有丝分裂中的不同发育阶段小鼠胚胎皮层实时成像
June 4th, 2014
神经祖细胞有丝分裂是神经发生的一个关键参数。很多我们的神经祖有丝分裂的理解是基于固定的组织分析。在胚胎大脑切片实时成像是一种通用的技术，以评估有丝分裂与在受控环境中高时空分辨率。
该程序的总体目标是对活小鼠脑切片中的神经祖细胞有丝分裂进行成像和分析。这是通过首先从胚胎中解剖大脑来实现的。第二步是用颤音准备脑切片。
接下来，进行脑切片的实时成像。最后一步是从电影中提取信息以分析感兴趣的有丝分裂参数。最终，延时显微镜用于显示大脑的祖细胞群如何实时分裂。
与现有方法（例如固定分析）相比，该技术的主要优点是可以显着了解活脑切片中神经祖细胞分裂的时间动态。它还可用于了解遗传扰动如何影响神经祖细胞分裂。虽然我们使用这种方法来了解皮层发育，但我们描述的分析可以应用于其他大脑区域甚至大脑外干细胞的有丝分裂研究。
演示此程序的是我实验室的博士后研究员 Louis y。通过收集小鼠胚胎并解剖出胚胎脑来开始此过程，包括后脑和具有两个大脑半球的四个大脑。在一桶冰中，在冰上为嵌入模具挖一个洞。
接下来，将 3%aros 培养基倒入塑料模具中，然后将该模具放入冰上的孔中。用数字温度计的尖端搅拌 aros 培养基，直到温度达到 35 摄氏度。然后立即将大脑转移到包埋介质中，以去除大脑和 aros 之间界面处多余的 HBSS。
在包埋溶液中小心地轻轻地反复旋转大脑。使用镊子，在与冰接触的模具底部会形成一个凝胶状的 aros 垫。一旦可以用镊子的尖端感觉到垫子，同时搅拌大脑，将大脑的背侧朝上，大脑就不应该沉到模具的最底部。
让 aros 在冰中硬化至少五分钟，然后用剃须刀片切开模具的边角。小心地在大脑周围刻一个 aros 块，并尝试尽量减少切割次数，以避免扰乱嵌入的大脑。使用 VT 1000 s Viome 可生成 200 至 250 微米的切片。
现在，在补充有生长因子的切片培养基中将细胞 11 稀释至 0.5 至 1 微摩尔的最终浓度，并在 12 孔板中将来自一个大脑的切片在每个孔中的 2.5 毫升染色溶液中在 37 摄氏度下孵育 1 小时。然后在 2.5 mL无染色溶液的切片培养基中洗涤切片 20 分钟。要安装大脑切片，请在 35 毫米玻璃底微孔培养皿的底部滴一滴胶原蛋白溶液。
用移液器吸头将其展开以匹配切片的大小。然后将一片转移到一滴胶原蛋白中。让切片在室温下孵育 10 分钟，然后将它们转移到含有 37% 二氧化碳的 5 摄氏度培养箱中。
20 分钟后，将总共 1.2 mL 的切片培养基放入玻璃底微量培养基中，一次放入 600 μL 培养基中，并用移液管吸头涂抹。让切片在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中恢复至少 1 小时 30 分钟，然后以相同的条件将它们转移到旋转盘共聚焦显微镜的培养室中。对于实时成像，请使用 60 x 硅油物镜，工作距离为 300 微米，数值孔径为 1.3。
对于细胞成像图像，细胞位于 30 微米的 Z 堆栈中，Z 堆栈的中心位于切片表面以下约 40 微米处。如有必要，调整激光功率和曝光时间以限制光漂白，并使用 30 到 200 毫秒的曝光时间，具体取决于 cyto 11 信号的强度。以下是可以从此分析中获得的代表性数据，以识别图像 J 中的有丝分裂图.打开一个位置的数据集作为超堆栈后，选择一个组织和细胞看起来健康的 Z 平面。
向后滚动以确定细胞进入有丝分裂的时间点。像元可以在 Z 平面上移动，但时间分辨率和前面描述的 Zack 参数已经过优化，可以启用此过程。在电子表格中，记录细胞进入有丝分裂时 hyper 堆栈中细胞的四个 D 坐标。
知道这些坐标可以防止多次计数同一个单元格。向前滚动时间并记录细胞从一个阶段进展到另一个阶段的时间。记录给定细胞每个有丝分裂期的持续时间，以进行细胞的 3D 重建和中期旋转的定量。
在识别出多个有丝分裂细胞后，使用细胞的坐标并向前滚动直到开始。中期旋转整个超堆栈，使心室边界更平坦。使用角度工具确定要应用于此旋转的角度。
确定感兴趣像元在该平面中最明显的 Z 平面。使用矩形选择工具绘制包含整个单元格的选区。然后确定包含感兴趣单元格的 Z 平面，并使用 image duplicate 命令创建子堆栈。
在对话框中，将 duplicate hyper stack 保留为选中切片。Z 参数对应于 Z 平面，包括整个单元格，帧 T 参数对应于当前时间点。之后，生成细胞的 3D 重建。
当前时间点。切片间距对应于每个 Z 平面图像之间的间隔（以微米为单位）。使用滚动条，旋转生成的 3D 重建，以便可以看到中期板的边缘。
帧的编号对应于 beta 角度。记录此数字。然后测量水平和对齐依据之间的角度。
垂直解剖中期板。这是角度 Alpha 记录。这些角度适用于目标细胞的所有中期时间点。
时间点 t 和 t 减 1 之间的旋转角度等于沿背腹轴 t 处的角度与 T 处的这个角度减去 1 之间的差值的绝对值。有丝分裂最容易在脑切片的背侧区域成像，因为 R GCs 的基础过程较短，因此不太可能被 viome 切断。沿着 ROS 的 coddle 轴，背侧皮层 coddle 区域中的切片给出最一致的结果。
这些是成像的好区域和坏区域的示例。在一个好的地区。细胞核呈椭圆形，在不良区域进行延时成像之前，在心室边缘观察到许多有丝分裂细胞，在脑室边缘观察到极少的有丝分裂细胞，细胞核是圆形的。
这是在实时成像之前用低倍显微镜观察到的良好切片示例，以下是处于有丝分裂不同阶段的细胞 11 标记细胞的一些示例。这里显示的是心室边缘区域的蒙太奇，两个神经祖细胞在其中经历有丝分裂的不同阶段，用不同的颜色标记。遵循此程序。可以执行其他方法，例如 DNA 构建体的中性电穿孔，以回答其他问题，包括分裂细胞的命运是什么以及细胞骨架的行为如何？
最好使用 CY 11 之后的二级方法来跟踪有丝分裂，例如 H 两个 VGFP 转基因小鼠。看完这个视频后，你应该对如何作脑切片、哪些匹配参数最好以及如何分析数据有很好的了解。
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概述
本文讨论了活体小鼠脑切片中神经祖细胞有丝分裂的成像和分析。该技术允许在受控环境中对有丝分裂进行高时间和空间分辨率的观察。
主要研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 活体成像技术
背景
- 神经祖细胞有丝分裂对神经发生至关重要。
- 传统研究依赖于固定组织分析。
- 活体成像提供了细胞过程的动态视图。
- 理解有丝分裂可以为发育生物学和神经发育障碍提供信息。
研究目的
- 进行神经祖细胞有丝分裂的活体成像。
- 实时分析有丝分裂参数。
- 增强对脑祖细胞种群动态的理解。
所用方法
- 从小鼠胚胎中解剖出大脑。
- 使用振动切片机制备脑切片。
- 活体成像脑切片以观察有丝分裂。
- 使用时间跨度显微镜对祖细胞分裂进行详细分析。
主要结果
- 成功成像活体切片中的神经祖细胞有丝分裂。
- 实时观察祖细胞种群分裂。
- 识别关键有丝分裂参数。
- 洞察神经发生的动态。
结论
- 活体成像是研究神经祖细胞行为的强大工具。
- 这种方法可以导致对神经发生的更好理解。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上探索神经发育过程。
常见问题
Executive Industry Relevance
