Name: 有丝分裂中的不同发育阶段小鼠胚胎皮层实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-04T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 了解小鼠胚胎脑切片中神经前体细胞有丝分裂的实时成像技术。该方法利用振动切片机和时间延迟显微镜，可在高时空分辨率下动态观察神经发生过程，为研究大脑发育和神经发育障碍提供重要工具。

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作者感谢美国国立神经疾病与卒中研究所/国立卫生研究院（NINDS/NIH）提供的经费支持，项目编号分别为 R00-NS064197 和 NINDS/NIH R01NS083897（均授予 D.L.S.）。

1. 培养基的制备（图1，步骤1）
<ol>
	<li>切片培养基
	<ol>
		<li>25 ml 的脑片培养基足以制备5个玻璃底培养皿，每孔放置2片脑片。</li>
		<li>在50 ml锥形管中，加入250 µl 100倍N2溶液和500 µl不含维生素A的50倍B27溶液，再加入DMEM/F12培养基至总体积为22.5 ml。</li>
		<li>过滤除菌溶液，随后加入 1.25 ml 热灭活马血清和 1.25 ml 胎牛血清。</li>
		<li>在37 °C水浴中孵育溶液&#160;在切片制备的整个过程中。</li>
		<li>添加生长因子（FGF 和 EGF，终浓度为 10） ng/ml 和 20 ng/ml）后立即开始培养。该培养基的成分配比已优化，旨在促进培养细胞的存活，并提高神经前体细胞的增殖速率，从而最大限度地增加在脑片中观察到有丝分裂细胞的概率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完全HBSS解离液
	<ol>
		<li>加入50 ml 10倍浓缩HBSS、1.25 ml 1 M Hepes（pH 7.4，终浓度2.5 mM）、6 ml 2.5 M D-葡萄糖（终浓度30 mM）和2.2 ml 0.9 M NaHCO₃，用去离子水定容至500 ml，配制完全HBSS溶液。3 （FC 4 mM）和高压灭菌的diH2O 至终体积 500 ml。</li>
		<li>过滤除菌后，于 4 °C 保存，直至收集怀孕小鼠的子宫角。该溶液可在 4 °C 保存数周。</li>
		<li>在整个解剖过程中，将HBSS置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>包埋剂
	<ol>
		<li>为包埋4个胚胎脑组织，准备30 ml含3%低熔点琼脂糖的完全HBSS溶液。在50 ml锥形管中加入0.9 g低熔点琼脂糖，并用完全HBSS溶液定容至30 ml。</li>
		<li>用涡旋混合器混匀溶液，然后将管子直立、管盖打开，放入微波炉中熔化。</li>
		<li>微波加热过程中需监控溶液，防止因剧烈沸腾而溢出。一旦开始沸腾，立即停止微波，并涡旋混匀溶液。</li>
		<li>重复这些步骤，直到所有琼脂糖完全融化。</li>
		<li>将试管置于42 °C水浴中保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胚胎解剖（图1，步骤2）
<ol>
	<li>对怀孕小鼠实施安乐死后，取出子宫角并转移至含有冷的完全1×HBSS的10 cm2&#160;培养皿中。胚胎的发育阶段可根据研究需要而变化。本方案已成功用于培养胚胎期E12.5至E17.5的脑切片。由于体积较小，较年轻的胚胎脑组织通常更难操作。</li>
	<li>取出胚胎，并按照此前在大鼠和小鼠中描述的方法分离出胚胎脑组织26,27，直至获得包含后脑和前脑以及两个&#160;大脑半球的完整胚胎脑。所有脑组织解剖完毕前，可将其置于室温下保存。</li>
	<li>取出胚胎，并按照此前在大鼠和小鼠中描述的方法分离出胚胎脑组织26,27，直至获得包含后脑和前脑以及两个&#160;大脑半球的完整胚胎脑。所有脑组织解剖完毕前，可将其置于室温下保存。</li>
</ol>
