Name: 细胞外基质刚性三维肿瘤模型的纵向测量用粒子跟踪Microrheology (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 学习使用粒子追踪微流变学技术对三维肿瘤模型中的细胞外基质进行纵向力学测量。该方法通过分析示踪粒子轨迹，以无损方式量化肿瘤生长过程中基质力学特性的时空变化，为研究肿瘤微环境动态提供定量数据。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们衷心感谢 Maria Kilfoil 提供的 MATLAB 粒子追踪代码的开源共享（<a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a>），同时也感谢 John C. Crocker 和 Eric R. Weeks 提供的早期 IDL 代码及详尽的文档资料。本研究工作由美国国家癌症研究所（NCI/NIH）资助，项目编号 K99CA155045 和 R00CA155045（项目负责人：JPC）。

1. 肿瘤类球体的培养
<ol>
	<li>将10 ml细胞培养级水与0.1 g琼脂糖混合，制备成1%的琼脂糖溶液。</li>
	<li>将琼脂糖溶液加热至70 °C以上（在标准微波炉中加热约14秒&#160;，或使用加热板），然后取40 μl&#160;琼脂糖溶液加入96孔板的一个孔中。</li>
	<li>将板在37 °C下孵育至少1小时，同时采用标准技术收集细胞。</li>
	<li>使用血细胞计数板测定细胞悬液中的细胞浓度。</li>
	<li>将细胞悬液稀释至1,000 个细胞/ml&#160;，并取100 µl&#160;该稀释液加入含有固化琼脂糖基质的孔中。</li>
	<li>将样品置于37 °C&#160;、5% CO2的培养箱中，在摇床上过夜培养。</li>
	<li>从摇床上取出样品，加入100 µl&#160;细胞培养基。</li>
	<li>继续孵育类球体，直至达到所需直径。例如，培养9天后，类球体直径约为450 µm。在此期间，可向孔中补充新鲜培养基，但应避免吸液，以免导致类球体被移除。</li>
</ol>
2. 制备嵌入细胞外基质的三维肿瘤球
<ol>
	<li>在超净工作台内准备一个配备所需材料的工作站。</li>
	<li>通过将2份储备探针（2%固体含量）加入25份无菌水中，配制羧基化修饰的1 μm直径荧光示踪探针的稀释混合液。</li>
	<li>从冰箱中取出一瓶3.1 mg/ml&#160;牛胶原蛋白，并置于冰上。</li>
	<li>将125 μl&#160;胶原蛋白分装至一个空的2 ml&#160;小瓶中。</li>
	<li>向含有胶原蛋白的小瓶中加入50 μl&#160;稀释后的示踪探针溶液，短暂涡旋以混匀探针。</li>
	<li>加入235 μl&#160;含酚红的适当细胞培养基（溶液将变为黄色），使总体积达到410 μl&#160;，短暂涡旋混匀后，取出205 μl&#160;（总体积的一半）转移至一个新的2 ml&#160;小瓶中。小瓶1将用于容纳肿瘤类球体，小瓶2作为对照混合物。</li>
	<li>向小瓶1中加入约2 μl&#160;1 M NaOH，使溶液恢复至中性pH值（含酚红的培养基应恢复为红色）。注意：若未保持在冰上，此操作将导致混合物开始凝固。短暂涡旋混匀后，立即放回冰架上。 
	注：类球体在培养9天后肉眼几乎不可见，从琼脂糖基质中取出是一项精细操作。部分使用者可借助解剖显微镜辅助操作。在转移过程中维持类球体的完整性至关重要。</li>
	<li>使用宽口移液器吸头，轻轻从含有肿瘤类球体的孔中移除40 μl&#160;培养基。在进行下一步操作时保留此40 μl&#160;液体。</li>
	<li>检查孔中是否已将类球体移出。若已移出，将含有类球体的40 μl&#160;加入小瓶1中；若未移出，则将40 μl&#160;液体重新放回孔中，并重复上一步操作。</li>
	<li>轻轻搅动小瓶1（避免涡旋，以防损伤类球体），然后将混合物以每份60 μl&#160;分装至96孔板的三个独立孔中。加样后使用显微镜检查各孔，以确定哪个孔含有类球体。</li>
	<li>向小瓶2中加入约2 μl&#160;1 M NaOH和40 μl&#160;细胞培养基，涡旋混匀后，取60 μl&#160;该混合物加入96孔板中的一个空孔，并标记为对照。</li>
	<li>将96孔板放入37 °C培养箱中，孵育至少1小时以完成凝固。</li>
</ol>
