin+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases.</a> Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).</li>
<li>Callis, J., Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+in+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein degradation in signaling.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).</li>
<li>Hellmann, H., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+development%3A+regulation+by+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant development: regulation by protein degradation.</a> Science. 297, 793-797 (2002).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Dharmasiri, S., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+regulated+protein+degradation+in+auxin+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of regulated protein degradation in auxin response.</a> Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).</li>
<li>Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ubiquitination+in+the+regulation+of+plant+defence+against+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).</li>
<li>Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+ubiquitin-26S-proteasome+pathway+in+gibberellin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling.</a> Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).</li>
<li>Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+26S+proteasome+system+in+the+signaling+pathways+of+TGF-beta+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily.</a> Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).</li>
<li>Pagano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+DNA+synthesis+and+mitosis+by+the+Skp2-+p27-Cdk1%2F2+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis.</a> Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).</li>
<li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+of+the+host+SCF+ubiquitin+ligase+machinery+by+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens.</a> Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+plant+transformation%3A+the+biology+behind+the+%26%2334%3Bgene-jockeying%26%2334%3B+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &#34;gene-jockeying&#34; tool.</a> Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li>
<li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).</li>
<li>Schrammeijer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+virulence+protein+VirF+of+Agrobacterium+tumefaciens+with+plant+homologs+of+the+yeast+Skp1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein.</a> Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).</li>
<li>Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+induces+expression+of+a+plant+host+F-box+protein+required+for+tumorigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity.</a> Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).</li>
<li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+targeted+proteolysis+in+plant+genetic+transformation+by+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium.</a> Nature. 431, 87-92 (2004).</li>
<li>Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+synthetic+Agrobacterium+T-DNA-protein+complexes+via+the+host+SCFVBF+ubiquitin-ligase+complex+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).</li>
<li>Zhou, P., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+and+degradation+of+the+substrate+recognition+subunits+of+SCF+ubiquitin-protein+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases.</a> Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).</li>
<li>Galan, J. M., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+degradation+of+multiple+F-box+proteins+by+an+autocatalytic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).</li>
<li>Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tome-1%2C+a+trigger+of+mitotic+entry%2C+is+degraded+during+G1+via+the+APC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC.</a> Cell. 113, 101-113 (2003).</li>
<li>Guardavaccaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+meiotic+and+mitotic+progression+by+the+F+box+protein+b-Trcp1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo.</a> Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).</li>
<li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+counteracts+host-induced+degradation+of+its+F-box+protein+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector.</a> Sci. Signal. 4, (2011).</li>
<li>Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophase+destruction+of+Emi1+by+the+SCFbTrCP%2FSlimb+ubiquitin+ligase+activates+the+anaphase+promoting+complex+to+allow+progression+beyond+prometaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase.</a> Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).</li>
<li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pSAT+vectors%3A+a+modular+series+of+plasmids+for+fluorescent+protein+tagging+and+expression+of+multiple+genes+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.</a> Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).</li>
<li>Goderis, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+modular+plant+transformation+vectors+allowing+flexible+insertion+of+up+to+six+expression+units%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units.</a> Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).</li>
<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-DNA+binary+vectors+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).</li>
<li>Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Delivery of multiple transgenes to plant cells.</a> Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).</li>
<li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+Arabidopsis+26+S+proteasome%3A+biochemical+and+molecular+analyses+revealed+the+presence+of+multiple+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms.</a> J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).</li>
<li>Fenteany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+proteasome+activities+and+subunit-specific+amino-terminal+threonine+modification+by+lactacystin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin.</a> Science. 268, 726-731 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="imagej.nih.gov/ij">imagej.nih.gov/ij</a> (1997).</li>
<li>Kim, J. H., Kim, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+RING+E3+ubiquitin+ligase+AtAIRP3%2FLOG2+participates+in+positive+regulation+of+high+salt+and+drought+stress+responses%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses).</a> Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

