Name: 生物能量和氧化突发:协议用于人类白细胞和血小板的隔离与评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-27T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 了解人类白细胞和血小板分离与评价方法，用于测量线粒体功能和氧化爆发反应。该技术通过密度梯度离心和磁珠分离实现细胞纯化，结合XF技术实时评估生物能量健康状态。

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作者谨此感谢 Gloria A Benavides 提供的技术支持。本工作由美国心脏协会 13PRE16390001（SR）、NIH T32HL07918（PAK）、NIH T32HL007457（TM）、P30DK056336（BKC）、NIDDK 糖尿病并发症联盟（DiaComp，www.diacomp.org）资助项目 DK076169（子项目 VDU）以及 O'Brien 中心 P30 DK079337（VDU）提供支持。

本手稿中所述的血液采集、分离和分析的所有方案均已通过阿拉巴马大学伯明翰分校机构审查委员会的审核和批准。
1. 细胞分离（改良自 Sigma-Aldrich Histopaque 方案编号 1119 及 Miltenyi Biotec MicroBead 阳性和阴性筛选方案）
<ol>
	<li>将采集于ACD或EDTA管中的全血在500 × g离心15分钟&#160;在带有摆桶转子的离心机中（加速度 = 5-6，不使用刹车）。</li>
	<li>用移液管移除含有血小板富集血浆（PRP）的上层液体，保留约1 cm高于细胞层（红细胞/白细胞层）的部分。将PRP置于室温下暂存，以备后续处理。</li>
	<li>将血沉棕黄层转移至无菌的50 ml锥形管中，用基础RPMI稀释至24 ml，或至少稀释至初始血沉棕黄层体积的4倍以上。 
	注意：可能需要包含红细胞层的上半部分，但这将导致RPMI体积相应增加。</li>
	<li>使用低密度Ficoll（比重1.077，记为1077）作为上层，高密度Ficoll（比重1.119，记为1119）作为下层，在三根15 ml圆锥形离心管中（每管3 ml）制备密度梯度。首先，向每根离心管中加入1077。然后使用5 ml窄口移液器，将移液器吸头置于1077液层下方，缓慢加入1119至管底，避免与上层梯度混合。此时每管中应共有6 ml密度梯度液，且在3 ml刻度处可见明显的分相界面。</li>
	<li>使用自动移液器，将8 ml稀释后的血液（来自步骤1.3）缓慢加入每根密度梯度管中，移液器应调至低速模式，以避免扰动梯度层。此步骤的总体积应为14 ml。</li>
	<li>在室温下以 700 × g 离心 30 分钟（加速度设为 6，不启用刹车）。 
	注意：在此阶段，应可见三个不同的细胞层带（图1A最上层（介于1077和血浆之间）含有单个核细胞（MNCs）和血小板，中间层（介于1007和1119之间）含有多形核细胞（PMNs），下层（低于1119）含有红细胞（RBCs）。</li>
	<li>使用无菌玻璃移液管分别收集单个核细胞（MNC）和多形核细胞（PMN），注意不要扰动其他细胞层。将每根离心管中的MNC合并至一个无菌的50 ml锥形管中。同样，将PMN群体也进行合并。</li>
	<li>向分别含有单个核细胞（MNC）和多形核细胞（PMN）组分的每支试管中加入4倍体积的RPMI，以稀释密度梯度。</li>
	<li>在室温下以 700 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将单个核细胞（MNC）和多形核细胞（PMN）的细胞沉淀分别重悬于1 ml含0.5%超纯无脂肪酸BSA的RPMI培养基（RPMI-BSA）中，并转移至无菌的1.5 ml离心管中。&#160;使用台式小型离心机以30秒离心沉淀细胞。</li>
	<li>弃去上清液，将每份细胞沉淀重悬于 80 µl RPMI-BSA 中。</li>
	<li>向含有单个核细胞组分的试管中加入20 µl磁珠标记的抗CD14抗体，用于单核细胞的阳性筛选。&#160;对于含有PMN细胞组分的试管，加入20 µl磁珠标记的抗CD15抗体，用于中性粒细胞的阳性筛选。&#160;将每种细胞悬液在 4 ºC 下孵育 15 分钟。</li>
	<li>用1 ml RPMI-BSA培养基洗涤每份细胞悬液，离心收集细胞沉淀，操作同前，再将每份沉淀重悬于500 µl RPMI-BSA中。</li>
