利用粒子追踪微流变学对三维肿瘤模型中细胞外基质刚度进行纵向测量

本实验的总体目标是测量三维癌症模型中细胞外基质力学特性的纵向变化。首先，通过适当方法收获癌细胞并培养肿瘤类器官，直至其达到所需大小。第二步是将肿瘤类器官包埋于胶原蛋白或其他合适的细胞外基质中。

接下来，构建样本点网格，并在每个点位拍摄视频。最后一步是分析视频数据，计算并共配准每个空间点的真正物理特性。最终，该方案通过分析示踪探针的运动轨迹，以非破坏性的方式对细胞外基质力学特性的空间变化进行纵向量化。

其思路在于，通过将基于成像的细胞外基质放射学测量与能够重建细胞外基质相互作用的体外3D肿瘤模型相结合，该方法可定量揭示肿瘤生长、侵袭过程以及治疗反应中，随时间变化的力学微环境的动态改变。本视频展示的方法采用琼脂糖覆盖法，利用已建立的胰腺癌细胞系Pan1生成非黏附性3D类器官（OID）。首先，将10毫升细胞培养级水与0.1克琼脂糖混合，配制1%琼脂糖溶液。

将 aros 溶液加热至 70 摄氏度以上后再进行分装。取 40 微升该溶液加入 96 孔板的每个孔中，将 96 孔板在 37 摄氏度下孵育 1 小时。通过胰蛋白酶消化收获癌细胞，并制备单细胞悬液，随后将细胞悬液稀释至每毫升含 1000 个细胞。取 100 微升该稀释液加入含有固化 aros 床的孔中。

将样品置于37摄氏度、5%CO2培养箱中的摇床上过夜孵育。孵育结束后，从摇床中取出样品，加入100微升细胞培养基，继续孵育所得类器官，直至达到目标直径。例如，培养九天后，一个类器官的直径约为450微米。

首先，在超净工作台内准备一个工作站，并放置两个2毫升小瓶。小瓶一用于盛装肿瘤类固醇，小瓶二作为无细胞对照。通过将两份羧基化修饰的1微米直径荧光示踪探针原液与25份无菌水混合，配制稀释后的探针混合液。

从冰箱中取出一瓶 3.1 毫克/毫升的牛胶原蛋白，置于冰上。取 125 微升胶原蛋白加入第 1 号小管中，随后加入 50 微升稀释的示踪探针溶液，涡旋混匀以充分分散探针。然后加入含酚红的适当细胞培养基 235 微升，总体积为 410 微升，短暂涡旋混匀后，取出 205 微升转移至第 2 号小管中。接下来，向小管中加入约 2 微升 1 摩尔的氢氧化钠溶液。

将溶液调回中性 pH 值后，短暂涡旋混匀。然后立即放回冰架，以防止混合物开始固化。轻柔地从含有肿瘤类固醇的孔中移除 40 µL 培养基。

进行下一步操作时保留这40微升液体。检查孔内类固醇是否已在上一步中去除。若未完全去除，则将40微升液体重新放回孔内，并重复上一步操作。

如果确认无误，将含有类固醇的40微升溶液加入小瓶中。在将混合物以每份60微升分装至96孔板的三个独立孔之前，轻轻搅拌小瓶一。加入混合物后，用显微镜检查每个孔，以确定哪个孔含有类固醇。然后向小瓶二中加入约2微升1摩尔氢氧化钠溶液和40微升细胞培养基，涡旋混匀后再进行分装。

取60微升该混合物加入96孔板的空孔中，并标记为无细胞对照。将96孔板放入37摄氏度的培养箱中孵育至少一小时，以构建样本点阵列。首先，将孵育后的样本板从培养箱转移至显微镜载物台上。

若无加热载物台，需让样品在室温下平衡10分钟。使用低倍物镜观察样品，确保其结构完整且适合成像。确定肿瘤在孔板中的位置，并通过透射光图像记录该位置，以便后续进行空间共定位。

通常，在每个孔中围绕S类球体呈同心圆环分布的20个采样点即可产生足够详细的实验结果。将显微镜载物台移动至每个目标位置，并使用显微镜配套软件记录XNY坐标。切换显微镜至高倍物镜，并为示踪探针的x激发波长选择合适的滤光立方块。

根据生成的点列表，移动到网格中的第一个点。在向上移动之前，先调整焦距以找到孔板的底部。寻找一个包含多个处于焦内示踪探针的视野。

观察强度直方图，并调整曝光强度和时间，以在确保图像不饱和的前提下获得尽可能大的动态范围。以每帧20至30毫秒的帧率获取视频序列，并按照适当的命名规则保存。记录过程中，切勿触碰显微镜或实验台。

对网格中的每个采样点重复进行记录。然后继续重复该过程，为实验中的每个孔构建相应的网格，并在纵向监测的整个持续时间内，对每个时间点重复完成全部流程。

开始数据分析。将所有视频数据复制到一个分析文件夹中。将图像数据导入 MATLAB 或其他分析软件。

通过分析视频的若干帧来校准软件，以适当确定用于识别探针中心位置的选择与排除参数。然后使用该软件自动确定所有视频帧中每个探针的位置，并将这些位置连接成轨迹。利用轨迹数据计算均方位移（MSD）随滞后时间的变化关系，务必应用针对特定物镜或任何像素二乘效应的适当空间校准因子。

使用广义斯托克斯-爱因斯坦关系计算G星，并考虑该关系对特定样品的适用范围。对实验中每个视野重复分析步骤。根据所用显微镜的制造商，将位置数据与特定感兴趣频率下的黏弹性模量I进行共定位。

可通过自定义程序辅助完成此步骤，该程序可读取显微镜的元数据，或可手动整理位置数据。在含有三维肿瘤结节的代表性孔内多个空间位置采集视频序列，并将其关联，以在纵向监测过程中提供样本的空间微尺度放射学图谱，揭示位于孔边缘的细胞群体。本示例中使用的某种类固醇将在数天内自发降解周围的胶原纤维，并侵入细胞外基质。

在此示例中，显微成像的共定位分析提供了定量读数，清晰显示类固醇左侧区域发生了基质侵袭，而右侧则无此现象。对这两个不同空间区域的纵向监测表明，伴随侵袭的发生，复数黏弹性剪切模量的实部下降了约四个数量级。图中展示了第4天时区域一和区域二材料流变学特性的完整频率依赖性数据对比。

在尝试本实验操作时，需注意避免在分析探针轨迹过程中出现常见错误，以免导致不恰当的结论。我们建议读者参考本文引用的单颗粒追踪（PTM）相关文献，其中讨论了诸如样品漂移和异质性解读等问题。本实验方法可与其他纵向或终点荧光成像技术结合使用，以回答其他科学问题，例如机械重塑如何与关键信号事件相关联，或细胞对干预措施的细胞毒性反应如何变化。