活体成像小鼠胚胎大脑皮层发育过程中的有丝分裂

本实验的总体目标是对活体小鼠脑切片中的神经前体细胞有丝分裂进行成像与分析。首先从胚胎中解剖出脑组织，第二步是使用振动切片机制备脑切片。

接下来，对脑切片进行活体成像。最后一步是从视频中提取信息，以分析感兴趣的有丝分裂参数。最终，通过延时显微镜技术展示脑内前体细胞群体如何实时分裂。

与现有方法（如固定组织分析）相比，该技术的主要优势在于能够深入洞察活体脑片中神经前体细胞分裂的时间动态。该方法还可用于研究基因扰动如何影响神经前体细胞的分裂。尽管我们使用该方法来探究大脑皮层的发育过程，但所描述的分析方法也可应用于其他脑区甚至脑外干细胞有丝分裂的研究。

本实验操作将由我实验室的博士后研究员 Louis y 演示。首先收集小鼠胚胎，并解剖出包括后脑和具有两个大脑半球的前脑在内的胚胎脑组织。在装有冰块的容器中，为包埋模具在冰上凿出放置孔洞。

接下来，将3% aros培养基倒入塑料模具中，并将该模具放入冰块的孔洞内。用数字温度计的探针搅拌aros培养基，直至温度降至35摄氏度。随后立即将脑组织转移至包埋介质中，以去除脑组织与aros界面处多余的HBSS。

在包埋液中仔细而轻柔地反复旋转大脑。用镊子操作时，接触冰面的模具底部会形成一层凝胶状的琼脂垫。当搅拌大脑时能用镊子尖端感觉到该垫层的存在，此时应将大脑背侧朝上放置，大脑不应沉至模具的最底部。

将琼脂块在冰上放置至少五分钟使其硬化，然后用剃刀片切割模具的角落。小心地在脑组织周围雕刻出琼脂块，尽量减少切割次数，以避免扰动包埋的脑组织。使用VT 1000 s Viome切出200至250微米的切片。

现在将细胞色素11用添加了生长因子的切片培养基稀释至终浓度为0.5至1微摩尔，并将一个脑组织的切片放入12孔板中，每孔加入2.5毫升染色液，于37摄氏度孵育1小时。随后用不含染色液的切片培养基每孔2.5毫升洗涤切片20分钟。为贴附脑组织切片，取一滴胶原溶液置于35毫米玻璃底微孔培养皿底部。

用移液枪枪头将其铺展，使其大小与切片匹配。然后将一片组织转移至一滴胶原蛋白液滴中。让切片在室温下孵育10分钟，随后将其转移至37°C、含5%二氧化碳的培养箱中。

在室温下静置20分钟后，将总共1.2毫升的脑片培养基分次加入玻璃底小培养皿中，每次加入600微升，并用移液器枪头将培养基铺匀。将脑片置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中恢复至少1小时30分钟，然后在相同条件下转移至转盘共聚焦显微镜的培养腔中进行活体成像。进行活体成像时，使用60倍硅油物镜，工作距离为300微米，数值孔径为1.3。

进行细胞成像时，采集以Z轴中心位于切片表面下约40微米处、总厚度为30微米的Z轴层扫图像。如有必要，调整激光功率和曝光时间以减少光漂白，并根据Cyto 11信号的强度，将曝光时间设置在30至200毫秒之间。以下是通过该分析可获得的代表性数据，可用于在图像J中识别有丝分裂相。打开某一位置的图像数据集作为多通道Z轴层扫图像后，选择一个Z平面，其中组织和细胞形态看起来健康。

回溯时间以确定细胞进入有丝分裂的时间点。细胞可能在Z平面上发生移动，但此前描述的时间分辨率和Zack参数已针对此过程进行了优化。在电子表格中记录细胞进入有丝分裂时在超堆栈中的四个D坐标。

了解这些坐标可避免重复计数同一个细胞。向前滚动时间，记录细胞从一个时期进入下一个时期的时刻。记录单个细胞每个有丝分裂时期的持续时间，以进行细胞的三维重建以及中期旋转角度的定量分析。

在鉴定出多个有丝分裂细胞后，利用细胞的坐标向前滚动时间轴直至起始点。在中期，旋转整个超堆栈，使室管膜边界呈平面状。使用角度工具确定执行此旋转所需的角度。

确定目标细胞在该平面中最为清晰可见的Z平面。使用矩形选择工具绘制一个包含整个细胞的选择区域。然后确定包含目标细胞的Z平面，并使用图像复制命令创建一个子堆栈。

在对话框中，保留勾选的重复超堆栈切片。Z 参数对应 Z 平面，包含整个细胞，而帧的 T 参数对应当前时间点。之后，生成细胞的三维重建图像。

在当前时间点，切片间距对应于各Z平面图像之间的间隔，单位为微米。使用滚动条旋转生成的三维重建图像，使中期板的边缘可见。

帧的编号对应于 beta 角。记录此编号。然后测量水平线与 align bys 之间的角度。

垂直于中期板进行切割。这是角度 alpha 的记录。该细胞在所有中期时间点的相应角度。

时间点 t 与 t 减一之间的旋转角度等于 t 时刻与 t 减一时刻沿背腹轴的角度之差的绝对值。在脑切片的背侧区域，有丝分裂最容易成像，因为放射状胶质细胞（R GCs）的基底突起较短，因此被振动切片机切断的可能性较小。沿 ROS coddle 轴，在背侧皮层的 coddle 区域进行切片可获得最一致的结果。

以下是用于成像的良好区域与不良区域的示例。在良好区域中，细胞核呈椭圆形，且在延时成像前可在脑室边界观察到大量有丝分裂细胞；而在不良区域中，脑室边界处几乎观察不到有丝分裂细胞，且细胞核呈圆形。

以下是在活体成像前使用低倍显微镜观察到的一个优质脑片示例，以及一些处于有丝分裂不同阶段的 cyto 11 标记细胞的实例。此处展示的是 ventricle 边界区域的拼接图像，其中两个神经前体细胞在本实验流程下经历有丝分裂的不同阶段，并以不同颜色标记。此外，还可采用其他方法（如中性电穿孔导入 DNA 构建体）来回答更多科学问题，例如：分裂细胞的命运如何？细胞骨架的行为有何变化？

此外，最好使用除CY 11之外的其他方法来追踪有丝分裂，例如H2B-GFP转基因小鼠。观看本视频后，您应能很好地掌握如何操作脑切片、选择最佳匹配参数以及如何分析数据。