	<li>标记的细胞在磁性激活细胞分选（MACS）分选仪的磁场中被分离。在添加细胞悬液之前，通过将MACS LS柱（每种细胞悬液使用一柱）置于MACS分选仪上，并用3 ml RPMI-BSA冲洗，以完成柱的预处理。</li>
	<li>加入细胞悬液后，用 3 ml RPMI-BSA 培养基洗涤每根柱子 3 次（每次洗涤之间确保培养基完全流尽）。收集细胞悬液的穿流液及柱子的洗涤液至无菌离心管中。</li>
	<li>分离单核细胞和中性粒细胞， 从磁铁上取下柱子，最后一次洗涤后，用柱塞将阳性选择的细胞洗脱到含有5 ml RPMI-BSA的无菌离心管中。</li>
	<li>分离淋巴细胞 以300 × g离心步骤1.15中获得的MNCs流穿洗涤组分10分钟，沉淀细胞。&#160;弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 80 µl 中&#160;RPMI-BSA。加入20 µl CD61和CD235a抗体，将细胞悬液孵育15分钟&#160;在 4 ºC 下。&#160;重复之前的MACS分离步骤，收集流穿部分，其中含有淋巴细胞。</li>
	<li>为沉淀单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞组分，按前述步骤离心（步骤1.9），弃去上清液。&#160;细胞沉淀应重悬于1 ml细胞外通量培养基（XF-DMEM）中进行计数。 
	注意：8 ml 全血应获得 1-5 x 106 单核细胞/毫升，以及 5-20 × 106 淋巴细胞和中性粒细胞/毫升</li>
	<li>分离血小板，将PRP（步骤1.2）在室温下以1,500 × g离心8–10分钟。弃去上清血浆，用5 ml无菌PBS（含1 µg/ml PGI）重悬细胞沉淀并洗涤一次2，重新离心并用1 ml PBS-PGI重悬最终沉淀2 缓冲液</li>
	<li>通过浊度法测定血小板在PBS-PGI中悬浮后的血小板计数2 使用分光光度计按照 Walkowiak 所述方法测定缓冲液 等 使用以下公式：[6.23/(2.016 – Abs800)] – 3.09 × 稀释倍数 = # × 108&#160;血小板/毫升&#160;12.</li>
</ol>
2. 细胞接种
<ol>
	<li>细胞粘附剂（Cell-Tak）的制备：&#160; 将90 µl细胞粘附剂加入180 µl二水合物（diH20）、540 µl 0.1 N碳酸氢钠（pH 8.0）中，并使用1 N NaOH调节pH至7.2–7.8。用制备好的细胞粘附剂对XF板（24孔，V7微孔板）进行包被，每孔加入30 µl。 
	注意：&#160; 细胞粘附剂应每次使用前新鲜配制。</li>
	<li>将板在37 ºC孵育20–30分钟，然后吸除细胞粘附剂，并用PBS洗涤孔板两次（每次1 ml/孔）。</li>
	<li>对分离得到的单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血小板进行细胞计数，并使用XF-DMEM调整至适当体积，使单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的接种密度为250k&#160;个细胞/孔，血小板为25 × 106/孔。或者，若需检测氧化爆发反应，中性粒细胞可接种为125k&#160;个细胞/孔。每种细胞悬液的最终接种体积应为200 µl/孔。</li>
	<li>以200 × g离心1秒，不启用刹车。将板旋转180˚后，再次以300 × g离心，不启用刹车。</li>
	<li>用XF-DMEM将每孔终体积补至660 µl，并在XF检测前于37 ºC孵育30分钟。注意：可在检测前后拍摄贴壁细胞的显微照片，以确认贴壁充分并排除细胞脱落现象。</li>
</ol>
3. 24孔细胞外通量测定板（XF24）的制备
<ol>
	<li>在进行检测前至少2小时，使用校准液水化XF探针。</li>
	<li>在XF-DMEM培养基中配制10倍浓度的储备液：0.5 µg/ml寡霉素、0.6 µM FCCP和10 µM抗霉素A，并按上述顺序将每种储备液75 µl加入到检测板加样孔中。若需检测氧化爆发，可在抗霉素A之后加入100 ng/ml PMA的10倍储备液。</li>
	<li>对已水化并加样的检测板进行校准，并执行XF检测。有关氧气消耗和pH变化的详细分析与解读方法已在先前发表的研究中描述9,13,14，此处不再详述。</li>
	<li>完成XF检测后，吸除检测孔中除最后50 µl以外的所有XF-DMEM，以防止细胞从培养板中丢失；随后加入50 µl RIPA细胞裂解缓冲液，并进行蛋白定量检测以用于数据标准化。</li>
</ol>