3. 构建样本点网格并在每个点采集视频
<ol>
	<li>将样品板从培养箱转移至显微镜载物台上。若无加热载物台，需等待10分钟&#160;，使样品与室温平衡。</li>
	<li>使用低倍物镜观察样品，确认其完整且已准备好成像。确定肿瘤在孔内的位置。</li>
	<li>决定采集多少个采样点。通常情况下，每个孔内围绕类球体设置20个采样点，并呈同心圆分布，可获得足够详细的实验结果。</li>
	<li>移动载物台至每个目标位置，并使用显微镜配套软件记录x和y坐标（若无配套软件，可手动记录坐标）。</li>
	<li>将显微镜切换至高倍物镜（通常为100X），并选择与示踪探针激发波长匹配的滤光片组。使用步骤3.4中创建的点位列表，移动至网格中的第一个点。</li>
	<li>调节焦距以找到孔底，然后向上移动，寻找一个包含多个清晰聚焦示踪探针的视野（fov）。</li>
	<li>观察强度直方图，并调节曝光强度和时间，以尽可能获得最大的动态范围，同时确保图像不发生饱和。</li>
	<li>以每帧20-30毫秒的帧率采集视频序列（建议采集约800帧，或时长16-24秒&#160;，以在获得足够统计学稳健的均方位移计算结果与最小化每个空间网格点的采集时间之间取得平衡），并按照适当的命名规则保存。录制过程中，切勿触碰显微镜或实验台。</li>
	<li>对网格中的每个采样点重复执行步骤3.6至3.9。</li>
	<li>对实验中每孔重复执行步骤3.3至3.10。</li>
</ol>
4. 分析视频数据以计算每个样本点的流变特性
<ol>
	<li>将所有视频数据复制到一个分析文件夹中（可能位于另一台计算机上）。</li>
	<li>将图像数据导入 MATLAB 或其他分析软件。 
	注意：有关此处采用的 MATLAB 粒子追踪程序集的详细文档，可参见 <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a>建议使用自定义调用函数来自动化处理位于不同位置的多个文件。</li>
	<li>通过分析视频的若干帧来校准软件，以适当确定用于识别探针中心位置的选择与排除参数（如大小、带通等）。Crocker 和 Grier 对这些关键步骤提供了详尽的背景说明。</li>
	<li>使用软件自动确定所有视频帧中每个探针的位置，然后将这些位置连接成轨迹。</li>
	<li>利用轨迹数据计算均方位移（MSD）随滞后时间的变化关系，并确保应用适当的空间校准因子（&#956;m/像素）需根据特定物镜、像素合并设置等情况确定（通常包含在元数据中）。</li>
	<li>利用广义斯托克斯-爱因斯坦关系（GSER）计算G*，并考虑该关系对特定样品的适用性限制24,28,43或者，用户也可直接通过比较均方位移（MSD）的幂律标度、平台值、非均质性指数或其他参数来解读细胞外基质（ECM）的特性。</li>
	<li>对实验中的每个视野（fov）重复步骤 4.2 至 4.6。</li>
	<li>将步骤3.4中获得的位置数据与特定感兴趣频率下的黏弹性模量进行共配准。根据所用显微镜的制造商不同，此步骤可通过自定义程序读取显微镜元数据来实现，或通过手动整理位置数据完成。</li>
	<li>使用三维插值函数生成细胞外基质的三维空间流变图谱。</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在本实验方案中，我们介绍了一种稳健且广泛应用的策略，用于在三维肿瘤模型中纵向追踪细胞外基质（ECM）刚度的局部变化。我们预计，该方法可被关注肿瘤生长和侵袭过程中与基质重塑相关的机械敏感性行为的癌症生物学家和生物物理学家所采用。对基质降解动力学进行精确量化，可能对研究基质金属蛋白酶、赖氨酰氧化酶或其他相关生化物质在三维肿瘤模型中活性的研究人员尤为有价值，这些物质直接参与基质重塑过程。除了本文所述的三维肿瘤模型应用外，还可设想将此方法与其他疾病模型系统结合使用，其中基质流变学随时间的变化发挥着重要作用46,47。随着软件的不断改进，该方法的实用性持续提升，进一步实现了流程自动化，并支持高通量研究。这将能够在多孔板格式中，同时获得大量样本物理微环境的日益详尽的动态图像。
本文重点描述了在三维肿瘤模型中实施被动粒子示踪微流变学的方法，该方法适用于测量线性黏弹性响应，其模量范围约为数十帕斯卡，典型于市售的细胞外基质产品（如牛胶原蛋白、EHS肿瘤提取物或商用纳米纤维支架）。即使采用高数值孔径光学系统来量化微小探针位移，对随机的热驱动运动的观测本质上仍局限于这些相对较软的细...

