Name: 表达，分离，纯化可溶性和不溶性蛋白质生物素对神经组织再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学习利用细菌表达系统设计和纯化重组生物素化蛋白质的方法。本技术通过质粒转化、诱导表达和亲和层析，成功分离可溶性与不溶性蛋白，适用于神经组织再生等生物医学研究。

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作者感谢阿克伦大学为本研究提供的资助。

1. 目标蛋白的设计
<ol>
	<li>利用美国国家生物技术信息中心网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获取目标蛋白的氨基酸序列，需考虑目标物种及任何剪接变体。选择对应于该蛋白活性区域的氨基酸序列。 
	注意：对于 Sema3A，选择了氨基酸 21-747。设计了一个与 NGF 的融合蛋白，其中将 barstar 的氨基酸 1-90 序列添加至 NGF 的氨基酸 122-241 位。</li>
	<li>在N端添加以下序列：用于纯化的6×His标签（HHHHHH）、用于切除His标签的烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点（ENLYFQG）、用于在赖氨酸（K）位点进行蛋白生物素标记的生物素化序列（GLNDIFEAQKIEWHE），以及含有间隙的柔性铰链序列，以提供足够的空间促进蛋白正确重折叠（EFPKPSTPPGSSGGAP）。 
	注意：这些序列可根据所需的融合蛋白进行调整。</li>
	<li>将完整的氨基酸序列送至公司，针对目标宿主物种进行基因设计/优化并合成。使用试剂盒或商业服务，通过BamHI-NotI位点将基因亚克隆至选定的载体中。</li>
</ol>
2. 制备琼脂平板
注意：所有抗生素、培养皿、缓冲液的储备液必须严格保存 等等。 妥善保存（温度和时间），并保持无蛋白酶污染（已灭菌）。
<ol>
	<li>称取1.5 wt%的琼脂和20 g/L的溶菌肉汤（LB），放入玻璃培养基瓶中。500 ml的瓶子大约可制备15块平板。</li>
	<li>定量加入超纯水，充分混匀，然后高压灭菌。</li>
	<li>待瓶子冷却至可触碰后，加入相应的抗生素。避免琼脂过早凝固；但如果瓶子冷却过度导致溶液开始凝结，可在微波炉中重新加热。 
	注意：我们的质粒含有氨苄青霉素抗性基因。因此，所有步骤中必须添加浓度为100 µg/ml的氨苄青霉素。 E. coli 克隆K12菌株需要添加四环素（12.5 µg/ml）抗生素。BL21菌株无需额外添加抗生素。</li>
	<li>将25–30 ml溶液倒入90 mm培养皿中，静置晾干。</li>
	<li>用适当的抗生素标记培养皿，并用封口膜或自封袋密封后倒置存放于 4 °C。 
	注意：培养皿大约可使用一个月。</li>
</ol>
3. 生物素标记质粒的克隆
注意：所有操作均需在无菌条件下进行。
<ol>
	<li>将质粒载体在 6,000 x g 离心 3 分钟以沉淀，加入 10 μl 无菌超纯水。</li>
	<li>从 -80 °C 取出 50 μl 化学感受态的大肠杆菌（E. coli）高效转化细胞，并立即置于冰上 5–10 分钟。</li>
	<li>向 50 μl E. coli 细胞中加入 1 μl 浓度为 0.5–1 ng/50 μl 细胞的载体溶液，并将剩余质粒保存于 -80 °C。</li>
	<li>将含有载体的细菌细胞置于冰上 5 分钟。</li>
	<li>将细胞与载体混合物在 42 °C 水浴中热激 30–45 秒，然后立即放回冰上 2 分钟。</li>
	<li>加入 250 μl 含葡萄糖分解产物抑制的超级优化肉汤（SOC 培养基）（2% w/v 细菌胰蛋白胨，0.5% w/v 细菌酵母提取物，8.56 mM NaCl，2.5 mM KCl，20 mM MgSO4，20 mM 葡萄糖，超纯水；pH = 7.0），并在 37 °C 以 250 rpm 振荡培养 30 分钟。 
	注意：SOC 培养基不应高压灭菌，而应通过 0.22 µm 滤膜过滤除菌。</li>
	<li>在涂布细胞前将平板干燥 10–15 分钟。</li>
	<li>分别取 25、50 和 100 μl 细胞溶液滴加至含有氨苄青霉素（100 µg/ml）和四环素（12.5 µg/ml）的琼脂平板上，使用玻璃珠将溶液均匀涂布于平板表面。</li>
	<li>将平板倒置，在 37 °C 培养 15–18 小时。</li>
	<li>检查平板上是否出现单个细小的细菌菌落，并将平板倒置保存于 4 °C，以备后续使用（图 2A）。
	<ol>
		<li>若无菌落生长：
		<ol>
			<li>检查缓冲液和耗材的新鲜程度及无菌状况。</li>
			<li>增加加入 E. coli K12 菌株的质粒用量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>若出现较大菌落或菌落过度生长（图 2B 和 图 2C），应使用无菌接种环重新划线接种新琼脂平板，或减少涂布体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>挑取一个转化后的 E. coli 单菌落，接种于 5 ml 含氨苄青霉素（100 µg/ml）和四环素（12.5 µg/ml）的 LB 培养基中，在 37 °C 以 250–300 rpm 过夜培养。</li>
	<li>次日，使用质粒提取试剂盒从过夜培养物中分离目标载体，并将纯化的质粒保存于 -80 °C 以备后续使用。
	<ol>
		<li>可选步骤：通过测定 260 nm 和 280 nm 处的吸光度值检测质粒的纯度和浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 将质粒转化至表达宿主
注意：所有操作均需在无菌条件下进行。
<ol>