<ol><li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+cognitive+impairment%2C+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease.</a> Int. J. Alzheimer's Dis. 2009, (2009).</li>
<li>Jin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%2C+mitochondrial+quality+control%2C+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy, mitochondrial quality control, and oncogenesis.</a> Autophagy. 2, 80-84 (2006).</li>
<li>Cordero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+mitophagy+activation+in+blood+mononuclear+cells+of+fibromyalgia+patients%3A+implications+in+the+pathogenesis+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and mitophagy activation in blood mononuclear cells of fibromyalgia patients: implications in the pathogenesis of the disease.</a> Arthritis Res. Ther. 12, R17(2010).</li>
<li>Japiassu, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+failure+of+human+peripheral+blood+monocytes+in+patients+with+septic+shock+is+mediated+by+reduced+F1Fo+adenosine-5%27-triphosphate+synthase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Med%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic failure of human peripheral blood monocytes in patients with septic shock is mediated by reduced F1Fo adenosine-5'-triphosphate synthase activity.</a> Crit. Med. 39, 1056-1063 (2011).</li>
<li>Widlansky, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+mitochondrial+membrane+potential%2C+mass%2C+and+morphology+in+the+mononuclear+cells+of+humans+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Res%22%5BJournal%5D)">Altered mitochondrial membrane potential, mass, and morphology in the mononuclear cells of humans with type 2 diabetes.</a> Transl. Res. 156, 15-25 (2010).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ageing+and+Alzheimer%27s+disease+on+mitochondrial+function+of+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Effects of ageing and Alzheimer's disease on mitochondrial function of human platelets.</a> Exp. Gerontol. 43, 589-594 (2008).</li>
<li>Avila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+mitochondrial+dysfunction+is+evident+in+type+2+diabetes+in+association+with+modifications+of+mitochondrial+anti-oxidant+stress+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Clin.+Endocrinol.+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120, 248-251 (2012).</li>
<li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets%2C+lymphocytes%2C+monocytes%2C+and+neutrophils%2C+and+the+oxidative+burst+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab. Invest. 93, 690-700 (2013).</li>
<li>Hill, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cellular+bioenergetics+with+mitochondrial+quality+control+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy.</a> Biol. Chem. 393, 1485-1512 (2012).</li>
<li>Hultqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+autoimmunity%2C+arthritis%2C+and+encephalomyelitis+in+mice+with+a+reduced+oxidative+burst+due+to+a+mutation+in+the+Ncf1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Enhanced autoimmunity, arthritis, and encephalomyelitis in mice with a reduced oxidative burst due to a mutation in the Ncf1 gene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12646-12651 (2004).</li>
<li>Rosa-Borges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency+with+recurrent+infections%3A+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ped%22%5BJournal%5D)">Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency with recurrent infections: case report.</a> J. Ped. 77, 331-336 (2001).</li>
<li>Walkowiak, B., Kesy, A., Michalec, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+reader--a+convenient+tool+in+studies+of+blood+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">Microplate reader--a convenient tool in studies of blood coagulation.</a> Thromb. Res. 87, 95-103 (1997).</li>
<li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radic. Biol. Med. 51, 1621-1635 (2011).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp.. (46), e2511(2010).</li>
</ol>