该实验依赖于受试蛋白质在植物组织中的表达；因此，潜在的蛋白酶体降解过程显然已在活体组织内发生。然而，我们仅在提取物中检测蛋白质的稳定性变化，并以时间零点的样品作为初始参照点。因此，我们将该方法定义为无细胞实验体系。
成功实施本实验的一个重要方面是正确选择用于表达待测蛋白的表达载体。除非有针对待测蛋白的特异性抗体可用，否则应为该蛋白添加表位标签，以便通过蛋白质印迹法进行检测。标签蛋白应由一个 农杆菌 双元载体。尽管已有多种此类载体可供使用26我们建议使用源自模块化 pSAT 质粒系统的载体24，可实现将表达盒一步插入pPZP-RCS2双元质粒中24-25pSAT系统的另一个优势在于其能够从同一载体上表达多个基因25，这对于检测多种蛋白酶体底物或研究被测底物相互作用分子的影响特别有用；例如共表达被测底物与 农杆菌 VirD5蛋白与蛋白酶体底物VirF相互作用，从而保护VirF免受蛋白酶体降解22重要的是，不断扩展的pSAT系列载体中已经包含了...

泛素/26S蛋白酶体通路正逐渐被认识到是一种广泛存在的调控多种生物反应的机制，包括转录调控、细胞周期进程、信号转导、受体下调或内吞等其他过程1-4在此通路中，靶蛋白被泛素分子标记，泛素首先被连接到靶蛋白上 通过 硫酯键与泛素激活酶E1结合，随后转移至泛素结合酶E2的半胱氨酸氨基酸残基上；最终，E2与泛素连接酶E3相互作用，导致底物蛋白的多聚泛素化。多聚泛素化的蛋白最终被26S蛋白酶体识别并降解。在此机制中，E3酶负责识别底物，并作为泛素/26S蛋白酶体系统（UPS）的关键调控组分。E3连接酶可独立发挥作用，如RING结构域连接酶，或作为多亚基SCF（Skp1/Cullin/F-box蛋白）复合物的一部分发挥作用，如F-box结构域连接酶。由SCF介导的蛋白酶体降解通路参与转录调控、细胞周期及信号转导的调节。5-10 以及其他许多重要的细胞功能。
除了在调控细胞过程中的关键作用外，泛素-蛋白酶体系统（UPS）还在多种植物-病原体互作中占据核心地位。例如，越来越多的证据表明，包括 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）， 依赖宿主泛素-蛋白酶体系统（UPS）以促进感染过程11农杆菌会在其天然宿主植物上引发肿瘤性生长，并且还能够转化多种其他真核生物，从真菌开始1,2 对人类细胞12,13在感染过程中，农杆菌会将一段DNA（T-DNA）以及多种毒力（Vir）蛋白导入宿主细胞内12-13其中一个蛋白是VirF，这是首个被发现由原核生物基因组编码的F-box蛋白。14作为SCF泛素连接酶复合物的一部分，VirF及其功能上的人类宿主同源蛋白VBF15，促进农杆菌感染 通过 由UPS介导的蛋白质降解，该过程可能有助于将入侵细菌的T-DNA从其伴随的细菌蛋白VirE2和宿主蛋白VIP1中解离16,17有趣的是，许多F-box蛋白（包括VirF）由于自身的蛋白水解作用而本质上不稳定，这种蛋白水解由自泛素化活性介导。18,19 或其他可能以F-box蛋白为底物的E3连接酶20-23.