	<li>对 E. coli BL21 细胞重复步骤 3.2–3.10，但进行以下更改： 
	注意：BL21 细胞不需要额外的抗生素，因此仅在转化用的琼脂平板中添加氨苄青霉素。
	<ol>
		<li>将步骤 3.12 中分离得到的质粒 2–5 μl（浓度为 0.5–2 ng/50 μl 细胞）加入 50 μl E. coli 表达宿主细胞中。</li>
		<li>将细胞进行热激处理 60–90 秒。</li>
		<li>在 SOC 培养基中以 250 rpm 振荡培养 60 分钟，而非 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用无菌涂布棒从培养皿中挑取一个单菌落，接种至含有 5 ml LB 液体培养基（含适当浓度氨苄青霉素，100 µg/ml）的试管中。</li>
	<li>将试管置于摇床中，在 37 °C、250 rpm 条件下过夜培养。</li>
	<li>次日早晨，取 200 μl 过夜培养物，加入含 100 µg/ml 氨苄青霉素的 5 ml LB 培养基中。</li>
	<li>将剩余菌液与 250 μl 50% 甘油（无菌）混合，总体积为 750 μl，保存于 -80 °C。 
	注意：可通过使用无菌涂布棒刮取冻存细胞，并接种至含适当抗生素的 LB 培养基中，进行新的小规模表达和放大培养实验。</li>
	<li>将试管置于摇床中，在 37 °C、250–300 rpm 条件下振荡培养，直至在 600 nm 吸光度下测得光密度（OD）值介于 0.7–0.8 之间。</li>
	<li>加入 IPTG 至终浓度为 1 mM，诱导细胞表达。</li>
	<li>继续在 37 °C、300 rpm 条件下振荡培养 4 小时。或者也可在 18 °C、250–300 rpm 条件下过夜培养。根据目标蛋白的不同，后者可能获得更高的质粒表达量。</li>
	<li>小规模表达的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
	<ol>
		<li>取 500 μl 培养物，转移至 1.5 ml 离心管中，在 13–15 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，并标记为“可溶性”。用涡旋振荡法将沉淀重悬于 200 μl 上样缓冲液中（含 50 μl 2-巯基乙醇和 950 μl Laemmli 样品缓冲液）。 
		注意：可溶性细菌沉淀用于判断重组蛋白是否位于细菌细胞的胞质区域。沉淀可在未加缓冲液的情况下保存于 -80 °C，待需要时再使用。未转化或未诱导的对照细菌培养物也可按“可溶性”处理，用于比较。</li>
		<li>取 1,000 μl 培养物，转移至 1.5 ml 离心管中，在 13–15 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，并标记为“不溶性”。 
		注意：不溶性沉淀将进行后续变性处理，以释放细菌细胞包涵体中的蛋白。沉淀可保存于 -80 °C，待需要时再使用。未转化或未诱导的对照细菌培养物也可按“不溶性”处理，用于比较。
		<ol>
			<li>将不溶性沉淀重悬于 200 μl Bugbuster 溶液中，室温孵育 30 分钟。</li>
			<li>再次在 13–15 × g 条件下离心 5 分钟，取 50 μl 上清液转移至新的标记为“不溶性”的 1.5 ml 离心管中。</li>
			<li>向该新样品中加入 50 μl 上样缓冲液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将可溶性和不溶性样品均在沸水中加热 5 分钟，使蛋白变性，用于 SDS-PAGE 分析。</li>
		<li>将各样品连同样品标准蛋白分子量标记物一起上样至电泳凝胶中。</li>
		<li>使用染色试剂对蛋白样品进行染色，并按照试剂公司提供的操作说明进行操作。</li>
		<li>通过比较可溶性和不溶性样品条带，以及与可溶性和不溶性对照条带（见注释 4.9.1 和 4.9.2）的比较，判断蛋白是否在可溶性或不溶性组分中表达（图 2）。在 SDS-PAGE 凝胶的可溶性或不溶性泳道中，应在目标蛋白分子量附近出现一条深色条带。该结果将决定在方案 6 中采用哪种纯化方法。 
		注意：若在两个组分中均出现条带，则可任选方案 6 中的任一纯化方法，或同时采用两种方法纯化，以确定哪种方法能获得更高产量的重组蛋白（图 3）。</li>
		<li>若同时进行了 4 小时和过夜诱导实验，应通过比较确定哪种诱导方式在放大培养过程中蛋白产量更高（图 2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 放大培养步骤与主培养
<ol>
	<li>在1.8 L超纯水中加入85.7 g Terrific Broth和28.8 ml 50%甘油，配制培养基，并在液体循环条件下高压灭菌1小时。</li>
	<li>从步骤4.5中制备的冻存细胞种子开始过夜培养。 
	注意：所有操作均需无菌进行。
	<ol>
		<li>在无菌的125 ml锥形瓶中加入20 ml LB培养基，并加入氨苄青霉素至终浓度为100 µg/ml。</li>
		<li>使用无菌涂布棒刮取转化后的E. coli细胞，将涂布棒投入锥形瓶中，取出涂布棒后用泡沫塞或棉塞封口，并用铝箔包裹以维持无菌状态。</li>
		<li>在37 °C、250 rpm条件下振荡培养过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>主培养 
	注意：所有操作均需无菌进行。
	<ol>
		<li>将过夜培养物倒入1.8 L无菌生长培养基中，加入氨苄青霉素至终浓度为100 µg/ml，并用巴斯德移液管加入6至8滴无菌消泡剂204（antifoam 204）。</li>