3. 胚胎大脑的包埋（图1，步骤3）
<ol>
	<li>在装有冰块的容器中，于冰中开一个孔，用于插入包埋模具。</li>
	<li>将3%琼脂糖培养基倒入塑料模具中，并将该模具放入冰中预先制备好的孔内。</li>
	<li>用数字温度计的探针轻轻搅拌琼脂糖培养基，直至温度降至35 °C。</li>
	<li>迅速将脑组织转移至包埋介质中。</li>
	<li>关键步骤：为去除脑组织与琼脂糖界面处多余的HBSS，需用镊子在包埋液中轻柔地反复翻转或旋转脑组织。</li>
	<li>模具底部与冰接触的位置会形成一层凝胶状琼脂糖缓冲垫。当用镊子搅拌脑组织时可感知到该缓冲垫已形成，此时应将脑组织背侧朝上放置。脑组织不应沉至模具的最底部。</li>
</ol>
4. 琼脂糖凝胶块的制备（图1，步骤4）
<ol>
	<li>将琼脂糖置于冰上至少5分钟，使其凝固。</li>
	<li>使用剃刀切去模具的四个角。</li>
	<li>使用剃刀小心地在脑组织周围切割出一块琼脂糖块。尽量减少切割次数，以避免扰动包埋的脑组织。</li>
	<li>确保琼脂糖块在脑的尾侧区域具有较大的表面积（相对于头侧区域，参见图1，步骤4），以提高琼脂糖块在切片台上的稳定性。</li>
	<li>最后一个切割步骤应位于脑的尾侧，此切面将用于确定振动切片机的正确切片平面。</li>
	<li>操作时应使刀片垂直于脑和琼脂糖块的头-尾轴，沿头-尾轴方向从头侧向尾侧滑动刀片，并在距离脑最尾侧区域约5 mm处完成最终切割。</li>
	<li>将琼脂糖/脑组织块暂置一旁，并重复进行其他脑组织的包埋。</li>
</ol>
5. 将包埋好的脑组织转移至振动切片机托盘中（图1，步骤5）
<ol>
	<li>在振动切片机托盘底部滴加一滴胶水。滴胶时应确保琼脂糖块位于振动刀片可及范围内。</li>
	<li>将琼脂糖/脑组织块尾侧朝下放置在解剖刀片边缘，使约50%的组织块悬出刀片边缘。</li>
	<li>将琼脂糖块的尾侧表面贴附于胶水上，然后将解剖刀片滑开，同时用镊子的柄部轻压琼脂糖块，使其固定在托盘底部。注意勿使解剖刀片直接接触胶水。</li>
	<li>室温下静置5分钟，使胶水完全固化。</li>
</ol>
6. 包埋后脑组织的切片（图1，步骤6）
<ol>
	<li>用HBSS填充振动切片机托盘。</li>
	<li>定义振动切片机刀片的起始和终止位置。</li>
	<li>制备200–250 µm的切片。使用VT1000s振动切片机时，设置以下参数：速度2–4，频率8。</li>
	<li>小心地将切好的脑片从振动切片机中取出。使用刮铲和镊子尾端将脑片转移至盛有完全HBSS的12孔板中。也可使用画笔进行转移 取而代之 镊子。 关键点： 转移过程中，注意保持脑切片附着在周围的琼脂糖上。</li>
</ol>
7. 切片的 Syto11 染色（图 1，步骤 7）
<ol>
	<li>将Syto11用添加了生长因子的脑片培养基稀释至终浓度为0.5 - 1 µM。</li>
	<li>在12孔板的一个孔中，加入来自一个脑组织的脑片，并加入2.5 ml染色液，在37 °C下孵育1小时。</li>
	<li>用2.5 ml不含染色液的脑片培养基洗涤脑片，孵育20分钟。</li>
</ol>
8. 将切片装载至玻璃底培养皿中（图1，步骤8、9）
<ol>
	<li>每片准备 15 µl 包埋用胶原蛋白溶液。通过将 375 µl 浓度为 3 mg/ml 的 I 型胶原蛋白溶液与 75 µl 10x DMEM、9.4 µl 1 M NaOH 以及 290 µl H2O 混合，配制终浓度为 1.5 mg/ml 的胶原蛋白溶液。置于冰上保存。</li>
	<li>在 35 mm 玻璃底微孔培养皿底部滴加 15 µl 胶原蛋白溶液，用移液器吸头将其铺展至与脑片大小相匹配。</li>
	<li>使用刮铲和镊子将脑片转移至胶原蛋白液滴中。关键点： 在不同培养皿中同时固定多个脑片可提高获得适合成像脑片的概率。在“&#34;代表性结果&#34;”部分所述标准的基础上，筛选并选择最符合要求的脑片。</li>
	<li>将脑片在室温下孵育 10 分钟后，转移至含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中。</li>