在研究F-box蛋白、其他泛素连接酶和/或其底物的生化活性时，采用一种简单且可靠的蛋白酶体降解检测方法将非常有用。本文描述了一种在无细胞体系中分析蛋白质稳定性的实验方案。该方法通过在无细胞系统中，检测泛素-蛋白酶体系统（UPS）底物在关键组分（如F-box蛋白）存在或缺失条件下的稳定性，来评估其降解情况。通常，我们在植物组织中表达待测蛋白，制备这些组织的无细胞提取物，并通过蛋白质印迹法（western blotting）监测目标蛋白的含量变化。通过添加特异性蛋白酶体抑制剂和/或共表达SCF复合物组分Cullin的显性负性突变体，可验证蛋白降解过程对UPS的依赖性。尽管本实验以拟南芥VIP117蛋白被F-box蛋白VBF15介导的蛋白酶体降解为例进行说明，但该方法同样适用于研究其他任何蛋白酶体底物的稳定性。

<table><tbody><tr><td>蛋白质检测试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean 电泳系统</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>半干式转膜仪（Semi-dry western blotting SD 电转移系统）</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>亲和纯化兔抗Ha抗体</td><td>ICL Lab</td><td>RHGT-45A-Z</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace NT 硝酸纤维素转印膜</td><td>Pall Corporation</td><td>27377-000</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western 化学发光HRP底物</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>EMD Millipore</td><td>474790-1MG</td><td></td></tr><tr><td>乳胞素（Lactacystin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce 快速Western Blot试剂盒，ECL底物</td><td>Pierce</td><td>35055</td><td></td></tr></tbody></table>

在植物无细胞系统中检测蛋白酶体降解

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

泛素-蛋白酶体途径作为蛋白质降解机制，已成为几乎所有真核生物中调控细胞多种功能的最重要机制之一。特别是在植物中，泛素/26S蛋白酶体系统（UPS）调控蛋白质降解，显著参与免疫反应、发育过程以及程序性细胞死亡等多种生物学过程的调控。此外，越来越多的证据表明，许多植物病原体（如农杆菌 Agrobacterium）会利用宿主的UPS实现高效侵染，凸显了UPS在植物-病原体相互作用中的重要性。
泛素-蛋白酶体系统（UPS）的底物特异性由E3泛素连接酶实现，该酶与E1和E2连接酶协同作用，识别特定的靶蛋白分子，并通过在其上连接泛素分子链来标记这些蛋白，使其被降解。E3连接酶中的一类是SCF（Skp1/Cullin/F-box蛋白）复合物，它通过其F-box蛋白组分特异性识别UPS底物，并将其靶向进行泛素化via。为了研究UPS在特定生物学过程中的潜在作用，设计一种简单且可靠的检测UPS介导蛋白降解的方法至关重要。本文描述了一种利用植物无细胞体系的此类检测方法。该方法可适用于研究调控性蛋白降解在多种细胞过程中的作用，尤其聚焦于F-box蛋白与底物之间的相互作用。

图1，改编自 Zaltsman 等17，展示了在无细胞系统中检测蛋白酶体降解的代表性实验。具体而言，我们演示了VBF F-box蛋白介导的植物防御相关蛋白VIP1的不稳定化 通过 SCFVBF 通路在 N. benthamiana. 在本实验中，瞬时共表达拟南芥VBF和HA标签VIP1（HA-VIP1）蛋白，并通过蛋白质印迹法分析表达叶片提取物中HA-VIP1的蛋白含量。结果表明，当HA-VIP1与VBF共表达时，VIP1蛋白量显著降低；而在无VBF共表达的情况下，VIP1蛋白量则相对稳定图1A）。需要注意的是，在没有VBF的情况下VIP1含量的轻微减少可能是由于内源性烟草VBF活性较低所致。VBF介导VIP1不稳定性的蛋白酶体降解机制是通过MG132抑制该过程而推断得出的图1A). 结果的定量分析 图1A 通过VBF检测显示VIP1几乎完全（≥90±5%）被降解，该过程可被MG132阻断图...