越来越多的文献证据表明，癌细胞与非恶性哺乳动物上皮细胞一样，对机械环境具有高度敏感性&#160;以及周围细胞外基质（ECM）和其他微环境组分的生物物理特性1-9优雅的机制研究揭示了细胞外刚度作为复杂的力学敏感性信号伙伴在调控恶性生长行为和形态发生中的作用2,3,10,11。这项工作尤其得益于三维技术的发展 体外 可恢复生物学相关组织结构的肿瘤模型，可在力学性能可调的支架材料中培养，并可通过光学显微镜成像12-19然而，肿瘤与微环境之间这种机械调控对话的另一面——即癌细胞反过来改变其周围环境流变学特性的过程——研究起来仍较为困难。例如，在侵袭过程中，肿瘤边缘的细胞可能发生上皮-间质转化（EMT），并上调基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，从而导致细胞外基质（ECM）的局部降解20-22，进而影响其他邻近肿瘤细胞的力学敏感性生长行为。通过多种生物化学过程，癌细胞会持续调节其周围微环境的局部刚度，以适应不同时期的各种生理需求。本文所述方法源于对分析工具的需求，这类工具能够报告细胞外基质（ECM）在细胞生长过程中局部刚度和顺应性的变化，可与三维肿瘤模型整合，并能在不终止培养的前提下，长期关联监测生化和表型的动态变化。
在寻找适用于此背景的合适技术时，粒子追踪微流变学（PTM）成为一个强有力的候选方法。该方法最初由 Mason 和 Weitz23,24 开创，利用嵌入复杂流体中的示踪探针的运动，来表征微米尺度下频率依赖性的复数黏弹性剪切模量 G*(ω)。这一总体方法已发展出多种变体，适用于软凝聚态物质、胶体、生物物理和高分子物理等不同领域的应用25-31。与其他方法相比，PTM 具有一定优势，因为它通过非破坏性的视频成像检测生化惰性示踪探针的运动，即可提供局部黏弹性信息；这些探针在培养物制备时加入，并可在长期生长过程中稳定存在于体系中。这与使用振荡剪切体相流变仪进行的金标准测量形成对比，后者必须终止培养过程，且仅能反映样品整体宏观流变特性，而无法获取复杂三维肿瘤微环境中特定位置的测量数据。事实上，已有大量研究展示了通过分析示踪探针在癌细胞或非癌细胞内部及周围运动的测量结果，用于评估与细胞迁移相关的形变32、由扩张类球体诱导的机械应力33、细胞内流变特性34,35、工程化组织中的力学应力与应变分布36，以及孔隙大小与侵袭速度之间的关系37。其他适用于微流变学的技术，如原子力显微镜（AFM），也可被采用，但主要局限于对样品表面点位的探测，且可能带来培养体系无菌性方面的挑战，从而增加纵向测量的复杂性38。
在此，我们描述了一种综合性实验方案，涵盖适用于转移至含有嵌入式荧光探针的细胞外基质（ECM）中的三维肿瘤类球体的培养方法，以及用于可靠绘制培养过程中微流变学空间变化的视频粒子追踪与分析方法。在本实施方案中，三维肿瘤模型以多孔板形式培养，旨在将微流变学测量与其他传统检测方法相结合。例如，细胞毒性）的检测，这种形式非常适用。在本方法的代表性示例中，我们进行细胞培养 体外 使用PANC-1细胞形成的3D类球体，PANC-1是一种已建立的胰腺癌细胞系，已知可形成类球体39，但本文所述的所有测量方法均可广泛适用于利用多种适合三维培养的细胞系对实体瘤进行研究。由于该方法本质上基于成像，因此非常适合将高分辨率微流变学数据与大视野透射光图像进行共定位分析，以反映细胞生长、迁移和表型的变化。本方法中将PTM与透射光显微镜结合使用，依赖于显微镜载物台位置的可重复性，这一功能通常在配备电动装置的商用宽场落射荧光生物显微镜上具备。下述方案可在任何配置合理的自动荧光生物显微镜上实施。该方法本质上属于数据密集型技术，需要采集数吉字节（GB）的数字视频显微数据用于离线处理。
在以下方案中，方案&#160;1 涉及肿瘤类球体的初始制备，此处采用琼脂糖覆盖法进行描述，但也可替换为其他多种方法，例如悬滴法。40，或旋转培养41 技术。方案&#160;图2描述了将类球体包埋于胶原支架中的过程，但也可采用其他方法， 体外 通过将重悬细胞包封或嵌入细胞外基质（ECM）中，可培养出三维肿瘤12,15，而非单个预先形成且不粘附的球状体。后续方案描述了通过采集和处理视频显微镜数据，分别获得时间分辨微流变学测量结果的操作步骤。数据处理部分以 MATLAB 进行说明，利用基于 Crocker 和 Grier 最初描述的算法所构建的开源程序进行粒子追踪微流变（PTM）分析。42，这些方法也已在不同的软件平台上得到广泛开发&#160;（参见&#160;http://www.physics.emory.edu/~weeks/idl/)