		<li>将培养物置于37 °C水浴中，通过通气石向培养物中通入经0.2 mm滤膜过滤的压缩空气。</li>
		<li>当OD600nm达到0.7–0.8时，加入IPTG（终浓度1 mM）诱导表达，根据步骤4.9中SDS-PAGE的可溶性/不溶性结果，选择在37 °C诱导4小时或在18 °C过夜诱导。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集E. coli细胞
	<ol>
		<li>将菌液在1 L离心瓶中（每份培养物使用两个离心瓶）于4 °C、14,000 × g条件下离心15分钟，沉淀细胞。</li>
		<li>倒去上清液，用薄刮刀将菌体沉淀刮下，分装至两个50 ml离心管中。可再次短暂离心以进一步收集菌体沉淀。 
		注意：每1.8 L培养物将获得两个细菌沉淀，分别置于两个50 ml离心管中。</li>
		<li>将菌体沉淀储存于-80 °C，直至进行蛋白纯化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 重组蛋白的分离与纯化
注意：如果根据步骤4.9的SDS-PAGE分析结果，蛋白位于可溶性区域，则采用“天然状态分离”方法；而对于不溶性蛋白，则执行“非天然状态分离”步骤。
<ol>
	<li>细胞裂解
	<ol>
		<li>非天然状态
		<ol>
			<li>从 -80 °C 冰箱中取出转化后的 E. coli 菌体沉淀，向每根离心管中加入 20 ml 裂解/洗涤缓冲液（表 1）。</li>
			<li>涡旋并振荡冷冻的菌体沉淀，直至其完全融化并在缓冲液中溶解，无明显大块残留。在摇床中于室温孵育过夜。次日早晨，由于缓冲液使蛋白变性，菌体沉淀应变为黏稠的悬浊液。</li>
			<li>将悬浊液在室温下以 20,500 × g 离心 30 分钟。将上清液转移至新离心管中用于后续纯化，弃去沉淀。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>天然状态
		<ol>
			<li>从 -80 °C 冰箱中取出转化后的 E. coli 菌体沉淀。</li>
			<li>向离心管中加入裂解缓冲液（表 1），使最终体积达到 30 ml，通过剧烈涡旋和振荡使冻结的菌体沉淀分散。将样品置于冰上。</li>
			<li>使用 70% 乙醇以 100% 振幅清洗超声探头 1–2 分钟，随后用超纯水重复清洗一次。</li>
			<li>在冰上对菌体沉淀进行超声处理，总时长为 5 分钟（累计耗时 10 分钟）。
			<ol>
				<li>将超声仪设置为 30% 振幅，脉冲模式为开启 30 秒、关闭 30 秒。</li>
				<li>在超声过程中上下移动离心管，以彻底打散菌体沉淀。超声结束后应无可见菌体沉淀，形成丝状、黏稠的悬浊液。</li>
				<li>在不同蛋白纯化之间以及储存前，均需使用 70% 乙醇和超纯水按照步骤 6.1.2.3 所述方法清洗超声探头。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>将悬浊液在 4 °C 下以 20,500 × g 离心 30 分钟。将上清液转移至新离心管中用于后续纯化，弃去沉淀。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ni-NTA 亲和层析
	<ol>
		<li>非天然状态
		<ol>
			<li>向每根离心管中加入 1 ml Ni2+-NTA 树脂溶液（1.8 L 培养液共需 2 ml 树脂），在摇床上室温孵育至少 1 小时。</li>
			<li>将悬浊液倒入亲和层析柱中，打开活塞阀，使液体完全流入废液杯中。</li>
			<li>每次用 10 ml 裂解/洗涤缓冲液进行洗涤，共洗涤 10 次。
			<ol>
				<li>前两次洗涤时，先将 10 ml 缓冲液加入离心管以回收残留树脂，再倒入层析柱中；后续洗涤可直接将缓冲液加入层析柱。</li>
				<li>每次洗涤后，用玻璃搅拌棒轻轻搅动树脂。待液体完全滴入废液杯后，再加入下一份 10 ml 缓冲液。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>最后一次洗涤液完全流尽后，关闭活塞阀，移去废液杯，更换为 50 ml 离心管用于收集蛋白。</li>
			<li>加入 15 ml 洗脱缓冲液（表 1），搅动树脂，静置 5 分钟。打开活塞阀收集洗脱液。重复此步骤一次，再加入 15 ml 洗脱缓冲液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>天然状态
		<ol>
			<li>参照上述非天然状态亲和层析步骤（6.2.1.1–6.2.1.4），但调整以下参数：
			<ol>
				<li>将 Ni2+-NTA 树脂溶液在 4 °C 下于摇床上孵育至少 1 小时。</li>
				<li>使用相应的洗涤缓冲液（表 1）。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>加入 5 ml 洗脱缓冲液（表 1），与树脂孵育 5 分钟。
			<ol>
				<li>打开活塞阀，收集洗脱液，直至大部分液体滴出。</li>
				<li>向透明的 96 孔板中每孔加入 90 μl Bradford 试剂。每次收集洗脱液时，让 10 μl 溶液从层析柱滴入含 90 μl Bradford 试剂的孔中。</li>
				<li>每次加入 5 ml 洗脱缓冲液，持续进行，直至 Bradford 法检测不到蛋白（颜色由深蓝变为浅蓝再变为无色）。通常需要 4–5 次洗脱体积。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透析/复性
	<ol>
		<li>配制非天然状态（复性）和天然状态的透析缓冲液（表 1），并储存于 4 °C。
		 
