表达，分离，纯化可溶性和不溶性蛋白质生物素对神经组织再生

该程序的总体目标是成功设计、表达和分离重组生物素化蛋白，这些蛋白可以整合到各种应用中，例如探针、传感器、药物递送和组织工程。这是通过首先使用小规模培养物将定制设计的质粒转化为细菌宿主细胞系，然后诱导靶蛋白的表达来实现的。接下来，确定目标蛋白的存在和溶解度，以便制定适当的纯化程序。

然后，将程序扩大以产生更高产量的靶蛋白，然后使用亲和层析技术分离。最后，蛋白质被纯化，然后浓缩用于下游应用和分析。最终，SDS 页面和 FPLC 结果验证重组蛋白已成功分离和纯化，并进一步测试蛋白质的功能。

重组蛋白质工程的主要优势在于，它使我们能够创建大规模或毫克级的定制设计蛋白质，以满足我们确切的科学规格。例如，我们可以为这些蛋白质的某些部分添加新功能以实现新的特性。我们今天将向您展示如何在特定蛋白质的末端进行生物素处理，并使用它来特异性地将这些蛋白质固定或拴在表面上，以指导细胞功能，例如神经元生长或神经元分化。

刚接触该技术的个体在遵循天然或非天然蛋白质分离程序时应该不会有太大困难。许多步骤是相同的，但需要针对非天然条件配制的特定缓冲液。开始时要仔细注意细节。

转化和测试表达阶段将确保在后期的最终放大过程中实现高蛋白产量。该方法的可视化演示非常重要，因为它展示了如何使用简单的实验室设备和耗材制备重组蛋白。利用简单的分批反应，e-均等化和生长培养基以领先规模生长，每个主要培养物产生 10 毫克蛋白质。

此外，可以使用和演示层析技术来展示如何进一步纯化蛋白质以进行下游应用 今天，毕业生 Alicia Cinema Lab 将演示在克隆和测试目标靶蛋白表达后，并在过夜培养 20 毫升培养物后的程序。根据文本方案，将过夜培养物倒入 1.8 升含氨苄青霉素的无菌生长培养基中，并使用粘贴移液管将 6 至 8 滴无菌消泡剂 2 0 4 位培养物通过 0.2 微米过滤器放入 37 摄氏度的水浴中，通过曝气石将压缩空气吹入培养物中。当培养物在 1 毫摩尔 IPTG 下达到 0.7 至 0.8 的 OD 600 并在 37 摄氏度下诱导 4 小时或在 18 摄氏度下过夜时，取决于蛋白质是在测试表达中的可溶性部分还是不溶性部分中发现。

收集细胞的实验，将培养物转移到 1 升离心瓶中，并在 14， 000 倍重力和 4 摄氏度下旋转 15 分钟。倒出超级 natin，用细刮刀将细菌沉淀舀入两个 50 毫升的试管中。通过离心几分钟再次沉淀细胞，然后将沉淀物储存在零下 80 摄氏度。

执行非天然蛋白质。分离每个冷冻大肠杆菌沉淀的不溶性蛋白质。加入 20 mL 裂解液、洗涤缓冲液，涡旋并摇匀以重悬以去除任何大块。

在 mutator 上孵育过夜后，溶液看起来就像粘稠的浆液离心机。浆料在 20、500 倍重力和室温下放置 30 分钟。将上清液转移到新试管中，弃去沉淀以进行天然蛋白质分离。

Resus 将沉淀以 30 mL 的最终体积悬浮在裂解缓冲液中，并将重悬的沉淀置于冰上。将超声处理液设置为 30% 振幅，脉冲为 30 秒，关闭 30 秒，超声处理 5 分钟。在超声处理过程中上下摆动试管以完全打碎细胞沉淀。

浆料在 20、500 倍重力和 4 摄氏度下离心 30 分钟。然后将上清液转移到新试管中并丢弃沉淀。要对非天然分离的蛋白质进行亲和色谱，向每个离心管中加入 1 毫升镍 NTA 树脂溶液，并在室温下在突变器或摇床上孵育至少 1 小时。

将浆液倒入亲和柱中，让溶液通过旋塞阀完全滴入废液杯中。向离心管中加入 10 mL 洗涤缓冲液以去除残留树脂，并在溶液滴落后将溶液添加到色谱柱中。使用玻璃搅拌棒搅拌树脂，让它完成滴落，然后再添加另一次洗涤。

