使用胱天蛋白酶复分析，以确定细胞凋亡的下丘脑细胞模型
April 16th, 2014
多重分析可以提供有益的信息为基础的细胞机制，消除试剂和不必要的重复实验的浪费。我们在这里描述的多路胱天蛋白酶3/7活性测定法，使用荧光和发光为基础的方法，以确定在以下与棕榈酸的氧化挑战的体外模型中的下丘脑细胞活力。
本视频的总体目标是演示一种高通量多重检测，以确定通过 caspase 测量的细胞凋亡开始。三七。首先，下丘脑神经元受到凋亡诱导饱和脂肪酸棕榈酸的攻击。
然后在细胞凋亡开始后使用基于荧光的试剂和酶标仪测量神经元的细胞活力。将管腔底物 DEVD 添加到细胞中，它是被 caspase 3 裂解的氨基酸序列。该程序的最后一步是使用酶标仪测量发光以确定半胱天冬酶活性，该活性在正在凋亡的细胞中增加。
最终，可以在不到 5 到 6 小时的时间内获得每个活细胞的半胱天冬酶活性比率。96 孔规格。我们现有方法（如蛋白质印迹或裂解）的这种技术的主要优点是，这是一种快速、廉价的检测方法，可以直接测量多种孔形式的半胱天冬酶三七活性。
这种方法可以帮助回答该领域的关键问题，例如确定细胞凋亡的主要调节因子。该技术的实用之处在于这种多重检测可以用作评估细胞毒性和活力的准确方法。尽管该检测相当简单，但该方法的可视化演示至关重要，因为它将确保检测成功完成。
虽然这种方法可以提供对神经退行性疾病的见解，但它也可以应用于其他疾病和体外模型，例如癌症研究中使用的模型。不熟悉这种方法的个体将需要优化这项技术，因为终点依赖于细胞系和激动剂。Caspase three 7 活性是短暂的。
因此，根据细胞应激源的有效性，确定测定铸型碱活性的适当时间可能需要一些努力才能快速开始。在 37 摄氏度的水浴中解冻 12 个细胞。解冻后，轻轻地将细胞倒入 75 平方厘米的通气培养瓶中，加入 10 毫升温热的 delcos、改性 eagles、培养基或 DMEM，将培养瓶在 5% 二氧化碳培养箱中孵育过夜37°C。
24 小时后，吸出培养基并更换为新鲜培养基，细胞可以继续生长，直到生长 2 至 3 天后获得 70% 至 80% 的汇合度。要对细胞进行计数，首先将 DMEM 和一种 x 胰蛋白酶、EDTA 溶液加热至 37 摄氏度。从培养瓶中吸出培养基，并用无菌磷酸盐缓冲盐水洗涤两次。
加入 500 微升 tryin 溶液，然后在 37 摄氏度下孵育 2 到 5 分钟。使用刮刀将细胞从培养瓶中分离出来，并将细胞悬浮在 5 mL 培养基中。将细胞通过细胞过滤器放入干净的 50 ml 试管中。
可能需要多次使细胞通过过滤器，但在使用血细胞计数器种子计数细胞后，不要重复超过三次。每孔 6， 000 个细胞，在 96 孔透明底部黑色或白色壁板中，最终体积为 100 微升培养基， 将板在 5% 二氧化碳和 37 摄氏度下孵育 24 小时。将棕榈酸转移到无菌的 5 毫升玻璃瓶中，并溶解在 100% DMSO 中。
在 DMSO 中将棕榈酸储备液稀释 1 至 10 后，将其添加到 PREWARM DMEM 中，以获得 0.1 毫摩尔棕榈酸的最终工作浓度，用于对照培养基，加入与添加到含有棕榈酸的培养基中相同浓度的 DMSO。取出每个孔中的培养基，更换为 50 微升加或负抽动酸培养基，并在 5% 二氧化碳和 37 摄氏度下孵育板 2 小时。然后加入 5 微升树脂试剂，孵育后在室温下孵育 10 分钟，将板加载到多功能酶标仪上，并记录 560 纳米激发波长和 590 纳米发射波长的荧光。
为了测量细胞依赖性，结果以同一板的相对荧光单位表示。加入 55 μL DEVD 灌注试剂，在室温下孵育 2 小时。再次使用酶标仪记录发光来测量半胱天冬酶 3 7 活性结果表示为相对发光单位，发光与 caspase 3 7 成正比，使半胱天冬酶 3 7 活性与细胞计数正常化，将细胞活力除以 caspase 3 7 活性。
该方案描述了多重两种单独测定的结果，以确定细胞凋亡导致细胞死亡的机制。在用棕榈酸攻击的细胞中，半胱天冬酶活性显著增加。孵育 2 小时后，在棕榈酸存在下，细胞膜完整性发生明显改变。
这里显示的是棕榈酸诱导细胞凋亡的潜在途径。了解用于诱导细胞凋亡的压力源的潜在机制有助于确定压力源孵育的时间长度。由于半胱天冬酶在与 DEVD 底物相互作用之前必须被激活，一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在不到五到六个小时的时间内完成。
观看此视频后，您应该对如何使用体外下丘脑神经元细胞培养模型进行多重半胱天冬酶 3 7 活性测定有很好的了解。在尝试此程序时，请务必记住，孵育时间取决于细胞类型和所使用的压力源或激动剂。该技术的发展使神经科学领域的研究人员能够使用可靠且省时的技术进行凋亡研究 按照此程序，可以进行针对凋亡过程中特定蛋白质的额外药理学测定，以描述引发退行性疾病的潜在机制。
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概述
本文介绍了一种多重caspase-3/7活性测定法，用于评估棕榈酸诱导的氧化应激后下丘脑神经元的细胞活力。该测定法利用荧光和发光方法提供关于细胞凋亡机制的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 细胞凋亡研究
背景
- 理解细胞凋亡对于研究神经退行性疾病至关重要。
- 多重测定可以提高实验效率并减少试剂浪费。
- Caspase-3/7是细胞凋亡的关键标记物。
- 棕榈酸被认为会在神经元中诱导氧化应激。
研究目的
- 展示一种用于测量细胞凋亡的高产出多重测定法。
- 评估棕榈酸对下丘脑神经元活力的影响。
- 提供一种可靠的方法来评估体外caspase活性。
使用的方法
- 下丘脑神经元暴露于棕榈酸以诱导细胞凋亡。
- 使用基于荧光的试剂测量细胞活力。
- 加入发光底物DEVD以检测caspase活性。
- 使用微孔板读取器测量荧光和发光。
主要结果
- 在受棕榈酸影响的神经元中观察到caspase活性增加。
- 多重测定法有效地区分活细胞和凋亡细胞。
- 荧光和发光方法提供了互补的数据。
- 该测定法展示了高通量细胞凋亡研究的能力。
结论
- 多重caspase-3/7测定法是研究细胞凋亡的有价值工具。
- 这种方法可以简化实验并减少试剂成本。
- 研究结果有助于理解神经退行性的细胞机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
