Name: 使用胱天蛋白酶复分析，以确定细胞凋亡的下丘脑细胞模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T15:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学习使用多重胱天蛋白酶-3/7活性检测法评估下丘脑神经元的细胞凋亡。该方法结合荧光与化学发光技术，可在五至六小时内快速测定细胞活力与凋亡水平，为神经退行性疾病研究提供高效可靠的技术手段。

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本研究工作由美国退伍军人事务部生物医学实验室研究与开发项目（BX001686-1A1）和退伍军人事务部康复研究与开发项目资助。

1. 细胞培养的铺板与维持
<ol>
	<li>将杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养液（DMEM + 10% 胎牛血清 + 1% 青霉素/链霉素/新霉素）预热至 37 °C。</li>
	<li>从 -80 °C 取出冻存的 A12 细胞储备液。</li>
	<li>在 37 °C 水浴中快速解冻细胞；解冻后，轻轻吹打混匀，将细胞转移至一个 75 cm2 透气培养瓶中，并加入 10 ml 培养液。</li>
	<li>将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 培养箱中过夜培养。24 小时后吸除旧培养液，更换新鲜培养液。继续培养细胞，直至细胞融合度达到 70–80%（培养 2–3 天）。</li>
</ol>
2. 细胞计数与接种
<ol>
	<li>将DMEM和1×胰蛋白酶-EDTA溶液预热至37 °C。</li>
	<li>吸除细胞培养基，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。</li>
	<li>加入500 μl胰蛋白酶溶液，于37 °C孵育2–5分钟。</li>
	<li>使用细胞刮刀将细胞从培养瓶上刮下，并将细胞悬液转移至5 ml培养基中。将细胞悬液通过滤网过滤，并收集至一个洁净的50 ml离心管中。可根据需要多次过滤细胞，但重复次数不得超过三次。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，以确定接种密度，使每孔最终含有6,000个细胞，接种于96孔透明底、黑色或白色侧壁的培养板中，每孔培养基终体积为100 μl。将培养板置于含5% CO2的环境中，于37 °C孵育24小时。</li>
</ol>
3. 确定细胞活力和Caspase-3/7活性
<ol>
	<li>将棕榈酸（PA）转移至无菌的5 ml玻璃小瓶中，用100%二甲基亚砜（DMSO）溶解。用DMSO将PA储备液按1:10稀释，然后加入预热的DMEM培养基中，得到终工作浓度为0.1 mM的PA。对照组培养基中加入与含PA培养基相同浓度的DMSO。</li>
	<li>吸除每个孔中的培养基，更换为50 μl含或不含PA的培养基。在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。然后加入5 μl刃天青（resazurin）试剂，在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>使用多功能微孔板读板仪记录荧光（激发波长560EX/发射波长590EM），以检测细胞活力。结果以相对荧光单位（RFU）表示。</li>
	<li>向同一块板中加入55 μl半胱天冬酶（caspase）检测试剂，在室温下孵育2小时。</li>
	<li>再次使用微孔板读板仪记录发光值，以检测caspase-3/7活性。结果以相对发光单位（RLU）表示，发光信号强度与caspase-3/7活性成正比。</li>
	<li>为将caspase-3/7活性标准化为细胞数量，用细胞活力（RFU）除以caspase-3/7活性（RLU）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

多重检测是一种广为接受的技术，已被科学家广泛应用于多种领域，如PCR微阵列、免疫检测及其他基于蛋白质的检测方法13,14近年来，多重检测技术在 体外 基于培养板的实验，并已被验证为评估细胞毒性和细胞活力的准确方法12在上述方案中，我们展示了联合使用荧光和发光检测方法在棕榈酸（PA）刺激后测定A12细胞中caspase-3/7活性和细胞活力的有效性。细胞活力在PA初始损伤后10分钟内测定，从而快速、可靠地反映活细胞数量。需要注意的是，基于刃天青（resazurin）的试剂是一种活细胞检测方法，允许后续进行其他终点检测；然而，优化孵育时间以测定caspase-3/7活性对于获得可用结果至关重要。15.
细胞凋亡可由外部刺激、细胞内信号以及表面受体激活，从而引发一系列特定的形态学和生化事件。caspase 3 活性升高、DNA 片段化、细胞膜完整性丧失、染色质浓缩以及多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的切割等，均为可检测的细胞凋亡特异性标志物16<...