		注意：透析缓冲液的 pH 值应根据目标蛋白的等电点（pI）确定。一般原则是缓冲液 pH 应至少比蛋白 pI 高或低一个单位。</li>
		<li>将天然和非天然状态的洗脱液分别装入适当截留分子量的透析袋中（NGF 使用 25,000 MWCO，Sema3A 使用 50,000 MWCO）。将每份蛋白样品在 4 °C 下于对应的透析缓冲液 1 中透析 4 小时，随后更换为对应的缓冲液 2，继续在 4 °C 下透析过夜。
		 
		注意：为确保蛋白正确折叠和缓冲液充分交换，每种缓冲液中透析时间应不少于 4 小时。</li>
		<li>使用离心浓缩管将透析后的蛋白洗脱液浓缩至 5 ml 以下。
		 
		注意：蛋白可进一步通过快速蛋白液相色谱（FPLC）进行纯化，并再次浓缩。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将 10–50 ml 样品在已称重的微量离心管中冷冻干燥，测定蛋白浓度（mg/ml）。
	<ol>
		<li>可选：测定消光系数 ε，以便在后续纯化中通过 Beer-Lambert 定律测定 280 nm 处的吸光度来计算蛋白浓度：c = A280nm/εl，其中 l 为光程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 纯化蛋白的生物素标记
<ol>
	<li>将蛋白质在10,000 MWCO透析盒中用10 mM Tris缓冲液（pH=8.0）透析，每4小时更换一次缓冲液，共更换6次。</li>
	<li>将重组蛋白（现处于10 mM Tris缓冲液中）转移至2 ml微量离心管中，用于生物素标记。</li>
	<li>使用生物素蛋白连接酶试剂盒对蛋白质进行生物素标记。</li>
	<li>将蛋白质使用10,000 MWCO透析盒在PBS缓冲液（pH=7.4）中透析，每天更换3次缓冲液，持续2天。</li>
	<li>使用定量试剂盒测定蛋白质的生物素标记百分比。</li>
	<li>按照6.4节所述方法再次测定蛋白浓度，并于4 °C保存，或分装后于-20 °C长期保存。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

重组蛋白工程是一项跨越多个学科的强大技术。该技术成本效益高、可调节性强，且操作相对简单，能够实现大量定制化蛋白质的生产。需要特别注意的是，目标蛋白的设计与表达并非总是直接可行。基础表达水平和重组蛋白的稳定性取决于载体、大肠杆菌（E. coli）菌株、肽标签添加以及培养参数的具体选择。我们的特定设计标准采用已广泛验证的大肠杆菌（E. coli）菌株用于蛋白工程。此外，质粒载体包含T7 lac启动子和氨苄青霉素抗性基因，以实现重组蛋白的稳定表达。

在获得高纯度亚克隆质粒后，首要的主要步骤是将目标蛋白成功转化至宿主细胞，并确定该蛋白的可溶性。测试表达是优化目标蛋白合成的最佳时机。应挑取小而孤立的菌落（图&#160;2A) 以确保更有效地筛选含有质粒的细菌细胞。可采用一些故障排除策略，例如重新划线以重新分布菌落，或缩短琼脂平板的培养时间，从而有助于获得更好的菌落形态。重组蛋白的表达会诱导宿主菌株产生应激反应，这一现象并不意外。36</s...

蛋白质是一类广泛存在的生物大分子，负责执行多种生物学功能，最终促成组织的正常形成与有序构建。这些分子可启动成千上万条信号通路，调控基因及其他蛋白质的上调和/或下调，从而维持人体内部的稳态平衡。单个蛋白质的功能异常会影响整个信号网络，可能导致严重疾病或障碍的发生。在实验室中对单个蛋白质进行工程化改造，为应对这些不良效应提供了一种解决方案，并可作为小分子药物的替代策略。1977年，编码14个氨基酸生长抑素序列的基因成为最早利用基因工程技术合成的多肽之一 E. coli11979年不久之后，胰岛素被克隆至质粒pBR322中，并实现了转化、表达与纯化。2自那时起，重组蛋白的影响已扩展到多个研究领域，如生物材料、药物递送、组织工程、生物制药、农业、工业酶制剂和生物燃料。 等等。 （参见相关综述文献）3-8这主要归因于该技术通过添加特定应用的化学基团或蛋白质序列所展现出的多功能性，这些修饰可用于靶蛋白的鉴定、稳定化和纯化等多种目的。