Multiplexed caspase-3/7 and viability assays enable rapid, quantitative assessment of apoptosis in neuronal cell models, supporting early-stage neurodegeneration research and mechanistic de-risking. This approach streamlines discovery workflows by reducing experimental redundancy and providing internal controls, enhancing predictive confidence in target validation and cytotoxicity studies. The method's scalability and throughput are directly relevant for portfolio triage and translational research continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of apoptosis via caspase-3/7 activity in response to defined stressors.
- Supports mechanistic de-risking by linking cellular viability to apoptotic pathway activation.
- Facilitates rapid hypothesis testing for modulators of neuronal apoptosis.
- Provides internal normalization, increasing confidence in target engagement data.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, multiplexed readouts for both cell viability and apoptosis in a single workflow.
- Improves assay reproducibility and standardization across 96-well formats.
- Enables high-throughput screening of compounds affecting apoptotic pathways.
- Reduces reagent waste and experimental time compared to sequential single-parameter assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro apoptosis measurements with disease-relevant neurodegeneration models.
- Supports continuity from early discovery to preclinical validation of neuroprotective strategies.
- Provides a platform for pharmacological interrogation of apoptotic mechanisms in neuronal systems.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative apoptotic response data.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplex assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid, quantitative apoptosis assessment in neuronal models following defined challenges.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of apoptotic pathways and stressor effects.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in high-throughput formats.
- Analytics: Generates normalized caspase activity per viable cell, facilitating direct comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant neurodegeneration models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for apoptosis and viability assessment across diverse cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in apoptosis-related target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Standardizes apoptosis and viability measurements, reducing hands-on time and reagent use.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in neurodegeneration portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroprotective and cytotoxicity programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal cell culture and apoptosis assay optimization.
- Needs access to multimode microplate readers for fluorescence and luminescence detection.
- Demands cross-team standardization of incubation times and stressor concentrations.
- Assay endpoints are cell line and agonist dependent, requiring initial optimization for new models.
- Transient nature of caspase activity necessitates precise timing for accurate measurement.