富含饱和脂肪酸（如棕榈酸，PA）的饮食与肥胖及其他共病（包括心血管疾病和糖尿病）相关联1,2高脂饮食还被证明会增加下丘脑的氧化应激、细胞凋亡和神经元变性，而下丘脑是食欲和能量消耗的重要调节中枢3-7因此，了解高脂饮食暴露诱导下丘脑功能紊乱的机制，对于开发治疗肥胖的药物疗法具有重要意义。然而，饮食脂肪影响神经元功能的细胞机制仍不明确。深入理解棕榈酸（PA）等脂肪如何触发下丘脑凋亡通路的启动，是实现这一目标的必要第一步。本文旨在介绍一种多重检测方法，用于 体外 用于下丘脑神经退行性变研究的神经元对PA暴露反应的检测方法。我们提供了一种详细的描述 体外 96孔多重检测法用于测定经棕榈酸氧化应激处理后分化永生化成年小鼠下丘脑细胞系（A12）中caspase 3/7活性与总细胞数的比值8.
简而言之，细胞活力通过基于刃天青（resazurin）的检测方法在PA刺激后进行测定。刃天青是一种可渗透细胞的化合物，可在代谢活跃的细胞内发生酶促还原反应，该过程被认为主要通过线粒体完成9。活细胞持续将刃天青转化为试卤灵（resorufin），产生与活细胞数量成正比的荧光信号。随后使用基于DEVD的发光法检测caspase-3/7活性。DEVD是一种氨基酸序列（Asp-Glu-Val-Asp），可被caspase-3切割。当该序列与发光物质偶联时，细胞内caspase-3/7被激活并切割DEVD底物后，便会释放出发光产物。该反应的发光强度与caspase活性成正比，因而可反映细胞凋亡的诱导程度。由于死亡细胞无法产生caspase，caspase-3/7活性本质上是短暂的；因此，检测应在刺激后30分钟至4小时之间完成，具体时间取决于细胞应激原的有效性。细胞活力与caspase-3/7活性呈负相关，可用于判断细胞死亡机制。例如，此前已有研究利用该方法证明，预先使用神经肽类激素食欲素（orexin）处理，可减少过氧化氢刺激下下丘脑细胞的凋亡，提示该处理所影响的机制在抵御氧化损伤中具有重要作用10。需要注意的是，这些检测方法依赖于线粒体活性以还原检测试剂，因此其结果具有细胞系和组织特异性。本方案已针对成年小鼠下丘脑（A12）细胞优化，但所述方法可根据类似研究的需求进行调整。
从单个培养孔中进行多重检测，相较于传统的逐一开展单个检测方法具有多项优势。除了节省时间、细胞样本和培养试剂外，多重检测还能提供有关细胞存活与死亡的信息，提供内部对照，并避免重复实验的需要11,12。
传统方法依赖于Western印迹或ELISA，这些方法虽然是可靠的检测手段，但成本较高且耗时较长（1-2天），尤其是在使用96孔板格式时。除去细胞培养所需时间，多重检测的总耗时不到3小时。尽管本实验方案已针对A12细胞进行了优化，但也可根据其他模型进行调整，同时需考虑可能影响细胞完整性的因素。该方案是否适用于一系列实验，取决于样本数量或实验条件的数量以及计划进行的下游实验。

<table><tbody><tr><td>成年小鼠下丘脑细胞系 mHypoA-1/2&amp;nbsp;</td><td>Cellutions Biosystems Inc.</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 修饰 Eagle&amp;rsquo;s 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>棕榈酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; PrestoBlue 细胞活力检测试剂</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G8091</td><td></td></tr><tr><td>96 孔光学底板，黑色聚苯乙烯，细胞培养处理，带盖，无菌</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 多功能微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用caspase多重检测法确定下丘脑细胞模型中的凋亡

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

多重检测技术在复杂细胞机制研究中的应用能够避免重复实验，提供内部对照，并减少成本与试剂的浪费。本文介绍了一种多重检测方法的优化过程，用于评估棕榈酸（PA）刺激后细胞的凋亡情况。 体外 下丘脑模型，采用基于荧光和发光的检测方法，在96孔微孔板体系中测量活细胞数量和caspase-3/7活性。经棕榈酸（PA）处理后，通过基于刃天青的荧光法测定活细胞数量。随后使用发光底物DEVD检测caspase-3/7活性，并根据细胞数量进行归一化处理。该多重检测方法可用于评估在凋亡刺激（如饱和脂肪酸处理）后caspase活性的变化。饱和脂肪酸PA可增加下丘脑的氧化应激和细胞凋亡，提示此类检测方法在研究饱和脂肪酸与神经元功能关系中的潜在重要性。

上述方案描述了通过多重检测两种独立实验来确定细胞死亡机制的结果。图1展示了用于测定细胞活力和caspase-3/7活性的方案概览。在用PA处理2小时后，细胞中的caspase活性显著升高（图2A和表1）。细胞膜完整性的丧失是细胞凋亡诱导相关的形态学变化，在PA暴露2小时后的细胞中可明显观察到（图2B）。图3概述了PA诱导细胞凋亡的潜在通路，并说明了优化DEVD试剂孵育时间的重要性。
<img alt="荧光和化学发光检测、刃天青/DEVD试剂、酶标仪、实验流程图。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51305/51305fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"...