靶向蛋白质降解是细胞功能调控的重要机制。它发生于 通过 一个保守的泛素-蛋白酶体通路，该通路将多聚泛素链连接至靶蛋白，从而为26S蛋白酶体提供分子“标签”。本文中，我们描述了一种简单且可靠的无细胞体系，用于检测蛋白质的蛋白酶体降解。

蛋白质降解的泛素-蛋白酶体途径已成为调控细胞内广泛生物学过程的最重要机制之一。

以下实验的总体目标是在无细胞系统中分析蛋白质的稳定性。通过用不同的农杆菌菌株接种 Oceana Biana 来实现这一目标，这些菌株含有目标蛋白并携带双元载体。随后从植物叶片中提取总蛋白。将叶片转移至微量离心管中，并在室温下孵育逐渐延长的时间。接着通过SDS丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品，并将蛋白电转印至硝酸纤维素膜上。为了利用特异性抗体检测目标蛋白，可通过蛋白质印迹分析获得结果，以显示在存在或不存在特定蛋白酶体抑制剂的情况下目标蛋白的稳定性。本文描述了一种简单的方法，用于在无细胞体系中研究 INE 蛋白酶体半胱氨酸底物在蛋白酶体降解途径某一关键组分存在或缺失条件下的稳定性。因此，这些方法可为更安全的蛋白酶体降解机制提供深入见解。它还可应用于其他系统，例如研究调控性蛋白质降解在多种细胞过程中的作用。在本示例中，使用了NCOA hamana。该植物易于培养，对农杆菌高度敏感，且具有较大的叶片，易于接种。在环境可控的长日照和40%至65%相对湿度条件下，使用Promix B培养基在花盆中种植一株植物，培养时间为4至6周。根据生产商说明，定期使用市售肥料对植物进行施肥。待植物生长完成后，选取尺寸不小于50毫米×70毫米的叶片。用于农杆菌接种时，将含有表达待测蛋白的双元载体的农杆菌菌株在添加适当抗生素的YEP培养基中于28摄氏度过夜培养。离心收集菌体后，用浸润缓冲液重悬至600纳米处光密度为0.5，并在室温下孵育两小时。使用1毫升无针注射器将菌液浸润至叶片的AAL侧。浸润后，将植物在相同光照条件下继续培养72小时。在收获前4小时，向农杆菌接种的叶片区域浸润10微摩尔的抑制剂或对照溶液。用相应的溶剂处理叶片，收获接种区域的叶片组织，通常取200至400毫克鲜重，于液氮中研磨成细粉。然后将研磨后的组织加入500 µL降解缓冲液中，制备总蛋白提取物。通过在12,000 ×g条件下连续两次离心5分钟，澄清提取物，以进行蛋白降解反应。取等体积的提取物（通常为20微升）加入微量离心管中，并在室温下孵育不同时间。通常设置的时间点包括0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟和30分钟。在进行Western印迹分析前，通过煮沸加入SDS凝胶上样缓冲液来终止反应。使用Bradford法测定蛋白浓度后，将每泳道上样50至80微克总蛋白，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品。确保所有样品上样量相等，以便进行上样对照。通过比较泛在性蛋白条带（如迁移速率约为50千道尔顿的推测Rubis大亚基）的条带强度进行分析。根据标准方案将分离的蛋白质电转至硝酸纤维素膜后，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭膜1小时。接着，将一抗抗体用含1%脱脂奶粉的TBST按制造商推荐浓度稀释，并与封闭后的膜在室温孵育1小时，或在4°C轻柔振荡过夜。然后在室温下用20毫升TBST轻轻振荡洗涤膜一次15分钟，再重复洗

assaying-proteasomal-degradation-in-a-cell-free-system-in-plants

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

测定蛋白酶体降解的植物无细胞系统

本文介绍了一种在活细胞中监测泛素-蛋白酶体活性的方法。通过慢病毒表达载体，将一个含有降解决定子的不稳定型绿色荧光蛋白融合蛋白（GFP-dgn）和一种稳定的GFP-dgnFS融合蛋白导入细胞。该技术可用于建立稳定表达GFP-dgn/GFP-dgnFS的细胞系，在该细胞系中，可通过落射荧光显微镜或流式细胞术方便地评估泛素-蛋白酶体系统的活性。...