<table><tbody><tr><td>牛I型胶原蛋白</td><td>BD 生物科学公司，美国加利福尼亚州圣何塞</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>美国典型培养物保藏中心，弗吉尼亚州马纳萨斯</td><td>CRL1469</td><td>或其他合适的细胞类型</td></tr><tr><td>荧光微球</td><td>Life Technologies，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德</td><td>906906</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD 生物科学，贝德福德，马萨诸塞州</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher Bioreagents，沃尔瑟姆，马萨诸塞州</td><td>C12H18O9</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Bioreagents，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>NC0480985</td><td></td></tr><tr><td>96孔成像板</td><td>康宁股份有限公司，纽约州康宁市</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>SH30243.01</td><td>或适当的细胞培养基</td></tr><tr><td>蔡司 AxioObsever 显微镜</td><td>蔡司，德国奥伯科亨</td><td></td><td>包括高速摄像机和成像软件</td></tr><tr><td>MATLAB 软件</td><td>The Mathworks，美国马萨诸塞州纳蒂克</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用粒子追踪微流变学对三维肿瘤模型中细胞外基质刚度进行纵向测量

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

机械微环境已被证实可作为调控肿瘤生长行为和信号转导的关键因素，其自身也在一系列复杂的双向力学敏感性相互作用过程中被重塑和改变。尽管具有生物学相关性的三维肿瘤模型的建立已促进了基质流变学对肿瘤生长影响的机制研究，但反向问题——即描绘肿瘤所诱导的机械微环境变化——仍然具有挑战性。本文描述了粒子追踪微流变学（PTM）与胰腺癌三维模型相结合的实施方法，作为一种可靠且可行的策略，用于长期监测肿瘤微环境中的物理变化。 原位. 此处所述的方法整合了一种制备系统 体外 嵌入I型胶原蛋白构建的模拟细胞外基质（ECM）支架中的三维模型，其内部均匀分布荧光标记探针，用于在整个样本中进行位置和时间依赖性的微流变学测量。 体外 肿瘤在多孔成像板中以平行条件进行铺板和检测。基于既定方法，通过广义斯托克斯-爱因斯坦关系（GSER）将示踪探针运动的视频转换为复频率依赖性黏弹性剪切模量。 G*ω由于该方法基于成像技术，机械特性可同时映射到大视野透射光空间区域，以同步报告三维肿瘤大小和表型的定性变化。文中展示了代表性结果，包括与局部侵袭诱导的基质降解相关的不同亚区域的力学响应对比，以及系统校准和验证数据。同时列出了常见实验错误导致的不良结果及相应的问题排查方法。本方案采用的96孔三维培养板格式，有利于将微流变学测量与药物筛选实验或分子成像相结合，从而深入理解治疗干预或生化刺激对肿瘤力学微环境的影响。