	<li>20 分钟后，向玻璃底微孔培养皿中加入 1.2 ml 脑片培养基。每次加入 600 µl 培养基，并用移液器吸头将其铺匀。</li>
	<li>拍摄脑片的低倍镜图像，以记录其解剖学层面及完整性。</li>
</ol>
9. 脑片的活体成像（图1，步骤10、11）
<ol>
	<li>将切片置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育至少1小时30分钟，使其恢复2 活体成像前</li>
	<li>使用选择的显微镜对切片进行成像时需注意，Syto11 极易发生光漂白。此处采用倒置转盘共聚焦显微镜（Andor XD revolution spinning disk confocal microscope）；也可选用激光扫描共聚焦显微镜。以下参数适用于转盘共聚焦显微镜的设置。</li>
	<li>在整个活体成像过程中，将脑片维持在37 °C、5% CO₂条件下2 在连接于显微镜的加湿培养室中。</li>
	<li>使用60倍硅油物镜（工作距离300 µm，数值孔径1.3）对细胞进行成像（示例见 图3B、3C、3E、3F、4A、4B）。使用工作距离为130 µm、数值孔径为1.4的100倍油镜物镜（例如参见 图4C也可使用其他设备。相机的分辨率为 512 x 512。</li>
	<li>在30 µm的z轴堆栈中对细胞成像，z轴堆栈的中心位于脑片表面下方约40 µm处。尝试对组织更深层成像可能导致物镜对脑片施加机械压力，从而影响脑片的完整性。若计划对细胞进行三维重建，请使用不超过2 µm的z轴步进间隔。</li>
	<li>调整激光功率和曝光时间以限制光漂白。根据Syto11信号的强度，使用30至200毫秒的曝光时间。</li>
	<li>使用电动载物台，在一个培养皿中的多个切片上成像多个位置。例如，在一个培养皿内的4个不同切片上，对多达20个不同位置进行成像。</li>
	<li>对于活体成像，应使用低于5分钟的时间分辨率，以识别有丝分裂的不同阶段。使用Syto11和/或组蛋白H2B-EGFP，进行4至5小时的活体成像即可观察到足够数量的有丝分裂细胞。然而，若对标记稀疏的有丝分裂细胞进行成像（例如通过以下方法获得的细胞） 在子宫内 电穿孔后，采用较长的成像时间参数（过夜）是合适的，并且效果良好。 
	注意：使用本方案时，我们通常在每个位置平均观察到10个有丝分裂细胞。如上所述，对多个切片进行成像可提高实验成功的概率。采用该方法时，我们在几乎所有使用Syto11或组蛋白H2B-EGFP进行的实验中均能检测到有丝分裂细胞。</li>
</ol>
10. 有丝分裂的采集后分析（图2）
本节中的所有步骤均在 Fiji（ImageJ）中进行了优化，使用该软件的优势在于其为免费的开源软件。其他可用于执行相同任务的软件还包括 Metamorph、Imaris 和 Amira。
<ol>
	<li>在 Fiji 中识别有丝分裂图像
	<ol>
		<li>将一个位置的数据集作为&#34;超堆栈&#34;打开后，选择一个 z 平面（参见图 2A中滚动条的位置），使组织和细胞看起来状态良好（判断标准见讨论部分）。沿时间维度滚动，识别处于后期的细胞，因为后期是最容易辨认的有丝分裂阶段。</li>
		<li>回退时间轴，确定细胞进入有丝分裂（DNA 凝聚）的时间点。细胞可能在不同 z 平面间移动，但此前描述的时间分辨率和 z 堆栈参数已优化，可支持此过程。</li>
		<li>在电子表格中记录该细胞在超堆栈中进入有丝分裂时的四维坐标（X, Y, Z 和时间，参见图 2A以了解这些参数在 Fiji 界面中的位置）。记录这些坐标可避免重复计数同一细胞。</li>
		<li>向前滚动时间轴，记录细胞从一个阶段进入下一阶段的时间点。记录单个细胞每个有丝分裂阶段的持续时间。</li>
		<li>继续分析其他细胞，覆盖整个数据集（包括多个位置内的多个细胞）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞的三维重建及中期旋转角度的定量分析（改编自 Haydar et al, 2003）（图 2B）。
	<ol>
		<li>在识别出多个有丝分裂细胞后，利用某一细胞的坐标，向前滚动时间轴，直至中期开始。</li>