通过重组DNA技术，可在多种真核和原核宿主系统中表达重组蛋白，包括哺乳动物、植物、昆虫、酵母、真菌或细菌。每种宿主系统具有不同的优势，通常需根据蛋白功能、产量、稳定性、总体成本及可扩展性来确定最佳表达系统。细菌细胞通常缺乏真核宿主所具备的翻译后修饰机制即&#160;糖基化，二硫键桥接 等等。)5因此，哺乳动物和昆虫表达系统通常能实现更佳的真核蛋白兼容性与表达效果；然而，这些宿主系统的使用成本通常更高，且耗时较长9因此， E. coli 是本表达系统的首选宿主，因为其细胞在廉价的培养条件下即可快速增殖，且其基因表达机制已被深入阐明5,9此外，该系统易于放大用于生产目的，尽管缺乏翻译后修饰，仍能产生具有功能的蛋白质。10。该 E. coli 本方案选择K12菌株用于克隆，因为该菌株具有高效的转化效率，可获得优良的质粒产量。此外， E. coli BL21菌株被用于表达，因为该宿主菌株含有T7 RNA聚合酶基因，可实现蛋白质表达的调控与稳定性11.
在宿主选择之后，还需谨慎选择理想的表达载体，以实现目标蛋白的特异性与可控性表达。重组蛋白的合成始于目的DNA序列，该序列在噬菌体T7转录和翻译信号的调控下被克隆，随后在含有染色体整合T7 RNA聚合酶基因的宿主细胞中诱导表达12。这些载体源自质粒pBR322（综述见参考文献13），其表达由Studier及其同事最初开发的T7启动子严格调控14，并通过引入lac操纵子和lac阻遏蛋白（lac1）实现进一步控制15,16。在重组蛋白工程中，该表达系统可通过插入不同的目的DNA序列来定制目标蛋白的特定氨基酸序列，或通过融合单个蛋白的结构域来构建融合蛋白。此外，某些载体系列可在N端或C端添加肽标签修饰。在本研究设计中，我们在目的DNA序列上添加了组氨酸（His）标签以利于纯化，并引入了一段15个氨基酸的可生物素化序列用于后续生物素标记17,18。本实验选用含有氨苄青霉素抗性基因的质粒来携带可生物素化的融合蛋白序列。该载体中的表达由T7 lac启动子调控，并可通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）轻松诱导表达。
测试表达（小规模培养）用于确定目标蛋白的存在及其溶解性，该蛋白可表达为可溶性或不可溶性形式，以制定相应的纯化方案。在细菌细胞内表达的可溶性蛋白会自发折叠，以维持其天然结构19。通常情况下，天然结构在热力学上是有利的。在许多情况下，宿主的代谢活性不利于目标蛋白的正确折叠，导致系统产生压力，从而生成不溶性蛋白，并形成由不溶性蛋白聚集体组成的包涵体。因此，目标蛋白发生变性，通常失去生物学活性20。两种测试表达产物均可放大规模，而分离纯化方案则取决于目标蛋白的溶解性。对于不溶性蛋白，需要额外的复性或重折叠步骤。所得的重组蛋白可进一步通过尺寸排阻色谱法进行纯化。
实验室自产重组蛋白相比商业产品具有成本优势，因为每升主培养液可分离出毫克级的目标蛋白。所需的大部分设备在典型的生物或化学实验室中均具备。蛋白质工程可构建具有额外功能的定制融合蛋白，而这些融合蛋白并非总能从商业途径获得。 图1 展示了重组蛋白构建中的主要操作步骤。利用该表达系统，我们已成功制备多种可生物素化的蛋白，如干扰素-γ、血小板源性生长因子和骨形态发生蛋白21-23，但我们将重点关注我们设计的两种用于轴突导向的蛋白质：NGF（29 kDa）和 Sema3A（91 kDa）10 （详见参考文献，供审阅）24）。生物素化是一种常用技术，利用已知的生物素-链霉亲和素相互作用，用于标记蛋白质的鉴定、固定和分离25-27生物物理探针28,29生物传感器30和量子点31 是一些利用生物素-链霉亲和素结合高亲和力（K）的系统示例d 约10-15 M&#160;27。该 E. coli 生物素连接酶 BirA 有助于将生物素共价连接至生物素标签序列内的赖氨酸侧链18,32将生物素与材料及生物分子偶联已实现向细胞持续递送生长因子，广泛应用于多种组织工程领域21,33-35因此，设计这些可生物素化的定制蛋白是一种强大的工具，能够跨越多个研究领域。