VDU&#160;是Seahorse Bioscience&#160;科学咨询委员会的成员。

本方案整合了多种常用于血液细胞分离的技术，适用于能量代谢分析。所述连续操作技术相较于其他分离方法具有优势即 FACs 分析）能够以受控的培养基条件分离出大量细胞，并使分离细胞所受的应激最小化。其缺点是即使极少中断，分离过程仍较为耗时。本方案为人源原代血细胞的分离提供了基础，可进一步拓展应用于临床环境及转化医学研究。
MACS 分离是一种可靠的细胞分离技术，能够直接从全血中分离细胞；然而，该方法需要使用更多的抗体，且对于本方法中所述的四种不同细胞类型的分离并非均能达到最佳效果。目前尚无证据表明，采用我们的分离方案通过 MACS 分离对白细胞进行阳性筛选会导致细胞活化。MACS 柱通过使用与 50 nm 超顺磁性颗粒偶联的抗体，在磁场中截留标记细胞而发挥作用。随后，将标记的细胞从柱上洗脱下来。本方案中同时采用了阳性筛选和阴性筛选，以确保快速分离并获得高纯度细胞。若分离所得细胞数量不足或纯度存疑，可根据供应商说明向样品中添加更多抗体，并再次通过 LS 柱，可能有助于提高纯度（表 2）。本实验室通过对最终细胞悬液进行 FACS 分析发现，现有方案具有较高的纯度和贴壁效率8。
细胞外通量分析仪能够实时监测氧气消耗和培养基酸化情况，其性能优于其他电极。单核细胞和中性粒细胞中观察到的氧化爆发反应所介导的氧气消耗依赖于NADPH氧化酶，这一点通过DPI抑制实验已得到证实8。我们发现，随着细胞分离时间的延长或XF检测时间的增加，氧化爆发能力呈时间依赖性下降。本实验方案最初是为XF24仪器设计和开发的，但也可用于XF96仪器，接种细胞密度约为XF24的三分之一至二分之一（图3）。
在本实验方案的设计中，为了在生物能量学分析中获得最佳性能，必须遵循每种技术现有的实验方案，仅对培养基条件进行修改以实现控制。掌握这些技术后，该方案可广泛应用于多种转化医学和科研领域，用于评估治疗策略的毒性或有效性，探索疾病状态下的代谢特征，&#160;以及在炎症条件下单核细胞和中性粒细胞的氧化剂产生情况。

