生物能量和氧化突发:协议用于人类白细胞和血小板的隔离与评价

在以下方案中，将演示人血单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血小板的生物能量谱和氧化爆发反应的测量。这是通过首先从新鲜抽取的血液中收集富含血沉棕黄层和血小板的血浆组分来实现的。作为第二步，异质性白细胞群通过密度梯度分为单核细胞层和多形核细胞层。

接下来，通过 MAX 分离进一步分离纯单核细胞中性粒细胞和淋巴细胞群，然后接种用于细胞外通量或 XF 分析。最终，XF 技术可以测量单核细胞、淋巴细胞和血小板中线粒体功能的灵敏和可重复的测量，以及单核细胞和中性粒细胞耗氧率的氧化爆发。我们今天要向您展示的技术的优势在于，您可以从少量血液样本中制备患者血液中的所有主要细胞。

这些是纯灭活形式的血小板和白细胞，并测量它们的线粒体功能。我们认为，这可以实时反映患者体内的各种疾病和状态。这种方法可以帮助回答有关新陈代谢的关键问题，例如生活方式、饮食和病理压力对线粒体功能的作用。

该方案结合了多种技术，用于分离和测定各种白细胞群和血小板中的细胞生物能量学。该方案的这一步非常关键，因为密度梯度和磁性分离需要精确的移液。此外，您需要了解细胞群在分级分离过程中的位置。

我们将在 24 孔细胞外通量分析仪或 XF 24 上演示外周血细胞的分离和细胞生物能量学的分析。但是，此方法也可以在 XF 96 上执行，至少在开始手术前两个小时进行。用 XF cran 溶液水合 XF 传感器探针盒

带有摆动吊篮转子的离心机中，以 500 倍 G 和室温离心新鲜提取的全血 15 分钟。使用移液管去除含有富血小板血浆的顶层，直到红细胞血沉棕黄层上方残留一厘米血浆，并将血浆在室温下放在一边以备后用。然后将 Buffy 外套转移到无菌的 50 毫升锥形管中，并将白细胞稀释至 24 毫升。

接下来使用基础 RPMI，将 3 毫升低密度，即不透明的 1.077 添加到三个 15 毫升锥形管中。然后将 5 mL 窄移液管的尖端放入每支试管的底部。依次缓慢释放出 3 毫升的高密度，他的不透明 1.119。

现在，在低功率设置下使用自动移液器，小心地将 8 mL 稀释的血液添加到每个梯度中，而不会干扰各层。蓝色染料已添加到低密度梯度中，用于可视化所有梯度层。通过分别离心分离细胞后，用无菌玻璃移液器收集单核细胞和多形核细胞，而不会干扰其他细胞条带。

将每管中的单核细胞和多形核细胞群汇集到每种细胞类型的单个无菌 50 毫升锥形管中，并向两个管中加入 4 体积的 RPMI。离心后，细胞将沉淀转移到 1.5 毫升试管中，重新沉淀并重悬于 80 微升补充有 BSA 的新鲜 RPMI 中。然后分别向单核细胞组分和多形核细胞组分中加入 20 微升磁珠标记的抗 CD 14 和抗 CD 15 抗体。

将每个细胞悬液在 4 摄氏度下孵育 15 分钟，然后用 1 毫升 R-P-M-I-B-S-A 培养基洗涤每个试管，将沉淀重悬于 500 微升 R-P-M-I-B-S-A 中。然后将细胞悬液涂在单个 R-P-M-I-B-S-A 洗涤的 LS 柱上，并用 3 毫升 R-P-M-I-B-S-A 培养基将细胞悬液和柱清洗液收集到无菌管中以分离单核细胞和嗜中性粒细胞，在最后一次洗涤后将柱从磁场中取出，并将阳性选择的细胞洗脱到装有 5 毫升 R-P-M-I-B-S-A 的无菌管中。为了分离淋巴细胞，将流经细胞柱洗涤组分的沉淀，将细胞沉淀重悬于 80 微升 R-P-M-I-B-S-A 中，并将细胞在 20 微升 CD 61 和 CD 2 35 A 抗体中在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。

然后像以前一样重复最大分离，收集含有淋巴细胞的流过以分离血小板，离心，保留的富含血小板的血浆，然后去除血浆并用 5 毫升无菌 PBS 洗涤细胞沉淀一次，补充每毫升前列腺素 I 1 微克，将血小板沉淀重悬于 1 毫升新鲜 PBS 前列腺素 I 2 缓冲液中，以接种分离的单核细胞， 淋巴细胞、中性粒细胞和血小板。首先对细胞进行计数，并在 XF 分析培养基中使其达到适当的体积，以允许 2.5 乘以 10 倍/孔的 200 μL 体积接种第五个细胞。在包被细胞 T 的 24 孔 XF 细胞培养微孔板中，血小板接种 2.5 倍 10 至 7 个细胞，体积为 200 μL 体积。

将细胞离心到板上后，用 XF 培养基使最终孔体积达到 660 μL，并在 XF 分析前将板在 37°C 下孵育 30 分钟，在孵育负荷期间，按所列顺序将 75 μL 分析试剂放入 XF 传感器卡板进样口。如果要获得氧化爆发测量值，可以在抗霉素后注射 PMA，随后的注射口加载将小柱放在细胞外通量分析仪上以开始测定。白细胞和血小板的生物能量谱可以使用 seahorse XF 细胞外通量分析仪测定，该分析仪以无创方式测量细胞中的实时耗氧量。

将每种细胞类型接种在 XF 24 微孔板上，重复 5 次，如表所示。在测定过程中测量的代表性基础和氧化爆发值以及每孔的平均蛋白质浓度由细胞类型证明 氧消耗率值被归一化为相应孔中的总蛋白质含量，并表示为每分钟每微克蛋白质的 p 摩尔。然后通过前三次测量确定基础耗氧率。

寡霉素是一种线粒体 A TP 合酶抑制剂，被注射到 XF 培养基中以估计与 TP 合成偶联的耗氧率，并表示为与残余耗氧率减去非线粒体耗氧率相关的 TP，可归因于质子泄漏。添加解偶联 FCCP 可以确定最大耗氧率，然后注射抗霉素 a 和线粒体呼吸抑制剂以测量非线粒体耗氧来源。储备容量是线粒体在能量需求增加的情况下可以执行的额外功量的量度，可以计算为最大呼吸速率与基础呼吸速率之间的差值，以确定单核细胞和中性粒细胞的氧化爆发能力。

注射 P-M-A-A-P-K-C 激动剂，耗氧率的增加与 N-A-D-P-H 氧化酶产生的氧化剂有关一旦掌握，这项技术可以在采血后短短三小时内完成，如果作得当，不包括检测本身。在尝试此程序时，通过在生物安全柜中执行每个步骤并使用无菌室温缓冲液和培养基来保持无菌条件非常重要。按照此程序，我们可以进行其他协议，例如传真分析，以确定细胞的纯度、白细胞的激活状态，以及确定白细胞亚群中的细胞生物能量学。

看完这个视频后，您现在应该对如何制备血小板、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞，并将它们放入海马中，并从这些数据中测量氧化爆发和线粒体功能有一个相当清晰的了解。然后，您可以分析患者群体并确定他们的生物能量学如何实时变化。不要忘记，处理人类患者样本可能非常危险。

因此，在此过程中，您需要佩戴个人防护设备并使用生物安全柜。