为了验证在复杂的模型肿瘤微环境中特定位置测量 G*(ω) 的有效性，我们进行了两项初步验证实验。首先，我们将测量结果与体相振荡剪切流变学的“金标准”进行比对。我们制备了相同批次的胶原基质样品（不含细胞），胶原浓度为 1.0 mg/ml。这些样品分别使用体相流变仪（TA Instruments AR-G2，采用 40 mm 平行板夹具）和粒子跟踪微流变学（PTM）（使用与本方案中相同的参数）进行检测，并比较所得的 G'(ω) 和 G"(ω) 测量结果（图 2A）。两种方法的测量结果高度一致。其次，为了验证本方案检测细胞外基质（ECM）局部流变学变化的能力，我们制备了浓度为 1.0 mg/ml 的胶原基质并嵌入示踪微球。随后，对样品进行中心位置注射 5 μl dispase 酶（图 2B），该酶可快速降解胶原。在 37 °C 下孵育 3 小时以允许局部胶原降解发生后，我们在距注射点不同距离处采集视频数据，并分别测量各位置的 G'(ω) 和 G"(ω)。结果显示，在注射点处 G"(ω = 1 rad/sec) 的幅值大于 G'(ω = 1 rad/sec) ...

粒子追踪微流变学可用于无损地定量分析并空间定位三维肿瘤模型中细胞外基质力学性质的变化。

机械微环境已被证实可作为肿瘤生长行为和信号传导的关键调节因子，其本身也会被重塑并……

本实验的总体目标是测量三维癌症模型中细胞外基质力学特性的纵向变化。首先，通过适当方法收获癌细胞并培养肿瘤类器官，直至其达到所需大小。第二步是将肿瘤类器官包埋于胶原蛋白或其他合适的细胞外基质中。接下来，构建样本点网格，并在每个点位拍摄视频。最后一步是分析视频数据，计算并共配准每个空间点的真正物理特性。最终，该方案通过分析示踪探针的运动轨迹，以非破坏性的方式对细胞外基质力学特性的空间变化进行纵向量化。其思路在于，通过将基于成像的细胞外基质放射学测量与能够重建细胞外基质相互作用的体外3D肿瘤模型相结合，该方法可定量揭示肿瘤生长、侵袭过程以及治疗反应中，随时间变化的力学微环境的动态改变。本视频展示的方法采用琼脂糖覆盖法，利用已建立的胰腺癌细胞系Pan1生成非黏附性3D类器官（OID）。首先，将10毫升细胞培养级水与0.1克琼脂糖混合，配制1%琼脂糖溶液。将 aros 溶液加热至 70 摄氏度以上后再进行分装。取 40 微升该溶液加入 96 孔板的每个孔中，将 96 孔板在 37 摄氏度下孵育 1 小时。通过胰蛋白酶消化收获癌细胞，并制备单细胞悬液，随后将细胞悬液稀释至每毫升含 1000 个细胞。取 100 微升该稀释液加入含有固化 aros 床的孔中。将样品置于37摄氏度、5%CO2培养箱中的摇床上过夜孵育。孵育结束后，从摇床中取出样品，加入100微升细胞培养基，继续孵育所得类器官，直至达到目标直径。例如，培养九天后，一个类器官的直径约为450微米。首先，在超净工作台内准备一个工作站，并放置两个2毫升小瓶。小瓶一用于盛装肿瘤类固醇，小瓶二作为无细胞对照。通过将两份羧基化修饰的1微米直径荧光示踪探针原液与25份无菌水混合，配制稀释后的探针混合液。从冰箱中取出一瓶 3.1 毫克/毫升的牛胶原蛋白，置于冰上。取 125 微升胶原蛋白加入第 1 号小管中，随后加入 50 微升稀释的示踪探针溶液，涡旋混匀以充分分散探针。然后加入含酚红的适当细胞培养基 235 微升，总体积为 410 微升，短暂涡旋混匀后，取出 205 微升转移至第 2 号小管中。接下来，向小管中加入约 2 微升 1 摩尔的氢氧化钠溶液。将溶液调回中性 pH 值后，短暂涡旋混匀。然后立即放回冰架，以防止混合物开始固化。轻柔地从含有肿瘤类固醇的孔中移除 40 µL 培养基。进行下一步操作时保留这40微升液体。检查孔内类固醇是否已在上一步中去除。若未完全去除，则将40微升液体重新放回孔内，并重复上一步操作。