利用基于降解决定子（dgn）不稳定的绿色荧光蛋白（GFP）报告蛋白在活细胞中监测泛素-蛋白酶体活性

在本视频中，我们展示了一种基于细胞的蛋白质聚集检测方法，该方法使用蛋白酶体抑制剂来阻断蛋白酶体活性，从而阻止与荧光标签融合的错误折叠突变蛋白发生泛素依赖性的蛋白酶体降解，导致这些蛋白在细胞质中积累。随后通过荧光显微镜对蛋白质聚集体进行可视化和定量分析。...

蛋白质聚集体形成检测：一种在蛋白酶体抑制剂诱导下检测和定量培养细胞中蛋白质聚集的方法

本视频介绍了一种利用环己酰亚胺处理结合去垢剂分级分离技术来检测错误折叠蛋白质降解的方法。该方法有助于研究错误折叠蛋白质的动态变化，并深入揭示蛋白质周转的分子机制。...

易错折叠蛋白降解检测：一种利用环己酰亚胺处理与去垢剂分馏监测错误折叠蛋白降解的技术

本文介绍了一种植物蛋白质复合物的纯化与表征实验方案。我们通过免疫沉淀复合物中的单一蛋白质，从而鉴定其翻译后修饰及其相互作用蛋白伙伴。...

植物蛋白质复合物翻译后修饰的鉴定

本文介绍了一种用于定量泛素-蛋白酶体系统中蛋白水解相对速率的可靠生物学检测方法。该检测的读出指标为酵母在液体培养中的生长速率，其依赖于报告蛋白的细胞内水平，该报告蛋白由一个降解信号与必需的代谢标记物融合而成。...

基于报告基因的生长分析法用于系统性研究蛋白质降解

本文介绍了一种基于酵母生长的检测方法，用于确定蛋白质降解所需的遗传条件。同时展示了一种快速提取酵母蛋白质的方法，适用于蛋白质印迹（western...

基于生长的蛋白质降解遗传需求的测定及生化验证方法在Saccharomyces cerevisiae中的应用

本报告介绍了通过蛋白质印迹法或基于荧光的检测方法来测定错误折叠蛋白质降解速率的实验方案。这些方法可应用于其他错误折叠蛋白质的分析，以及高通量筛选。...

细胞中错误折叠蛋白质降解的检测方法

本文介绍了一种应用于Arabidopsis...

植物原生质体mRNA相互作用组捕获

本方案描述了一种利用脉冲标记和SNAP-标签融合蛋白的荧光延时成像，在单个活体贴壁细胞中测定蛋白质半衰期的方法。...

通过延时荧光显微镜在贴壁细胞培养中对蛋白质降解速率进行单细胞定量分析

蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-代谢物相互作用对所有细胞功能至关重要。本文介绍了一种可对目标蛋白质的这些相互作用进行并行分析的实验方案。该方案针对植物细胞培养体系进行了优化，结合了亲和纯化与基于质谱的蛋白质及代谢物检测技术。...

一步亲和纯化并行分析蛋白质-蛋白质与蛋白质-代谢物复合物的2合1方法

本文介绍了一种磷酸化蛋白质组学方法，即基于停止-洗脱提取尖端的磷酸化蛋白质组学技术，可实现高通量且深度覆盖的 拟南芥 磷酸化蛋白质组。该方法阐明了渗透胁迫信号传导的总体概况...

磷酸化蛋白质组学策略用于分析渗透压应激信号通路 拟南芥

学习利用植物无细胞系统测定蛋白酶体降解的方法，通过农杆菌侵染本氏烟草叶片提取总蛋白，结合SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹技术分析蛋白质稳定性。该方法为研究泛素-蛋白酶体途径中的蛋白质调控机制提供了可靠的实验手段。

在植物无细胞系统中检测蛋白酶体降解

探索更多视频