监测血液中免疫细胞（单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞）和血小板的生物能量健康状况，长期以来被认为是一种潜在的有用诊断工具，可用于评估个体整体的生物能量健康水平。越来越多的研究文献表明，癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等多种疾病与线粒体功能障碍有关1,2。这一点在临床上具有重要意义，因为线粒体功能障碍可能引发一系列细胞事件，促进促炎信号通路的激活，或导致细胞死亡。已有若干研究对纤维肌痛、糖尿病、脓毒性休克和阿尔茨海默病等疾病状态下外周血单个核细胞及血小板的线粒体功能进行了表征3-7。例如，最近一项研究评估了血小板的生物能量学作为线粒体功能的标志物，发现2型糖尿病患者的血小板线粒体耗氧能力降低7,8。基于这些及其他研究结果可以明确，单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血小板可作为病理条件下生物能量变化的替代标志物，因为它们在全身循环中持续监测，可能反映局部和全身的代谢改变。为了确定该方法是否具有预后或诊断价值，需要高通量的分析方法以及标准化的细胞制备流程。
测量白细胞和血小板中线粒体功能的方法以往涉及线粒体的分离，或在完整细胞中评估细胞生物能量状态4,9。使用细胞外通量（XF）分析仪进行细胞生物能量评估的优势在于，能够在内源性底物存在的条件下测定细胞中线粒体的功能，并可确定质子漏和最大呼吸能力等呼吸参数。&#160;我们及其他研究者已应用该技术证明，可建立并比较从人血液中分离的血小板、单核细胞和淋巴细胞的生物能量谱型8。此外，中性粒细胞和单核细胞均具有氧化爆发能力，其中NADPH氧化酶被激活并消耗氧气生成超氧阴离子。&#160;重要的是，该通路是先天免疫的关键组成部分，并受系统性炎症的调节。例如，已有研究表明，氧化爆发能力的变化与多种自身免疫性疾病相关，如多发性硬化症、关节炎和反复感染10,11。目前尚无可用于临床样本中高通量定量检测氧化爆发的检测方法。&#160;这一点尤为重要，因为表征中性粒细胞和单核细胞的氧化爆发能力，可能成为多种病理状态的重要诊断工具。
使用传统的极谱法测量耗氧量时，主要的技术挑战在于灵敏度较低；而采用更灵敏的微孔板荧光法时，则需要使用贴壁细胞。&#160;在本实用视频中，我们介绍了针对这些问题的技术解决方案。&#160;我们详细阐述了从人血液中分离、接种并测量单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血小板的生物能量学参数，以及单核细胞和中性粒细胞氧化爆发的方法。该方法适用于具备患者人群资源并能够获取新鲜血液样本的研究人员，用于临床生物能量学和氧化爆发功能的评估。

<table><tbody><tr><td>QuadroMACS 起始试剂盒，包含 QuadroMACS 分离器和 MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-833</td><td></td></tr><tr><td>CD235a（血型糖蛋白 A）微珠，人源</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-501</td><td></td></tr><tr><td>CD61 微珠，人源&amp;nbsp;用于血小板</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-051-101</td><td></td></tr><tr><td>CD14 微珠，人源&amp;nbsp;用于单核细胞</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>CD15 微珠，人源&amp;nbsp;用于粒细胞</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-601</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer ACD 血液采集管</td><td>Fisher</td><td>02-684-26</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td>含 L-谷氨酰胺，不含酚红</td></tr><tr><td>前列腺素 I2 钠盐</td><td>Cayman</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 半微量比色皿</td><td>Phenix Research Products</td><td>SC-2410</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 密度梯度液，比重 1.077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 密度梯度液，比重 1.119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 V 级</td><td>Roche</td><td>3117405001</td><td>超纯，不含脂肪酸</td></tr><tr><td>佛波酯 12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>XF24 FluxPak</td><td>Seahorse Biosciences</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher</td><td>MT90113PB</td><td>不含葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸、酚红和碳酸氢盐</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺，200 mM（100 倍浓度）</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma</td><td>P8574</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak（细胞黏附剂）</td><td>BD Biosciences</td><td>CB-40242</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>抗霉素 A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>（FCCP）羰基氰化-4-（三氟甲氧基）苯腙</td><td>Sigma</td><td>C-2920</td><td></td></tr><tr><td>DC 蛋白检测试剂 A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>DC 蛋白检测试剂 S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0015</td><td></td></tr><tr><td>DC 蛋白检测试剂 B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse</td><td>Seahorse Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS 分离器和 MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976 和 24039</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

生物能量学与氧化爆发：人白细胞和血小板分离与评估的实验方案

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

已知线粒体功能障碍在多种病理状态中发挥重要作用，例如动脉粥样硬化、糖尿病、脓毒性休克和神经退行性疾病，但在患者中评估生物能量功能的变化仍具挑战性。&#160;尽管糖尿病或动脉粥样硬化等疾病在临床上表现为特定器官的损伤，但其系统性病理成分（如高血糖或炎症）可能改变循环白细胞或血小板中的生物能量功能。这一概念已被认识多年，但由于生物能量分析所需的原代细胞数量较大，其广泛应用受到限制。&#160;这一技术瓶颈已通过结合磁珠分离技术的特异性、细胞黏附技术（可使细胞在不被激活的情况下贴附于微孔板）以及专为高通量微孔板呼吸测定设计的新技术的高灵敏度而得以克服。&#160;此类设备的一个实例是细胞外通量分析仪。这类仪器通常使用对氧气和pH敏感的探针，测量贴壁细胞中这些参数的变化速率，进而反映细胞代谢情况。本文详细描述了从人血液中分离并接种单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血小板的方法，确保细胞不被激活，以及对这些细胞中线粒体生物能量功能的分析。此外，我们还展示了如何在同一份样本中测定单核细胞和中性粒细胞的氧化爆发。由于这些方法仅需8–20 mL人血液，因此在临床环境中具有监测活性氧生成和生物能量功能的潜力。