如果确认无误，将含有类固醇的40微升溶液加入小瓶中。在将混合物以每份60微升分装至96孔板的三个独立孔之前，轻轻搅拌小瓶一。加入混合物后，用显微镜检查每个孔，以确定哪个孔含有类固醇。然后向小瓶二中加入约2微升1摩尔氢氧化钠溶液和40微升细胞培养基，涡旋混匀后再进行分装。取60微升该混合物加入96孔板的空孔中，并标记为无细胞对照。将96孔板放入37摄氏度的培养箱中孵育至少一小时，以构建样本点阵列。首先，将孵育后的样本板从培养箱转移至显微镜载物台上。若无加热载物台，需让样品在室温下平衡10分钟。使用低倍物镜观察样品，确保其结构完整且适合成像。确定肿瘤在孔板中的位置，并通过透射光图像记录该位置，以便后续进行空间共定位。通常，在每个孔中围绕S类球体呈同心圆环分布的20个采样点即可产生足够详细的实验结果。将显微镜载物台移动至每个目标位置，并使用显微镜配套软件记录XNY坐标。切换显微镜至高倍物镜，并为示踪探针的x激发波长选择合适的滤光立方块。根据生成的点列表，移动到网格中的第一个点。在向上移动之前，先调整焦距以找到孔板的底部。寻找一个包含多个处于焦内示踪探针的视野。观察强度直方图，并调整曝光强度和时间，以在确保图像不饱和的前提下获得尽可能大的动态范围。以每帧20至30毫秒的帧率获取视频序列，并按照适当的命名规则保存。记录过程中，切勿触碰显微镜或实验台。对网格中的每个采样点重复进行记录。然后继续重复该过程，为实验中的每个孔构建相应的网格，并在纵向监测的整个持续时间内，对每个时间点重复完成全部流程。开始数据分析。将所有视频数据复制到一个分析文件夹中。将图像数据导入 MATLAB 或其他分析软件。通过分析视频的若干帧来校准软件，以适当确定用于识别探针中心位置的选择与排除参数。然后使用该软件自动确定所有视频帧中每个探针的位置，并将这些位置连接成轨迹。利用轨迹数据计算均方位移（MSD）随滞后时间的变化关系，务必应用针对特定物镜或任何像素二乘效应的适当空间校准因子。使用广义斯托克斯-爱因斯坦关系计算G星，并考虑该关系对特定样品的适用范围。对实验中每个视野重复分析步骤。根据所用显微镜的制造商，将位置数据与特定感兴趣频率下的黏弹性模量I进行共定位。可通过自定义程序辅助完成此步骤，该程序可读取显微镜的元数据，或可手动整理位置数据。在含有三维肿瘤结节的代表性孔内多个空间位置采集视频序列，并将其关联，以在纵向监测过程中提供样本的空间微尺度放射学图谱，揭示位于孔边缘的细胞群体。本示例中使用的某种类固醇将在数天内自发降解周围的胶原纤维，并侵入细胞外基质。在此示例中，显微成像的共定位分析提供了定量读数，清晰显示类固醇左侧区域发生了基质侵袭，而右侧则无此现象。对这两个不同空间区域的纵向监测表明，伴随侵袭的发生，复数黏弹性剪切模量的实部下降了约四个数量级。图中展示了第4天时区域一和区域二材料流变学特性的完整频率依赖性数据对比。在尝试本实验操作时，需注意避免在分析探针轨迹过程中出现常见错误，以免导致不恰当的结论。我们建议读者参考本文引用的单颗粒追踪（PTM）相关文献，其中讨论了诸如样品漂移和异质性解读等问题。本实验方法可与其他纵向或终点荧光成像技术结合使用，以回答其他科学问题，例如机械重塑如何与关键信号事件相关联，或细胞对干预措施的细胞毒性反应如何变化。

longitudinal-measurement-extracellular-matrix-rigidity-3d-tumor

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

细胞外基质刚性三维肿瘤模型的纵向测量用粒子跟踪Microrheology

细胞外基质的刚度显著影响黏附细胞的多种行为。基质刚度在组织内存在空间上的差异，并在多种疾病状态下发生改变。本文中，我们建立了利用原子力显微镜微压痕技术来表征正常及纤维化小鼠肺组织中刚度空间变化的方法。...