		<li>旋转整个&#34;超堆栈&#34;，使脑室边界呈平面状（使用&#34;图像/变换/旋转…"命令）。使用&#34;角度&#34;工具确定所需旋转的角度。</li>
		<li>确定目标细胞最清晰可见的 z 平面。在该平面中，使用&#34;矩形选区&#34;工具绘制包含整个细胞的选区。</li>
		<li>确定包含目标细胞的所有 z 平面。使用&#34;图像/复制&#34;命令创建一个&#34;子堆栈&#34;。在弹出的对话框中，保持&#34;复制超堆栈&#34;选项被选中。&#34;切片 (z)&#34;参数对应包含整个细胞的 z 平面范围，&#34;帧 (t)&#34;参数对应当前时间点。</li>
		<li>若分辨率较低，可使用&#34;图像/调整/大小…"命令增大&#34;子堆栈&#34;的尺寸。</li>
		<li>使用&#34;图像/堆栈/3D 投影…"命令在当前时间点生成细胞的三维重建。该命令的参数设置见图 2B。&#34;切片间距&#34;对应各 z 平面图像之间的间隔（µm）。重要提示：务必确保子堆栈的物理尺寸（µm）已被正确保留，否则 z 维度的像素插值将出错，导致三维重建不准确。</li>
		<li>使用滚动条旋转生成的三维重建图像，使中期板的边缘可见。当前帧编号对应于图 3B中描述的 beta 角，记录该编号。使用&#34;角度&#34;工具和&#34;分析/测量…"命令，测量水平方向与垂直平分中期板的直线之间的夹角（图 2B）。该角度即为 alpha 角。</li>
		<li>记录目标细胞在所有中期时间点的这些角度。相邻时间点 (t) 与 (t-1) 之间的旋转角度等于 (t) 时刻角度与 (t-1) 时刻角度之差的绝对值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分裂面方向的测量
	<ol>
		<li>按照中期板三维重建的说明，在后期的某一时间点对目标细胞进行三维重建。</li>
		<li>旋转重建图像，直至可见由分离染色体形成的两个板的边缘。</li>
		<li>使用角度工具测量水平方向（脑室边缘）与平行于分离染色体所形成两个板的直线之间的夹角。该角度即为分裂面角度（图 2C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视频生成
	<ol>
		<li>由于细胞在活体成像过程中常跨越多个 z 平面，需先确定细胞所占据的 z 平面范围。使用&#34;图像/堆栈/Z 投影…"命令对这些 z 平面生成&#34;最大强度投影&#34;。将生成的堆栈保存为&#34;.TIF&#34;文件。</li>
		<li>在 ImageJ 1.45 版本中打开该文件，因为 Fiji 不包含稳定生成&#34;.mov&#34;或&#34;.avi&#34;文件的插件。</li>
		<li>使用 ImageJ 的&#34;文件/另存为/…"命令生成适用于下游应用的视频格式。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们所描述方案的主要优势在于，它能够提供神经前体细胞有丝分裂的动态时间分辨率。通常，可视化发育中脑组织有丝分裂的实验是通过固定组织切片的免疫荧光染色来完成的。但这种方法仅能提供某一时间点的有丝分裂快照。
在脑切片中进行有丝分裂成像时，有几个步骤尤为关键：1）脑切片应始终保持附着在琼脂糖上，以在转移和装片过程中维持脑组织切片的完整性。2）在切片制备与成像过程中，需控制前后（头-尾）方向的切片位置。通常尾侧脑切片效果最佳，因为在这些切片中，放射状胶质细胞（RGC）的基底突起能够保持完整，有利于细胞的健康状态。3）进行活细胞成像时，使用配备60倍物镜的共聚焦转盘显微镜效果最佳，既可实现高分辨率，又能避免Syto11染料引起的光漂白现象。4）活细胞成像时，图像采集的时间参数至关重要。根据所用显微镜设备的不同，可设置每1分钟至每10分钟进行一次时间序列成像。间隔超过10分钟通常过长，难以捕捉有丝分裂的高分辨率动态过程。
该方案确实存在一定的局限性。实验是使用 离体 组织。可以想见，在脑切片中获得的观察结果可能有所不同 ...