为了评估血细胞的生物能量学特性，需通过静脉穿刺采集人全血，并收集至含EDTA或ACD抗凝剂的真空采血管中。血液采集后白细胞和血小板的分离过程如图1A所示，具体步骤详见实验方案。全血样本应在采集后8小时内完成处理，以避免细胞死亡和活化。超过8小时的长期储存尚未经过测试，但可能导致生物能量学状态改变，从而不能准确反映生理条件。已使用酸性柠檬酸葡萄糖（ACD-8 ml）和EDTA真空采血管进行细胞分离，未观察到对分离细胞生物能量功能的影响。抗凝剂的使用是必要的，因为血液凝固会减少可获得的细胞数量，在Ficoll密度梯度离心过程中干扰正常分层的形成，并导致离心后血清中几乎无法获得血小板。所有血液样本均具有生物危害性，即使在细胞群体分离完成或细胞裂解物制备后，整个操作过程中也必须始终采取适当个人防护措施。样本应按照所在机构的人源性废弃物处理标准进行处置。
将全血离心以分离富含血小板的血浆和位于压积红细胞上方的白细胞层（即白膜层），白膜层含有白细胞。将白膜层置于密度梯度液上并进行离心，以获得外周血单个核细胞（单核细胞和淋巴细胞）以及多形核细胞（粒细胞）。在此阶段，单个核细胞（MNC）和多形核细胞（PMN）组分中常含有红细胞污染，应在磁珠分选（MACS）纯化过程中予以去除。随后通过与磁性抗体孵育获得不同类型的细胞。通过将外周血单个核细胞组分与CD14抗体孵育收集单核细胞，单核细胞流穿液中含有淋巴细胞，再通过去除红细胞和血小板进行纯化。中性粒细胞则通过将多形核细胞层与CD15抗体孵育获得（图1A）。之后，可通过离心富含血小板的血浆获得血小板沉淀，并通过洗涤去除其他血浆成分。完成上述分离后，可对血小板、CD14+单核细胞、淋巴细胞和CD15+中性粒细胞进行计数，并接种于包被有细胞黏附培养基的XF分析仪板上，用于生物能量学和氧化爆发分析。
实验的每个步骤都应在无菌条件下进行，以避免单核细胞和中性粒细胞过早激活氧化爆发反应。在分离过程中，若无菌条件不足，会出现相应迹象：中性粒细胞在基础状态下几乎不消耗氧气，但在进行细胞外通量检测时，其耗氧率（OCR）初始值即升高，并在检测过程中持续升高或逐渐下降。我们强调，应在200倍或更高倍数的光学显微镜下观察细胞形态，以确保检测前未发生任何形态学上的激活现象。例如，正常中性粒细胞呈圆形至不规则形状，细胞边界清晰，如图1B所示。然而，一旦被激活，这些细胞会贴附于培养板表面并变平，失去其特有的细胞形态。我们此前已报道过使用本方案时白细胞和血小板的形态学变化；若观察到细胞激活现象，必须采取额外措施以确保无菌操作8。
该实验方案的简化流程如图2所示，以时间表形式详细列出了细胞分离、XF板制备和XF检测的主要步骤。细胞分离包括利用密度梯度法分离不同细胞类型，随后进行磁珠分选。在细胞分离的同时，必须平行进行XF板的制备，以避免细胞铺板或启动XF检测时出现延迟。这一点至关重要，因为显著的延迟可能导致细胞活化以及生物能量学参数的下降。
分离后细胞浓度过低是常见问题，有必要优化每一步离心过程以避免细胞丢失。成功分离可仅使用低至6 ml的血液，但也可根据目标细胞类型的循环浓度进行调整。若密度梯度制备不当，则可能无法观察到清晰的细胞分层，并导致细胞丢失（参见 JoVE 教学视频以获取可视化演示）。从富血小板血浆（PRP）中分离血小板不足的情况较为罕见，但如果洗涤缓冲液中不含PGI2，或操作在室温以下进行，则可能发生此问题。通常，若将血小板作为最后一种细胞进行分离，可避免其活化的风险；然而，若血小板在洗涤缓冲液中停留时间过长，其生物能量状态将受到影响。曾有报道，在1,500 × g离心过程中部分较小的血小板亚群未能形成沉淀，这些细胞的生物能量特性尚未被充分表征。完整的故障排除指南请参见表2。
可以使用XF分析仪测定白细胞和血小板的生物能量谱，该仪器能够以非侵入方式实时测量细胞的O2消耗量。 每种细胞类型均接种于XF24板中，设五个复孔，如图3A所示。表1列出了在检测过程中各细胞类型的预期基础呼吸值和氧化爆发值，以及每孔的平均蛋白浓度。也可采用更高通量的技术，例如XF96，可同时检测四位供体样本，如图3B所示。检测完成后，数据导出至工作站计算机，使用相应的XF软件和Microsoft Excel进行分析。氧耗率（OCR）数值经对应孔中的总蛋白含量标准化后，以pmol/min/mg蛋白表示。我们课题组近期已报道了各类细胞典型的生物能量-氧化爆发谱8。本检测中各项生物能量参数（基础呼吸、ATP偶联呼吸、质子漏、最大呼吸、非线粒体呼吸及氧化爆发）可针对单个孔进行进一步计算，方法如前所述并见下文8。
基础氧消耗率（OCR）由前3次测量值确定，如图4A所示。将线粒体ATP合酶抑制剂寡霉素（0.5 µg/ml）注入XF培养基中，以评估与ATP合成相偶联的OCR，并表示为ATP偶联型。残余OCR减去非线粒体OCR的部分可归因于质子漏。随后加入解偶联剂FCCP，以测定最大OCR；再加入线粒体呼吸抑制剂抗霉素A，以确定非线粒体来源的氧消耗。储备能力用于衡量在能量需求增加时可产生的ATP量，其值可计算为最大呼吸速率与基础呼吸速率之间的差值。为了测定氧化爆发能力，加入蛋白激酶C（PKC）激动剂佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）以增强NADPH氧化酶活性，随后可通过XF分析仪测量PMA刺激后氧消耗率的增加。图4B展示了如何计算线粒体功能和氧化爆发的各项参数。
<img alt="血细胞分离示意图：全血离心、密度梯度法、磁珠分选；细胞显微镜图像。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 从全血中分离白细胞和血小板。 A) 新鲜采集的样本通过离心分离为血浆和细胞组分，再经Ficoll密度梯度法纯化，并通过磁珠激活细胞分选（MACS）进行阳性（单核细胞和中性粒细胞）或阴性选择（淋巴细胞）分选；而血小板则通过高速离心富血小板血浆获得。 B) 分离后的细胞群体重新悬浮于XF DMEM培养基中，并按指定细胞密度接种后的显微图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51301/51301fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞制备、铺板、XF 检测流程图；包括 MACS 分离、离心、XF 孵育。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 白细胞和血小板生物能量学研究中 XF24 检测板的制备。 XF24 检测板的详细制备时间线，包括细胞分离与铺板、探针水合及加样孔加载。 
<img alt="显示单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血小板分布的平板实验示意图；实验设置细节。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. XF24 和 XF96 分析仪板上白细胞和血小板的布局。A) 来自单一供体的白细胞（每孔 125–250k 个细胞）和血小板（每孔 25 × 106 个细胞）接种于 XF24 实验板中，并设置背景对照。将寡霉素（0.5 µg/ml）、FCCP（0.6 µM）、抗霉素 A（10 µM）和佛波酯（PMA，100 ng/ml）的 10 倍浓缩液各 75 µl 用 XF 培养基稀释后，加入指定的加样孔中。B) 最多可将来自四个不同供体的白细胞（每孔 75–150k 个细胞）和血小板（每孔 10 × 106 个细胞）接种于 XF96 板中，总体积为 180 µl XF-DMEM 培养基。将寡霉素（1.0 µg/ml）、FCCP（0.6 µM）、抗霉素 A（10 µM）和佛波酯（PMA，100 ng/ml）的 10 倍浓缩液各 20 µl 用 XF-DMEM 培养基稀释后，加入指定的加样孔中。