利用原子力显微镜对肺组织进行微机械特性表征

本方案描述了一种利用粒子追踪微流变学（PTM）监测细胞外基质刚度变化的技术。该方法通过将三维胰腺肿瘤类球体培养在含有嵌入式荧光探针的细胞外基质中，进行视频粒子追踪与分析。...

基于翻译后修饰的肿瘤微环境监测：一种利用肿瘤类球体追踪细胞外基质刚性变化的方法

本视频展示了用于评估细胞外基质刚度依赖性的定量延时显微镜技术 单核细胞增生李斯特菌...

定量延时显微镜技术用于评估细胞外基质刚度依赖性细菌扩散

本文介绍了一种可对胶原蛋白进行荧光标记的方法，该方法可用于3D细胞培养物的固定后成像和活细胞成像。我们还提供了一种优化的实验方案，用于可视化在3D环境中培养的细胞内源性细胞骨架蛋白。...

揭示三维环境中侵袭性癌细胞的细胞骨架组织

在伤口愈合、炎症和肿瘤发生过程中，细胞外基质会发生显著的重塑。本文介绍一种新型的活体免疫荧光显微技术，可利用落射荧光或双光子显微镜，以高空间和时间分辨率可视化纤维状以及网状基质成分的动态变化。...

长期活体免疫荧光成像技术用于观察组织基质成分：基于落射荧光与双光子显微镜的方法

落射荧光显微镜，双光子显微镜，活体成像，免疫荧光，细胞外基质，胶原蛋白，基底膜，组织重塑，肿瘤微环境，炎症，纤维化

肿瘤微环境中的机械刚度通过增强侵袭伪足活性和肌动球蛋白收缩力，在驱动恶性行为中起着关键作用。利用聚丙烯酰胺凝胶（PAAs），可通过侵袭伪足和牵引力测定方法研究癌细胞对基质刚度响应的侵袭性和收缩性特征。...

用于癌细胞侵袭足和牵引力测定的聚丙烯酰胺凝胶

粒子示踪微流变学用于研究材料的粘弹性。本文中，该技术被用来测定细菌生物膜不同基质组分的粘弹性、蠕变柔量以及有效交联作用。该基质由细菌分泌的聚合物物质组成，其组分决定了生物膜的结构和力学特性。...

原位 粒子示踪微流变学法测定生物膜机械性能

本文介绍了一种用于模拟生物物理微环境的实验方案，其中由晚期糖基化终末产物（AGEs）诱导的基底膜（BM）交联及其刚度增加具有病理学意义。...

如何研究基底膜硬度作为前列腺癌及其他年龄相关病理或代谢性疾病的生物物理触发因素

我们开发了一种基于多孔板格式的聚丙烯酰胺检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响。该检测方法可与流式细胞术、免疫染色以及牵引力显微镜兼容，能够对细胞、其细胞外基质与致病菌之间的生物力学相互作用进行定量测量。...

一种基于多孔板格式聚丙烯酰胺的检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响

光学相干断层扫描（OCT）是一种三维成像技术，可用于监测和表征多细胞肿瘤球体的生长动力学。本研究展示了基于体素计数法对肿瘤球体进行精确的体积定量分析，并利用内源性光学衰减对比实现无需标记的球体内坏死组织检测。...

利用光学相干断层扫描对三维肿瘤球体进行长期形态学与生理学监测

本文介绍了一种基于力学的实验方案，用于破坏缝隙连接蛋白 connexin...

通过连接蛋白43结构破坏干扰内皮细胞生物力学

学习使用粒子追踪微流变学技术对三维肿瘤模型中的细胞外基质进行纵向力学测量。该方法通过分析示踪粒子轨迹，以无损方式量化肿瘤生长过程中基质力学特性的时空变化，为研究肿瘤微环境动态提供定量数据。

利用粒子追踪微流变学对三维肿瘤模型中细胞外基质刚度进行纵向测量

探索更多视频