<table><tbody><tr><td>1,4-二硫苏糖醇，DTT，99.5%</td><td>Chem-Impex International</td><td>127</td><td>100 g</td></tr><tr><td>2-羟乙基硫醇 &amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Chem-Impex International</td><td>642</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td>25 g</td></tr><tr><td>消泡剂 204</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6426</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Barstar-NGF pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 &amp;micro;g</td></tr><tr><td>BL21(DE3) 感受态细胞</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>1 ml；表达宿主</td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>BugBuster</td><td>Novagen</td><td>70922-3</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>凝胶过滤标准品</td><td>Bio-Rad</td><td>151-1901</td><td>6 瓶</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>盐酸胍/氨基甲酰胍盐酸盐</td><td>Chem-Impex International</td><td>152</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>His-Pur Ni-NTA 树脂</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>咪唑&amp;nbsp;</td><td>Chem-Impex International</td><td>418</td><td>250 g</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Chem-Impex International</td><td>194</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Laemmli 上样缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>30 ml</td></tr><tr><td>月桂基硫酸钠，十二烷基硫酸钠</td><td>Chem-Impex International</td><td>270</td><td>500 g</td></tr><tr><td>LB 培养基&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>NovaBlue 感受态细胞</td><td>Novagen</td><td>69825</td><td>1 ml；克隆宿主</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>10 包</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sema3A-pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 &amp;micro;g</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>1 L</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td>500 g</td></tr><tr><td>优质肉汤（Terrific Broth）</td><td>Bioshop</td><td>TER409.5</td><td>5 kg</td></tr><tr><td>盐酸四环素</td><td>Chem-Impex International</td><td>667</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Tris/甘氨酸/SDS 缓冲液，10×</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>EMD</td><td>1.07213.1000</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>酵母提取物，颗粒状</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;Auml;KTApurifier10</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td>包含试剂盒和配件</td></tr><tr><td>台式轨道摇床</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4000</td><td>MAXQ 4000</td></tr><tr><td>BirA500</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>酶附带反应缓冲液和生物素溶液</td></tr><tr><td>透析盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>66380</td><td>Slide-A-Lyzer（加强型）</td></tr><tr><td>透析管</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132127, 132129</td><td>截留分子量：25,000 和 50,000</td></tr><tr><td>流路切换阀 FV-923</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0011-70</td><td></td></tr><tr><td>FluoReporter 生物素定量检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>1094598</td><td></td></tr><tr><td>Frac-950 收集管架，C 型架</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-13</td><td></td></tr><tr><td>组分收集器 Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td>包含试剂盒和配件</td></tr><tr><td>加热/制冷循环器&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>13271-102</td><td>型号 1156D</td></tr><tr><td>加热烘箱 FD 系列</td><td>Binder</td><td></td><td>型号 FD 115</td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td>已停产——替代产品：HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td></tr><tr><td>J-26 XPI Avanti 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>JA 25.50 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>JLA 8.1 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>969329</td><td>包含 1 L 聚丙烯瓶</td></tr><tr><td>JS 5.3 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td>Thermo Scientific</td><td>1849</td><td>Forma 1800 系列洁净工作台</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>TECAN</td><td></td><td>infinite M200</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td>4 块胶垂直电泳系统</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX 预制胶</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td>任意 kDa，15 孔梳</td></tr><tr><td>Ni-NTA 柱</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2512</td><td>49 ml&amp;nbsp;体积 ECONO-Column</td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC 电源</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td>250 V，3 A，300 W</td></tr><tr><td>圆底聚丙烯共聚物离心管</td><td>VWR</td><td>3119-0050</td><td>50 ml&amp;nbsp;离心管，适用于 JA 25.50 转子</td></tr><tr><td>Spin-X UF 浓缩管</td><td>Corning</td><td>431488, 431483</td><td>&amp;nbsp;20 和 6 ml；截留分子量：10,000 Da</td></tr><tr><td>亚克隆服务</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>蛋白服务</td></tr><tr><td>超声波处理器&amp;nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>18910445A</td><td>型号 CV18</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>型号 G560</td></tr></tbody></table>

可溶性与不可溶性生物素化蛋白的表达、分离与纯化在神经组织再生中的应用

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

重组蛋白工程已得到利用 大肠杆菌（Escherichia coli） 近40年来几乎用于所有表达系统，时至今日 E. coli 仍然是使用最广泛的宿主生物。该系统的灵活性允许添加诸如生物素标签（用于链霉亲和素相互作用）以及绿色荧光蛋白或樱桃红蛋白等较大的功能蛋白。此外，通过整合非天然氨基酸，如金属离子螯合剂、具有独特反应活性的功能基团、光谱探针以及可赋予翻译后修饰的分子，使得对蛋白质性质和功能的操控更加精确。因此，该技术能够创建可定制的融合蛋白，在多个研究领域具有重要应用价值。特别是，由于生物素与亲和素及链霉亲和素之间具有高亲和力的相互作用，生物素化蛋白序列已被广泛整合到多种靶蛋白中。这一修饰有助于增强标记蛋白的检测与纯化，并为细胞分选等后续应用开辟了途径。因此，生物素标记分子在生物工业和生物医学领域的影响日益广泛。在本研究中，我们构建了含有神经生长因子（NGF）和信号素3A（Sema3A）功能区域的重组生物素化融合蛋白。我们此前已报道过这些生物素化融合蛋白以及其他活性蛋白序列如何被固定于生物材料上，用于组织工程与再生医学目的。本实验方案概述了在毫克规模上构建可生物素化蛋白的基本步骤，利用&#160; T7 lac 可诱导载体和 E. coli 表达宿主，从转化开始，到扩增和纯化。

克隆与测试表达
正确涂布时，应形成单个分离的菌落，以提高挑取克隆转化细菌细胞的几率（图2A）。然而，若涂布细胞过多、平板在37 °C孵育时间过长或转化效果不理想，则菌落可能覆盖整个琼脂平板或形成较大的细胞聚集体（图2B和图2C）。在测试表达过程中，NGF和Sema3A首先在37 °C诱导4小时，SDS-PAGE分析结果显示两种蛋白均位于可溶性组分中（图2D）。蛋白表达量尚可，因此进一步考察了在18 °C过夜诱导的表达情况。结果表明，NGF在可溶性组分中的表达有所改善，而Sema3A则无明显差异（图2E）。
分离、纯化与生物素标记
NGF 和 Sema3A 均采用上述方案中所述的天然分离技术进行分离，并通过 FPLC 柱进行纯化。此外，这些...