<img alt="线粒体呼吸示意图；氧化爆发分析，耗氧率（OCR）随时间变化，包含公式。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 生物能量学指标分析。A) 线粒体耗氧率（OCR）及单核细胞氧化爆发的代表性曲线。基础OCR由前三个速率确定（圆圈中的数字表示）。随后依次加入寡霉素（O；0.5 µg/ml）、FCCP（F；0.6 µM）和抗霉素A（A；10 µM），以测定非激活细胞的线粒体呼吸和非线粒体呼吸。最后加入佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA；100 ng/ml）以测量氧化爆发。B) 线粒体功能和氧化爆发的模块化分析通过如图所示的速率差异进行计算。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;">最佳接种密度</td>
			<td style="width:215px;">平均基础耗氧率（pmol O2/min）</td>
			<td style="width:215px;">平均氧化爆发耗氧率（pmol O2/min）</td>
			<td style="width:215px;">平均每孔蛋白量（µg）</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">单核细胞</td>
			<td>250k 细胞 / 孔</td>
			<td>83.9 ( ± 13.0)</td>
			<td>300.3 ( ± 58.8)</td>
			<td>19.0 ( ± 2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">中性粒细胞</td>
			<td>250k 细胞 / 孔</td>
			<td>6.1 ( ± 2.2)</td>
			<td>1411.8 ( ± 233.3)</td>
			<td>20.6 ( ± 2.7)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">淋巴细胞</td>
			<td>250k 细胞 / 孔</td>
			<td>52.9 ( ± 7.7)</td>
			<td>15 ( ± 4.1)</td>
			<td>13.2 ( ± 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">血小板</td>
			<td>25 x 106 细胞 / 孔</td>
			<td>199.4 ( ± 20.3)</td>
			<td>24 ( ± 2.7)</td>
			<td>47.5 ( ± 3.1)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. XF24 检测的正常参数：以指定细胞密度接种的不同细胞类型，其平均基础耗氧率（速率3）和氧化爆发耗氧率（速率7），未校正非线粒体耗氧率或蛋白量。每孔平均蛋白含量由 DC Lowry 法测定得出。这些数据来自6-8名健康供体，括号内为±标准误（SEM）。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="4">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="66">
			<td>步骤</td>
			<td>问题</td>
			<td>可能原因</td>
			<td>解决方案</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:199px;">1.2</td>
			<td style="width:199px;">血浆澄清</td>
			<td style="width:199px;">离心过程中血小板沉淀</td>
			<td style="width:199px;">将离心时间缩短至10分钟，或降低离心力至400 × g</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td>
			<td style="width:199px;">乳糜血浆</td>
			<td style="width:199px;">脂质过多</td>
			<td style="width:199px;">避免餐后采血</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:199px;">1.6</td>
			<td style="width:199px;">细胞条带形成不完整</td>
			<td style="width:199px;">梯度制备不当，试剂温度过低</td>
			<td style="width:199px;">移液时避免破坏梯度，使用室温试剂</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td>
			<td style="width:199px;">细胞条带中出现团块</td>
			<td style="width:199px;">可能发生血液凝固</td>
			<td style="width:199px;">使用ACD或EDTA等抗凝剂采集血液</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:199px;">1.10</td>
			<td style="width:199px;">无细胞沉淀</td>
			<td style="width:199px;">参见步骤1.6</td>
			<td style="width:199px;">若上清液浑浊，请参见下文</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td>
			<td style="width:199px;">上清液浑浊</td>
			<td style="width:199px;">Ficoll梯度重度污染，血小板污染</td>
			<td style="width:199px;">提高离心速度至900 × g，用更多RPMI稀释</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:199px;">1.16, 1.17</td>
			<td style="width:199px;">白细胞得率低</td>
			<td style="width:199px;">红细胞污染严重，全血量不足，发生凝血</td>
			<td style="width:199px;">加倍抗体和RPMI-BSA体积，采集更多血液，添加抗凝剂</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:199px;">1.19</td>
			<td style="width:199px;">血小板聚集</td>
			<td style="width:199px;">未添加PGI2，接触低温培养基，血浆中长时间储存</td>
			<td style="width:199px;">在血小板洗涤缓冲液中添加PGI2，使用室温试剂</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:199px;">1.20</td>
			<td style="width:199px;">血小板计数低</td>
			<td style="width:199px;">初次离心过程中损失，血小板聚集</td>
			<td style="width:199px;">参见步骤1.2和1.19</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:199px;">2.3</td>
			<td style="width:199px;">红细胞污染</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:199px;">重复MACS分选</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 白细胞和血小板分离的故障排除。 本表列出了从全血中分离白细胞和血小板过程中可能遇到的常见问题，以及可帮助用户进行故障排除的解决方案。