本实验方案的总体目标是描述如何在胚胎脑切片中进行神经前体细胞有丝分裂的活体成像。通过在体外培养条件下对脑切片进行活体成像，本方案提供了一种简便的方法，可在高度接近体内环境的条件下，检测神经前体细胞有丝分裂的多个方面 体内 环境。该方法可应用于突变动物的脑组织和/或经过实验干预处理的脑组织 在子宫内 电穿孔1-5该技术还可通过向培养基中添加药理学试剂，简便地检测这些试剂对神经前体细胞有丝分裂的影响。总之，本文将使研究神经发生的研究人员能够更便捷地掌握这一技术上具有挑战性的实验方案。
在神经发生过程中，不同的神经前体细胞群体通过精确的分裂产生神经元，这些神经元最终形成成年新皮层的六层结构6-8。在皮层发育早期，神经前体细胞池通过神经上皮（NE）细胞的对称分裂实现自我更新并扩增。随后，NE细胞转化为放射状胶质细胞（RGCs）。最初，RGCs通过对称分裂产生两个新的RGCs；然而在神经发生的主要阶段，RGCs主要以不对称方式分裂。在不对称分裂中，一个RGC产生一个新的RGC以及一个终末分裂神经元，或一种更特化的前体细胞（包括短神经前体细胞（SNP）、外放射状胶质细胞（ORG）或中间前体细胞（INP）2,3,7,9。INPs、SNPs和ORGS随后分别在皮层的室下区、脑室区和基底部生成神经元。因此，前体细胞的细胞分裂是生成新皮层神经元的基本过程。
大量研究表明，放射状胶质细胞（RGCs）的特定有丝分裂特征与子代细胞的命运之间存在相关性。Haydar et al. 和 Takahashi et al. 发现，随着神经发生过程的推进，RGC 的有丝分裂持续时间及细胞周期长度均有所增加，后续多项研究也证实了这一发现10-13。许多研究提示，有丝分裂纺锤体相对于脑室的取向会影响神经发生和皮层形成的某些方面，分别包括所生成神经元的类型以及子代细胞在脑内的位置3,10,14-16。分裂面取向是否直接决定细胞命运尚存争议，但普遍结论认为，这一有丝分裂参数确实影响神经发生。此外，许多参与有丝分裂机制的基因对神经发生及正常脑发育至关重要，这一观察结果进一步凸显了有丝分裂的重要性17-20。
有丝分裂是一个动态过程，然而迄今为止，大多数详细研究神经前体细胞有丝分裂的研究均依赖于固定组织切片的分析，或通过成像技术观察神经前体细胞 体外 细胞培养。因此，目前主流的有丝分裂评估方法仅能提供该过程的静态图像，无法揭示细胞在组织中的行为。神经前体细胞有丝分裂的活体成像技术正日益成为理解神经前体细胞功能的关键工具。例如，请参见以下参考文献4,8,10,21-25已有多种优秀的实验方案发表，用于脑切片的制备与成像26,27然而迄今为止，尚未有文献描述或以视频形式展示过针对有丝分裂成像与分析的全面实验方案。
与固定脑切片分析相比，该技术具有多项显著优势。对脑切片进行延时分析能够产生大量可灵活分析的数据点。首先，数据可在数分钟至数小时的时间范围内逐个时间点采集。研究者可分析单个时间点（以生成静态图像拼接图），也可将不同时间点组合成动态影像。其次，利用共聚焦成像对切片进行扫描，可在脑切片的不同Z轴层面获取数据。因此，可对单个光学切片进行独立分析；或者，也可将多个光学切片堆叠生成最大强度投影图像。第三，分析是在组织背景下进行的，能够揭示细胞相对于邻近细胞和结构的分裂方式。第四，该方法特别适用于分析那些表现出一定有丝分裂缺陷表型的突变体。综上所述，本实验方案将有助于阐明关键操作步骤，为希望在各自实验室中开展神经前体细胞有丝分裂活体成像的研究人员提供支持。

<table><tbody><tr><td>100X N2</td><td>Life technologies</td><td>17502048</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>50X B27（不含维生素A）</td><td>Life technologies</td><td>12587010</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life technologies</td><td>11320033</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>热灭活马血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1138-500ml</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>热灭活小牛血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>FGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3139-FB-025</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>EGF</td><td></td><td></td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>10X HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14065-056</td><td>用于胚胎解剖</td></tr><tr><td>Hepes游离酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>稀释至1 M（pH 7.4）</td></tr><tr><td>2.5 M D-葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td>用于胚胎解剖</td></tr><tr><td>0.9 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Life technologies</td><td>25080-094</td><td>用于胚胎解剖</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td>用于制备切片</td></tr><tr><td>Syto11</td><td>Life technologies</td><td>S7573</td><td>分装为5&amp;micro;l等份</td></tr><tr><td>3 mg/ml I型胶原酶</td><td>Life technologies</td><td>A1048301</td><td>用于切片培养</td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>用于切片培养</td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td>用于胚胎解剖</td></tr><tr><td>数字温度计</td><td></td><td></td><td>用于测量琼脂糖温度</td></tr><tr><td>刮铲</td><td></td><td></td><td>用于转移脑组织</td></tr><tr><td>画笔</td><td></td><td></td><td>转移脑组织的替代工具</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1000s</td><td>用于制备切片</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td></td><td></td><td>用于胚胎解剖</td></tr><tr><td>成像显微镜</td><td></td><td></td><td>需要配备共聚焦显微镜，并配有孵育腔室</td></tr></tbody></table>

活体成像小鼠胚胎大脑皮层发育过程中的有丝分裂

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

尽管有丝分裂持续时间较短，但它是一个复杂且动态的多步骤过程，对包括大脑在内的器官发育至关重要。在发育中的大脑皮层中，神经前体细胞的有丝分裂异常可导致脑体积和功能的缺陷。因此，迫切需要开发工具以深入理解神经前体细胞有丝分裂的机制。啮齿类动物的皮层发育是研究这一过程的优秀模型。神经前体细胞的有丝分裂通常在固定的脑切片中进行观察。本方案将详细描述一种用于活体成像有丝分裂的方法 离体 胚胎脑切片。我们将描述该实验的关键步骤，包括：脑组织提取、脑组织包埋、振动切片机制备脑切片、切片染色与培养，以及延时成像。随后，我们将演示并详细说明如何进行有丝分裂的图像采集后分析。本实验示例结果使用了活体染料Syto11、转基因小鼠（组蛋白H2B-EGFP和中心粒centrin-EGFP）以及 在子宫内 电穿孔（mCherry-α-tubulin）。我们将讨论如何最优地优化该操作流程，以及如何对其进行修改以研究有丝分裂的遗传调控。在脑切片中对有丝分裂进行活体成像，是一种灵活的方法，可在受控环境中评估年龄、解剖结构和遗传干扰的影响，并以高时间和空间分辨率生成大量数据。因此，本方案将补充现有的神经前体细胞有丝分裂分析工具。

该实验的成功以及在一次活体成像过程中观察到多个有丝分裂细胞，很大程度上取决于切片的完整性和进行图像采集时切片所处的解剖位置。如下文所述，切片的解剖位置是一个重要因素。图3A展示了我们在前后方向（rostral-caudal）和内侧-外侧方向（medial-lateral）上获得最佳结果的位置。有关此主题的进一步讨论，请参见Noctor26。切片的完整性在不同区域可能存在差异，这可在开始延时成像前通过观察整个切片（如步骤7.6所述）进行判断。在E13.5胚胎脑组织的良好区域中，可观察到以下特征：在脑室边缘可发现大量有丝分裂细胞，间期细胞核呈椭圆形而非圆形，且相对于脑室边缘呈柱状排列。而在质量较差的脑组织区域中，细胞核则呈现圆形且排列略显紊乱（比较图3B与图3C，并参见图3D中一张切片状态良好的示意图）。
当达到理想条件时，该实验可实现对有丝分裂不同阶段的定性鉴定。这些阶段可通过DNA模式的分析来识别（见图3E</...