Live imaging of mitosis in embryonic mouse cortex enables direct observation of neural progenitor division dynamics, providing critical insights for early neurodevelopmental target validation. This approach enhances predictive confidence in mechanistic studies by capturing real-time cellular events and quantifiable mitotic parameters. The method supports translational continuity from discovery biology to preclinical model development in neuropharmaceutical R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitotic mechanisms underlying neurodevelopmental disorders.
- Supports functional validation of genetic perturbations affecting neural progenitor division.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying mitotic phase durations and spindle dynamics.
- Provides high-resolution data for prioritizing neurodevelopmental targets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated ex vivo brain slice systems for compound or genetic screening.
- Delivers reproducible, quantitative outputs on mitotic progression and cellular morphology.
- Enables standardization of imaging and analysis parameters for cross-study comparability.
- Prepares robust platforms for evaluating candidate interventions on neural progenitor mitosis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitotic phenotypes with disease-relevant neurodevelopmental models.
- Supports continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of neuroactive compounds.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on live cellular outcomes.
- Facilitates biomarker identification through dynamic imaging of mitotic events.
Pipeline & Workflow Integration
This live imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging mechanistic studies and translational model development for neuropharma pipelines.
- Discovery Biology: Provides direct hypothesis testing of mitotic regulation and pathway involvement in neural progenitors.
- Screening: Offers assay-ready, reproducible brain slice systems with quantitative mitotic readouts.
- Analytics: Delivers time-resolved, spatially precise measurements of mitotic phases and spindle orientation.
- Translational Research: Connects cellular phenotypes to disease models for preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a flexible platform adaptable to diverse genetic and pharmacological perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental research.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing high-content, quantitative mitotic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic brain dissection, live imaging, and quantitative image analysis.
- Demands access to advanced confocal microscopy and computational analysis tools.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data annotation.
- Adaptable to various genetic backgrounds and fluorescent labeling strategies.
- Imaging depth and tissue health may limit applicability to certain brain regions or developmental stages.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:17
Dissection and Embedding of the Embryonic Brains
2:24
Embedded Brain Sectioning and Staining
3:59
Live Imaging of the Slices
4:55
Post-acquisition Analysis of Mitosis
7:34
Results: Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex
8:43
Conclusion