开发可生物素化的融合蛋白在各个研究领域具有广泛的应用前景。重组蛋白工程技术是一种简单直接且成本效益高的方法，能够高效地获得按特定设计定制的蛋白质。

重组蛋白工程已利用大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）表达系统近四十年，如今大肠杆菌仍然是最常用的……

本实验的总体目标是成功设计、表达并分离出可应用于多种领域的重组生物素化蛋白，例如探针、传感器、药物递送系统以及组织工程。首先通过小规模培养，将定制设计的质粒转化至细菌宿主细胞系中，随后诱导目标蛋白的表达。接着，检测目标蛋白的表达情况及其溶解性，以确定合适的纯化方案。然后扩大实验规模以获得更多的目标蛋白产量，并利用亲和层析技术进行分离。最后，对蛋白质进行纯化并浓缩，用于后续应用和分析。最终通过SDS-PAGE和FPLC结果验证重组蛋白已成功分离和纯化，并进一步检测其功能活性。重组蛋白工程的主要优势在于，它使我们能够大规模或以毫克级产量制备按特定科学需求设计的定制蛋白质。例如，我们可以在这些蛋白质的特定区域添加新的功能元件，从而赋予其新的特性。今天我们将向您展示如何对特定蛋白质的末端进行生物素标记，并利用这种标记将蛋白质特异性地固定或锚定在表面，以调控细胞功能，如神经元的轴突生长或神经元分化。初次接触该技术的研究人员在遵循天然或非天然蛋白质分离的操作步骤时，不应遇到太大困难。许多操作步骤是相同的，但需要使用针对天然或非天然条件配制的特定缓冲液。在实验初期应仔细注意各项细节。转化和测试表达阶段将确保在后续的最终放大过程中获得高蛋白产量。该方法的可视化演示非常重要，因为它展示了如何使用简单的实验室设备和试剂来制备重组蛋白。通过简单的分批反应，可将诱导剂和培养基在小规模培养中扩增，每主培养可产生10毫克蛋白。此外，可采用并演示色谱技术，以展示蛋白质如何进一步纯化用于下游应用。今天，研究生Alicia将在Cinema实验室演示该实验流程。在克隆目标蛋白基因并检测其表达，以及将20毫升培养物过夜培养后，根据文本方案，将过夜培养物倒入含氨苄青霉素的1.8升无菌培养基中，并使用巴斯德移液管加入6至8滴无菌消泡剂204。将培养物置于37°C水浴中，通过0.2微米滤膜，利用通气石向培养物中通入压缩空气。当培养物OD600达到0.7至0.8时，加入终浓度为1毫摩尔的IPTG，在37°C诱导表达4小时，或在18°C过夜诱导，具体条件取决于目标蛋白在前期表达测试中位于可溶性组分还是不溶性组分。收集细胞的实验步骤如下：将培养物转移至一升离心瓶中，在4°C条件下以14,000 × g离心15分钟。倒去上清液，用薄刮勺将细菌沉淀刮下，并分装至两个50毫升离心管中。再次短暂离心以沉淀细胞，随后将沉淀物于-80°C保存。为了进行非天然蛋白质的分离，针对每个冷冻的 E. coli 菌体沉淀物，加入 20 毫升裂解洗涤缓冲液，涡旋并振荡以充分重悬，彻底消除任何大块沉淀物。在诱变剂中过夜孵育后，溶液将呈现为黏稠的悬浊液，于20,500 ×g、室温下离心30分钟。将上清液转移至新离心管中，弃去沉淀，用于天然蛋白质的分离。将沉淀重悬于裂解缓冲液中，终体积为30毫升，重悬后的沉淀置于冰上。将超声破碎仪设置为30%的振幅，脉冲模式为开启30秒、关闭30秒，超声处理5分钟。在超声过程中上下轻轻移动离心管，以彻底打散细胞沉淀。在 20,500 ×g 和 4 °C 条件下离心悬浮液 30 分钟。然后将上清液转移至新的离心管中，并弃去沉淀。为对非天然状态分离的蛋白质进行亲和层析，向每个离心管中加入 1 毫升镍-NTA 树脂溶液，并在室温下于旋转仪或摇床中孵育至少 1 小时。将悬浊液倒入亲和柱中，打开活塞阀，使溶液完全流入废液杯中。向离心管中加入10毫升洗涤缓冲液，以冲洗残留的树脂，并在溶液流尽后将该溶液加入柱中。用玻璃搅拌棒搅拌树脂，待其完全流尽后，再进行下一次洗涤。接下来，使用10毫升洗涤缓冲液重复冲洗离心管，并将其转移至层析柱中。然后用10毫升裂解洗涤缓冲液对层析柱再进行八次洗涤，每次洗涤使用10毫升缓冲液。洗涤完成后，关闭旋塞，将废液烧杯更换为50毫升离心管。向柱中加入 15 毫升洗脱缓冲液，混匀树脂，并让溶液静置 5 分钟。然后打开活塞，收集 EIT，再用额外的 15 毫升洗脱缓冲液重复操作，以纯化天然蛋白。将镍-NTA 树脂加入蛋白溶液后，在 4°C 下于摇床中孵育至少 1 小时。使用洗涤缓冲液洗涤层析柱10次后，加入5 mL洗脱缓冲液，孵育树脂5分钟，然后在EIT从层析柱滴出时，用新的离心管收集大部分EIT。在透明的96孔板中，每孔加入90 μL Bradford试剂。每次用5 mL缓冲液洗脱后，让10 μL溶液从层析柱滴入含有90 μL Bradford试剂的孔中。继续进行EEU操作，直至检测不到蛋白质为止，然后进行透析和/或Rena。将蛋白质转移至透析管中，并在适当的缓冲液中进行透析，先在4°C条件下透析四小时，然后更换为相应的缓冲液，再于4°C条件下透析两个晚上。使用离心浓缩装置将透析后的蛋白质浓缩至小于5 mL，并可根据需要通过八联进行尺寸排阻色谱进一步纯化。根据实验表达方案，在37摄氏度诱导4小时后，NGF和SEMA3A均被诱导表达，并通过SDS-PAGE分析确定两种蛋白均位于可溶性组分中。蛋白表达量尚可，因此进一步尝试在18摄氏度下过夜诱导的表达条件。结果显示，NGF在可溶性组分中的表达有所改善，而SEMA3A则无明显差异。在天然和非天然条件下分离NGF，并通过FPLC柱进行纯化。尽管在测试表达期间NGF存在于可溶性组分中，但在37摄氏度和18摄氏度诱导条件下，天然分离均获得较低的产量。然而，通过非天然分离并结合复性，获得了较高的NGF产量。因此，NGF 在非天然条件下被分离。在 18 摄氏度下过夜诱导后，非天然分离未产生 SEMA three A，而天然分离在两升主培养物中产量为 8.61 ± 3.1 毫克。因此，SEMA three A 在 37 摄氏度下诱导四小时，并采用天然分离参数进行分离。收集FPLC峰，并使用SDS-PAGE分析NGF和SEMA3A样品。在SEMA3A的FPLC洗脱液中发现的额外蛋白峰也被收集并进行SDS-PAGE分析，这些峰不在SEMA3A分子量区域。这些组分很可能是降解产物，因为在基于细胞的功能实验中，它们不表现出与SEMA3A相同的生物学活性。此处指示一个峰。一旦建立并掌握重组蛋白的分离与纯化方法，若操作得当，整个过程仅需数天即可完成。然而，初始的细菌转化及表达测试阶段耗时较长，以准确鉴定蛋白的可溶性。确定溶解度后，可将转化后的细菌文库保存于-80℃。此外，在蛋白表达后，大肠杆菌菌体沉淀也可保存于-80℃，直至进行后续的分离与实验。在进行该操作时，务必确保缓冲液经过灭菌并新鲜配制，以防止蛋白酶降解和破坏目标蛋白。每四到六周应配制并灭菌一次裂解缓冲液，透析缓冲液应在蛋白分离前一天配制。为防止多种生物素化蛋白之间的交叉污染，N-I-N-T-A 柱和 FPLC 柱应根据制造商的方案进行清洗。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用细菌表达系统表达、分离和纯化自行设计的生物素化蛋白。这与科学界和工业界在小规模和大规模生产中采用的方法类似，因此具有广泛的应用前景。