神经前体细胞的有丝分裂是神经发生过程中的一个关键参数。目前对神经前体细胞有丝分裂的大部分认识主要基于对固定组织的分析。在胚胎脑切片中进行活体成像是一种多功能的技术，可在受控环境中以高时间和空间分辨率评估有丝分裂过程。

尽管持续时间短暂，有丝分裂却是一个复杂而动态的多步骤过程，对包括大脑在内的器官发育至关重要。在……

本实验的总体目标是对活体小鼠脑切片中的神经前体细胞有丝分裂进行成像与分析。首先从胚胎中解剖出脑组织，第二步是使用振动切片机制备脑切片。接下来，对脑切片进行活体成像。最后一步是从视频中提取信息，以分析感兴趣的有丝分裂参数。最终，通过延时显微镜技术展示脑内前体细胞群体如何实时分裂。与现有方法（如固定组织分析）相比，该技术的主要优势在于能够深入洞察活体脑片中神经前体细胞分裂的时间动态。该方法还可用于研究基因扰动如何影响神经前体细胞的分裂。尽管我们使用该方法来探究大脑皮层的发育过程，但所描述的分析方法也可应用于其他脑区甚至脑外干细胞有丝分裂的研究。本实验操作将由我实验室的博士后研究员 Louis y 演示。首先收集小鼠胚胎，并解剖出包括后脑和具有两个大脑半球的前脑在内的胚胎脑组织。在装有冰块的容器中，为包埋模具在冰上凿出放置孔洞。接下来，将3% aros培养基倒入塑料模具中，并将该模具放入冰块的孔洞内。用数字温度计的探针搅拌aros培养基，直至温度降至35摄氏度。随后立即将脑组织转移至包埋介质中，以去除脑组织与aros界面处多余的HBSS。在包埋液中仔细而轻柔地反复旋转大脑。用镊子操作时，接触冰面的模具底部会形成一层凝胶状的琼脂垫。当搅拌大脑时能用镊子尖端感觉到该垫层的存在，此时应将大脑背侧朝上放置，大脑不应沉至模具的最底部。将琼脂块在冰上放置至少五分钟使其硬化，然后用剃刀片切割模具的角落。小心地在脑组织周围雕刻出琼脂块，尽量减少切割次数，以避免扰动包埋的脑组织。使用VT 1000 s Viome切出200至250微米的切片。现在将细胞色素11用添加了生长因子的切片培养基稀释至终浓度为0.5至1微摩尔，并将一个脑组织的切片放入12孔板中，每孔加入2.5毫升染色液，于37摄氏度孵育1小时。随后用不含染色液的切片培养基每孔2.5毫升洗涤切片20分钟。为贴附脑组织切片，取一滴胶原溶液置于35毫米玻璃底微孔培养皿底部。用移液枪枪头将其铺展，使其大小与切片匹配。然后将一片组织转移至一滴胶原蛋白液滴中。让切片在室温下孵育10分钟，随后将其转移至37°C、含5%二氧化碳的培养箱中。在室温下静置20分钟后，将总共1.2毫升的脑片培养基分次加入玻璃底小培养皿中，每次加入600微升，并用移液器枪头将培养基铺匀。将脑片置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中恢复至少1小时30分钟，然后在相同条件下转移至转盘共聚焦显微镜的培养腔中进行活体成像。进行活体成像时，使用60倍硅油物镜，工作距离为300微米，数值孔径为1.3。进行细胞成像时，采集以Z轴中心位于切片表面下约40微米处、总厚度为30微米的Z轴层扫图像。如有必要，调整激光功率和曝光时间以减少光漂白，并根据Cyto 11信号的强度，将曝光时间设置在30至200毫秒之间。以下是通过该分析可获得的代表性数据，可用于在图像J中识别有丝分裂相。打

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