接下来，使用 10 毫升洗涤缓冲液重复离心管的冲洗并将其转移到色谱柱中。然后用每次洗涤 10 mL 裂解洗涤缓冲液再对色谱柱进行 8 次洗涤。洗涤完成后，关闭旋塞，用 50 毫升离心管更换废烧杯。

向色谱柱中加入 15 mL Elucian 缓冲液，搅拌树脂，让溶液静置 5 分钟。然后打开旋塞并收集 EIT，然后再加入 15 mL 洗脱缓冲液以纯化天然蛋白质。将镍 NTA 树脂添加到蛋白质溶液中后，在 4 摄氏度的突变体上孵育至少 1 小时。

使用洗涤缓冲液洗涤色谱柱 10 次后，加入 5 mL 洗脱缓冲液并孵育树脂 5 分钟，然后使用新试管收集大部分 EIT，同时 EIT 从色谱柱上滴落，每孔加入 90 μL Bradford 试剂到透明的 96 孔板中。在每 5 mL 含缓冲液的 elucian 后，让 10 μL 溶液从色谱柱滴入含有 90 μL Bradford 试剂的孔中。继续使用 EEU，直到不再检测到用于透析和/或 Rena 的蛋白质。

蛋白质将每个 EIT 转移到透析管中，并针对适当的缓冲液进行透析，在 4 摄氏度下透析 4 小时，然后更换相应的缓冲液。2 个过夜，摄氏 4 度。使用离心浓缩器将透析的蛋白质浓缩至小于 5 mL，如果需要，使用 atin 8 使用尺寸排阻色谱进一步纯化。

根据测试表达期间的文本方案，首先在 37 摄氏度下诱导 NGF 和 SE 3 A 4 小时，SDS 页面分析确定两种蛋白质都位于该可溶性组分中。蛋白质表达似乎是公平的，因此检查了另一种在 18 摄氏度下过夜诱导的测试表达。NGF 表达在可溶性组分中有所改善，而与 SEMA 3 没有明显差异。

在非天然和非天然条件下分离 NGF，并通过 FPLC 色谱柱进行纯化。尽管在测试表达过程中 NGF 位于可溶性组分中，但天然分离在 37 摄氏度和 18 摄氏度诱导下均产生低产量。然而，通过非天然分离和再成熟获得了更高的 NGF 产量。

因此，NGF 是在非天然条件下分离的。在 18 摄氏度下过夜诱导后，非天然分离导致无 SEMA 三 A 产生，每升 2 升主要培养物产生 8.61 毫克或负 3.1 毫克，用于天然分离。因此，在 37 摄氏度下诱导 SEMA 3 A 4 小时，并使用天然分离参数进行分离。

收集 FPLC 峰，并使用 SDS 页面分析 NGF 和 SEMA 3 A 样品。收集在 SEMA 3 A 的 FPLC 输出中发现的其他蛋白质峰，并使用 SDS 页面进行分析，这些峰未位于 SEMA 3 A 分子量区域。这些级分很可能是降解产物，因为它们在基于细胞的测定中没有功能，就像 SEMA 3 一样。

此处指示的峰值。一旦建立并掌握了重组蛋白，如果作得当，分离和纯化只需几天时间。然而，初始细菌转化和测试测试表达阶段需要更长的时间才能正确识别蛋白质溶解度。

一旦确定了溶解度，转化细菌的文库就可以储存在零下 80 度中。此外，在蛋白质表达后，大肠杆菌沉淀也可以储存在零下 80 度，直到进一步分离和实验。尝试此程序时，请务必确保缓冲液经过消毒并新鲜处理，以防止蛋白酶变性并分解蛋白质。

应每 4 至 6 周制备一次分离缓冲液并消毒一次，透析缓冲液应在分离前一天制备。N-I-N-T-A 和 FPLC 色谱柱应根据制造商的方案保持清洁，以防止多种生物素化蛋白质的交叉污染。观看本视频后，您应该对如何使用细菌宿主表达系统表达、分离和纯化定制设计的生物素化蛋白有很好的了解。

这类似于小规模和大规模的科学和商业工作。因此，这具有广泛的应用。