细胞外基质刚性三维肿瘤模型的纵向测量用粒子跟踪Microrheology
June 10th, 2014
粒子跟踪microrheology可用于非破坏性的量化和空间映射的变化在三维肿瘤模型中的细胞外基质的机械性能。
该程序的总体目标是测量三维癌症模型中细胞外基质机械特性的纵向变化。这是通过首先收获癌细胞并通过适当的方法培养肿瘤类固醇直到它们达到所需的大小来实现的。第二步是将肿瘤类固醇嵌入胶原蛋白或其他适当的细胞外基质中。
接下来，构建采样点网格，并在每个点拍摄视频。最后一步是分析视频数据，并计算和共注册每个空间点的实数逻辑属性。最终，该协议使用示踪探针轨迹的分析以非破坏性方式纵向量化细胞外基质力学的空间变化。
这个想法是，通过将基于成像的细胞外基质放射学测量与体外 3D 肿瘤模型相结合，恢复细胞外基质相互作用，这种方法可以定量地了解伴随肿瘤生长侵袭过程和对治疗的反应的机械微环境中的时间依赖性变化。本视频中展示的方法采用 aros 叠加方法，从已建立的胰腺癌细胞系 pan one 生成非粘附的 3D OID。首先，将 10 毫升细胞培养级水与 0.1 克 aros 混合，以获得 1%aros 溶液。
在阿里之前将 aros 溶液加热到 70 摄氏度以上。将 40 微升溶液加入 96 孔板的每个孔中，在 37 摄氏度下孵育板 1 小时，通过胰蛋白酶收获癌细胞并制备单细胞悬液，然后将细胞悬液稀释至每毫升 1000 个细胞。将 100 微升这种稀释液添加到含有固化的 aros 床的孔中。
孵育后，将样品放在摇床上，在设定为 37 摄氏度和 5% CO2 的培养箱中过夜。从摇床中取出样品，加入 100 μL 细胞培养基，继续孵育所得类固醇，直至达到所需的直径。例如，9 天后，一个 pan 一个类固醇的直径约为 450 微米。
首先，在层流罩内准备一个工作站，里面有两个 2 毫升的小瓶。小瓶 1 将包含肿瘤类固醇，小瓶 2 将包含无细胞对照。通过将两份储备探针添加到 25 份无菌水中，制备羧酸盐修饰的 1 微米直径荧光示踪探针的稀释混合物。
从冰箱中取出一瓶每毫升 3.1 毫克的牛胶原蛋白，将其放在冰上，将 125 微升胶原蛋白等分，然后将 50 微升稀释的示踪剂探针溶液短暂放入一个小瓶中，涡旋短暂以分散探针。然后加入 235 微升含有酚红的适当细胞培养基，总体积为 410 微升，短暂涡旋，然后取出 205 微升并将其放入 2 号样品瓶中。接下来，向小瓶中加入大约 2 微升 1 摩尔氢氧化钠。
一种是将溶液短暂地恢复到中性 pH 值涡旋中混合。然后立即返回冰架，以免混合物开始固化。从含有肿瘤类固醇的孔中轻轻去除 40 微升培养基。
在进行下一步时保留这 40 微升。检查孔，看看上一步是否去除了类固醇。如果没有，请将 40 μL 放回孔中并重复上一步。
如果是，则将含有类固醇的 40 μL 加入小瓶中。轻轻搅拌小瓶，将 60 微升的混合物转移到 96 孔板的三个独立孔中之前，先搅拌一个小瓶，加入混合物后用显微镜检查每个孔，以确定哪个孔中含有类固醇。然后将大约 2 微升 1 摩尔氢氧化钠和 40 微升细胞培养基加入 2 号样品瓶中，并在 Ali 之前涡旋。
将 60 微升这种混合物引用到 96 孔板中的空孔中，并将其标记为无细胞对照。将板放入 37 摄氏度的培养箱中固化至少一小时，以构建样品点网格。首先，将样品板从培养箱转移到显微镜载物台。
如果没有加热样品台，请等待 10 分钟，让样品平衡至室温。使用低倍物镜观察样品，以确保其完好无损并准备好进行成像。确定孔内的肿瘤位置，并用透射光图像记录下来，以便随后进行空间共配准。
通常，每个孔中的 20 个样品点分布在 S 球体周围的同心环中，将产生足够详细的结果。将载物台移动到每个所需位置，并使用显微镜接口软件记录 XNY 坐标。将显微镜切换到高功率物镜，并为示踪剂探针的 x 引文波长选择合适的滤光片立方体。
使用已创建点的列表，移动到网格中的第一个点。在向上移动之前，调整焦距以找到井底。查找包含多个焦点示踪剂探针的视野。
观察强度直方图并调整曝光强度和时间，以提供尽可能大的动态范围，同时确保图像不会饱和。以每帧 20 到 30 毫秒的帧速率获取视频序列，并使用适当的命名约定进行保存。在记录过程中，请勿触摸显微镜或工作台。
对网格中的每个采样点重复录制。然后继续重复该过程，为实验中的每个孔构建一个网格，并每次重复整个过程。点在纵向监测的持续时间上。
开始数据分析。将所有视频数据复制到分析文件夹。将图像数据导入 MATLAB 或其他分析软件。
通过分析视频的多个帧来校准软件，以适当确定用于识别探针中心位置的选择和抑制参数。然后使用该软件自动确定所有视频帧的每个探针位置，然后将这些位置链接到轨迹中。使用轨迹数据计算均方位移或 MSD 作为滞后时间的函数，确保为特定物镜或任何像素弯曲应用适当的空间校准因子。
使用广义斯托克斯爱因斯坦关系计算 G 星，同时考虑广义斯托克斯爱因斯坦关系对特定样本的适用性限制。对实验中的每个视野重复分析步骤。使用粘弹性模块 I 以特定的感兴趣频率对位置数据进行配准，具体取决于所用显微镜的制造商。
此步骤可以通过自定义例程进行，该例程可以读取显微镜元数据或手动将位置数据制成表格。在包含 3D 肿瘤结节的代表性孔内的多个空间位置采集视频序列，并在监测盘外围的纵向细胞群时链接以提供样品的空间微观放射学图。本例中使用的一种类固醇会在几天内自发降解周围的胶原纤维并侵入细胞外基质。
在这个例子中，微观学的共配准提供了对基质的明显侵袭的定量读数，发生在类固醇的左侧，而不是类固醇的右侧。对这些不同空间区域的纵向监测表明，伴随着侵入，复粘弹性剪切模量的实际分量下降了大约四个数量级。在第 4 天，区域 1 和区域 2 中材料的神学特性形成对比。
在尝试此过程时，请务必记住，在分析探针轨迹时必须注意避免导致不适当结论的常见陷阱。我们鼓励读者参考本文引用的 PTM 文献，其中涉及样品漂移和异质性解释等考虑因素。该程序可以与其他纵向或末端荧光成像相结合，以回答其他问题，例如机械重塑如何与关键信号事件或对干预的细胞毒性反应相关。
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概述
本文讨论了使用粒子追踪微流变法测量三维癌症模型中细胞外基质机械性质变化的程序。该方法允许对肿瘤力学进行无损分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 癌症研究
背景
- 了解细胞外基质的机械性质对于癌症研究至关重要。
- 3D肿瘤模型提供了体内条件的更准确表现。
- 粒子追踪微流变法是一种能够进行详细机械分析的技术。
- 本研究旨在增强对肿瘤微环境的理解。
研究目的
- 测量细胞外基质机械性质的纵向变化。
- 利用无损方法分析肿瘤力学。
- 提供对癌症进展动态的洞察。
使用的方法
- 收集癌细胞并培养肿瘤模型。
- 将肿瘤模型嵌入胶原或其他细胞外基质中。
- 为分析构建样本点网格。
- 在每个样本点记录视频数据以供进一步分析。
主要结果
- 成功测量3D肿瘤模型中的机械性质。
- 量化细胞外基质力学的空间变化。
- 展示了该方法的无损性质。
- 洞察肿瘤生长与机械性质之间的关系。
结论
- 粒子追踪微流变法适用于研究肿瘤力学。
- 该方法提供了理解癌症进展的宝贵数据。
- 未来应用可能增强肿瘤学中的治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
Longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3D tumor models enables biopharma R&D to quantify time-dependent biomechanical changes that influence tumor growth, invasion, and therapeutic response. Particle-tracking microrheology provides non-destructive, spatially resolved viscoelastic data that supports mechanistic de-risking of stromal targets and predictive modeling of stromal-tumor interactions. This approach enhances target validation by linking matrix remodeling to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tumor-stroma mechanical crosstalk to validate stromal targets involved in invasion and resistance.
- Operational Value: Provides quantitative, longitudinal readouts of matrix stiffening or softening to de-risk hypotheses about ECM-modulating agents.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates spatially mapped shear modulus data (G*) that correlate with localized invasion phenotypes for assay benchmarking.
- Operational Value: Uses 96-well plate format compatible with high-throughput imaging and downstream therapeutic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by capturing inverse remodeling—tumor-induced ECM changes—in pancreatic cancer models.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical work by enabling correlation of mechanical phenotypes with molecular or therapeutic interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by providing biomechanical context for stromal-targeted therapies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of stromal mechanisms by quantifying matrix changes in 3D co-culture models.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, reproducible microrheology readouts across spatial grids in multiwell formats.
- Analytics: Delivers frequency-dependent viscoelastic outputs (G*) that allow quantitative comparison of ECM states under different conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by mapping mechanical remodeling to invasion phenotypes in longitudinal studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mechanophenotyping across stromal-rich tumor types beyond pancreatic cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in stromal target validation through direct measurement of ECM remodeling dynamics.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via calibrated probe trajectories and GSER-based analysis.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by de-risking stromal targets with biomechanical evidence of target engagement.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of agents targeting matrix-modifying pathways based on longitudinal mechanical response.
Implementation Considerations
- Expertise in particle-tracking microrheology, fluorescence microscopy, and viscoelastic data analysis.
- Instrumentation for high-speed video capture, spatial grid mapping, and MATLAB or equivalent trajectory analysis.
- Cross-team standardization of probe preparation, embedding protocols, and GSER parameter selection.
- Adaptation considerations for varying collagen concentrations, tumor models, and longitudinal timepoints.
- Practical limitations include avoiding probe sedimentation, ensuring proper pH neutralization, and minimizing stage drift during long-term imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:25
Culturing Tumor Spheroids
5:33
Construction of Sample Point Grid and Video Acquisition at Each Point
7:34
Video Data Analysis for Computation of Rheological Properties at Each Spatial Position
9:10
Results: Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models
10:26
Conclusion
2:54
Preparing 3D Tumor Spheroids Embedded in ECM-containing Tracer Probes