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科研

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Bioengineering

生物工程

表达，分离，纯化可溶性和不溶性蛋白质生物素对神经组织再生

受调控的内吞作用决定了大多数膜蛋白在细胞表面的表达水平。本文中，我们利用可还原且不能透过膜的生物素化试剂，测定多拓扑膜蛋白——多巴胺转运体（DAT）的内吞速率。该方法为测定大多数质膜蛋白内吞速率提供了一种简便直接的途径。...

通过可逆生物素化测定质膜蛋白内吞速率

本视频演示了从星形胶质细胞培养物中分离细胞表面蛋白和细胞内蛋白的方法。将星形胶质细胞培养物置于冰上以抑制内吞作用，随后用生物素化试剂标记细胞表面蛋白。细胞裂解后释放出生物素标记的细胞表面蛋白和未标记的细胞内蛋白。最后，使用链霉亲和素包被的磁珠将生物素标记的细胞表面蛋白与细胞内蛋白分离。...

星形胶质细胞培养物中细胞表面蛋白与胞内蛋白的分离

神经元膜运输动态调控质膜蛋白的可用性，并显著影响神经传递。 迄今为止，在成年神经元中测量内吞运输仍具挑战性。 本文中，我们描述了一种高效且定量的方法，可在急性脑切片中体外（ex...

脑片生物素化：一种 离体 成年神经元中区域特异性血浆膜蛋白运输的测量方法

脑源性神经营养因子（BDNF）的轴突运输对多种神经元群体的存活和功能至关重要。某些变性类疾病的特点是轴突结构和功能的破坏。我们展示了利用原代神经元在微流控芯片中检测QD-BDNF活体运输的技术。...

原代神经元中量子点标记的BDNF轴突运输的实时成像

采用改良的密度梯度离心法从微小牛蜱（Rhipicephalus...

从细胞表面纯化生物素标记的蛋白质 微小牛蜱 上皮肠道细胞

本报告介绍了两种基于生物素标记的方法，用于测定在质膜上表达的蛋白质的细胞表面表达水平及其内吞速率。...

利用生物素标记法测定原代星形胶质细胞培养物中蛋白质的细胞表面表达及内吞速率

通过唾液酸聚糖的代谢标记鉴定原代神经干细胞与前体细胞的细胞表面标志物

本文介绍使用生物素标记的体外生化检测方法，该方法可广泛应用于 适用于研究蛋白质-核酸相互作用。...

利用生物素标记进行体外生化实验研究蛋白质-核酸相互作用

在HEK293细胞中以低成本表达含有Avi序列的重组BDNF（BDNFAvi），并通过亲和层析进行纯化。随后在离心管中利用BirA酶对BDNFAvi进行直接单生物素标记。与 commercially available BDNF 相比，BDNFAvi 及单生物素化BDNFAvi...

一种改进的方案：在离心管中纯化并直接单生物素标记重组BDNF，用于神经元细胞内运输研究

本方案介绍了一种基于生物素连接酶与目标蛋白融合后，利用其邻近效应在活体（in...

体内邻近生物素化用于四膜虫（Paramecium tetraurelia）蛋白质相互作用研究

学习利用细菌表达系统设计和纯化重组生物素化蛋白质的方法。本技术通过质粒转化、诱导表达和亲和层析，成功分离可溶性与不溶性蛋白，适用于神经组织再生等生物医学研究。

可溶性与不可溶性生物素化蛋白的表达、分离与纯化在神经组织再生中的应用

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