血液中的白细胞和血小板可作为个体整体生物能量健康状况的标志物，因此具有监测病理过程及治疗效果的潜力。本文&#160;介绍一种用于分离并检测这些细胞中线粒体功能和氧化爆发的方法。

线粒体功能障碍已知在多种病理状况中发挥重要作用，例如动脉粥样硬化、糖尿病、败血性休克以及……

在以下实验方案中，将演示如何测定人血液中单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血小板的生物能量谱及氧化爆发反应。首先，从新鲜抽取的血液中分离出血沉棕黄层和富血小板血浆组分；其次，通过密度梯度离心将异质性的白细胞群体分离为单个核细胞层和多形核细胞层。接下来，通过最大分离法进一步分离出纯的单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞群体，然后将其接种用于细胞外通量或XF分析。最终，可利用XF技术灵敏且可重复地测定单核细胞、淋巴细胞和血小板的线粒体功能，以及单核细胞和中性粒细胞的氧化爆发和氧气消耗速率。我们今天向您展示的这项技术的优势在于，仅需少量血液样本，即可制备出患者血液中所有主要类型的细胞。这些是处于纯化灭活状态的血小板和白细胞，我们通过检测其线粒体功能来评估。我们认为，这能够实时反映患者体内的各种疾病状态和生理状况。该方法有助于回答有关代谢的关键问题，例如生活方式、饮食以及病理应激对线粒体功能的影响。本方案结合了多种技术，用于分离和测定不同白细胞群体及血小板中的细胞生物能量学参数。该方案的此步骤非常关键，因为密度梯度和磁性分离需要精确的移液操作。此外，在组分分离过程中，您需要明确各细胞群体的位置。我们将演示如何分离外周血细胞，并在24孔细胞外通量分析仪（XF 24）上分析细胞生物能量代谢。然而，该方法也可在XF 96上进行。在开始实验前至少两小时，使用XF校准溶液对XF传感器微孔板探针进行水合处理。然后将 freshly drawn 全血在室温下以 500 × g 离心 15 分钟，使用配有摆桶转子的离心机进行操作。用移液管移除上层富含血小板的血浆，保留红细胞与白膜层（buffy coat）之间约 1 厘米厚的血浆层，并将收集的血浆置于室温下备用。随后将白膜层转移至无菌的 50 毫升锥形管中，并将白细胞稀释至 24 毫升。接下来，在基础RPMI培养基中，向三个15毫升锥形管中各加入3毫升低密度、不透明的1.077溶液。然后将一支5毫升窄口吸头插入每个管的底部，依次缓慢释放3毫升高密度、不透明的1.119溶液。现在，使用设置在低功率档的自动移液器，小心地将八毫升稀释后的血液加入每种密度梯度液中，注意不要扰动各层。低密度梯度液中已添加蓝色染料，以便观察所有梯度层。离心分离细胞后，用无菌玻璃移液管收集单个核细胞和多形核细胞，注意不要扰动其他细胞层。将每根试管中的单个核细胞和多形核细胞群体分别收集到对应细胞类型的无菌50毫升锥形管中，并向两根试管中各加入四倍体积的RPMI培养基。离心后，将细胞沉淀转移至1.5毫升离心管中，再次离心，然后用80微升添加了BSA的新鲜RPMI重悬。随后，分别向单个核细胞和多形核细胞组分中加入20微升磁珠标记的抗CD14和抗CD15抗体。将每种细胞悬液在4°C下孵育15分钟，然后用1毫升RPMI-BSA培养基洗涤各管，并将细胞沉淀重悬于500微升RPMI-BSA中。随后将细胞悬液分别加入经RPMI-BSA洗涤过的LS分离柱中，并用3毫升RPMI-BSA培养基洗涤每根柱子3次。将细胞悬液的穿流液及柱洗液收集至无菌管中以分离单核细胞和中性粒细胞；最后一次洗涤后，将柱子移出磁场，并用5毫升RPMI-BSA洗脱正向选择的细胞至无菌管中。为分离淋巴细胞，将细胞柱穿流液的洗涤组分离心成沉淀，将细胞沉淀重悬于80微升RPMI-BSA中，并加入20微升CD61和CD235A抗体，在4°C下孵育15分钟。然后重复之前的最大分离步骤，收集含有淋巴细胞的流穿液以分离血小板，离心后保留富含血小板的血浆，随后去除血浆，并用5毫升无菌PBS缓冲液（添加1微克/毫升前列腺素I₂）洗涤细胞沉淀一次，再将血小板沉淀重悬于1毫升新鲜的PBS-前列腺素I₂缓冲液中。接着接种已分离的单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血小板。首先对细胞进行计数，并用XF检测试剂将细胞调整至适当体积，使每孔接种密度为2.5 × 10⁵个细胞，接种体积为200微升。在24孔XF细胞培养微孔板（预先用Cell-T对血小板进行包被）中，每孔接种2.5 × 10⁷个细胞，体积为200微升。将细胞离心至培养板后，用XF培养基将每孔终体积补至660微升，并在XF检测前于37摄氏度孵育30分钟。在孵育期间，按列表顺序将75微升检测试剂加入XF传感器微孔板的加样孔中。若需获取氧化爆发数据，可在抗霉素A之后注入PMA，并将其置于后续的注射孔位。将微孔板放置于细胞外通量分析仪上以开始检测。使用Seahorse XF细胞外通量分析仪可测定白细胞和血小板的生物能量谱，该仪器能够以非侵入方式实时测量细胞的耗氧量。每种细胞类型均以五次重复接种于XF 24微孔板中，如上表所示。图中按细胞类型展示了实验过程中测得的代表性基础呼吸和氧化爆发值，以及每孔的平均蛋白浓度。耗氧速率值经对应孔中的总蛋白含量标准化后，以每分钟每微克蛋白的皮摩尔数（pmol/min/µg蛋白）表示。基础耗氧速率由前三个测量值确定。寡霉素（oligomycin）是一种线粒体ATP合酶抑制剂，将其注入XF培养基中，用于评估与ATP合成相偶联的耗氧速率，该速率表示为ATP合成相关耗氧率；而残余耗氧速率减去非线粒体来源的耗氧速率，则可归因于质子漏。加入解偶联剂FCCP可测定最大耗氧速率，随后注入抗霉素A（antimycin A）——一种线粒体呼吸抑制剂，用以测定非线粒体来源的耗氧。储备容量反映了在线粒体面临更高能量需求时所能额外承担的功能负荷，可通过最大呼吸速率与基础呼吸速率之差进行计算，该参数可用于评估单核细胞和中性粒细胞的氧化爆发能力。注射P-M-A-A-P-K-C激动剂后，氧气消耗速率的增加与N-A-D-P-H氧化酶介导的氧化剂产生相关。一旦掌握该技术，从血液采集到完成操作可在短短三小时内完成（不包括检测本身所需时间），前提是操作得当。在进行该实验过程中，重要的是在生物安全柜中进行每一步操作，并使用无菌的室温缓冲液和培养基，以维持无菌条件。完成该步骤后，可进一步开展其他实验方案，例如流式细胞术分析，以确定细胞纯度、白细胞的活化状态，以及白细胞亚群的细胞生物能量代谢情况。观看本视频后，您现在应该对如何制备血小板、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞，并将其放入Seahorse仪器中测量氧化爆发和线粒体功能有了较为清晰的认识。随后，您可以分析您的患者群体，确定其生物能量学在实时条件下的变化情况。请务必注意，处理人类患者样本可能具有极高的危险性。因此，在此操作过程中，您需要佩戴个人防护装备，并使用生物安全柜。

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