多重检测可为细胞基本机制提供有益信息&#160;并减少试剂浪费和不必要的重复实验。本文介绍一种多重caspase-3/7活性检测方法，采用基于荧光和发光的技术，用于测定细胞活力 体外 棕榈酸氧化应激后的下丘脑模型。

利用Caspase多重检测法确定下丘脑细胞模型中的凋亡

多重检测技术在复杂细胞机制研究中的应用消除了重复实验的需要，提供了内部对照，并且……

本视频的总体目标是演示一种高通量多重检测方法，通过检测caspase-3/7来确定细胞凋亡的起始。首先，下丘脑神经元受到促凋亡的饱和脂肪酸——棕榈酸的刺激。然后，在细胞凋亡启动后，使用基于荧光的试剂和酶标仪检测神经元的细胞活力。将化学发光底物DEVD（一种可被caspase-3切割的氨基酸序列）加入细胞中。该实验的最后一步是使用酶标仪检测发光信号，以确定caspase活性，该活性在发生凋亡的细胞中会升高。最终，可在不到五到六小时内获得每个活细胞的半胱天冬酶活性比率。采用96孔板格式。与现有的方法（如蛋白质印迹或细胞裂解法）相比，该技术的主要优势在于，它是一种快速且成本低廉的检测方法，可直接在多孔板体系中测量半胱天冬酶-3/7的活性。该方法有助于回答领域内的关键问题，例如确定细胞凋亡的主要调节因子。该技术的优势在于，这种多重检测可作为评估细胞毒性和细胞活力的准确方法。尽管该检测方法相对简单，但对该方法进行可视化演示至关重要，因为这将确保检测能够成功完成。尽管该方法可为神经退行性变研究提供见解，但也可应用于其他疾病及体外模型，例如癌症研究中所使用的模型。初次使用该方法的研究人员需要对该技术进行优化，因为其终点依赖于细胞系和激动剂。Caspase-3/7 活性是瞬时的。因此，根据细胞应激剂的效果，确定检测巨噬细胞活性的合适时间点可能需要一些摸索。为快速开始，将冻存的12个细胞在37摄氏度水浴中解冻。解冻后，将细胞轻柔地转移至一个75平方厘米的透气培养瓶中，并加入10毫升预热的DMEM（达尔伯克改良伊格尔培养基），在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育过夜。24 小时后，吸去培养基，并更换为新鲜培养基，继续培养细胞，直至培养 2 到 3 天后达到 70% 至 80% 的融合度。为计数细胞，首先将 DMEM 和 1× 胰蛋白酶-EDTA 溶液预热至 37 摄氏度。吸去培养瓶中的培养基，并用无菌磷酸盐缓冲液洗涤两次。加入 500 µL 的胰蛋白酶溶液，然后在 37 °C 下孵育 2 至 5 分钟。用细胞刮刀将细胞从培养瓶上刮下，并将细胞悬浮于 5 mL 培养基中。将细胞悬液经细胞滤器过滤至一个洁净的 50 mL 离心管中。可能需要将细胞多次通过滤网，但在使用血细胞计数板计数后，重复次数不得超过三次。在96孔透明底、黑色或白色侧壁的培养板中，每孔接种6,000个细胞，每孔终体积为100 µL培养基，于含5% CO₂、37°C条件下孵育24小时。将棕榈酸转移至无菌的5 mL玻璃小瓶中，并用100% DMSO溶解。将棕榈酸储备液用DMSO按1:10稀释后，加入预热的DMEM中，配制终浓度为0.1毫摩尔的棕榈酸工作液作为对照培养基；在不含棕榈酸的对照组培养基中，加入与含棕榈酸组等量的DMSO。吸除每孔中的原有培养基，更换为50微升含或不含棕榈酸的培养基，于5%二氧化碳、37摄氏度条件下孵育2小时。随后加入5微升树脂试剂，室温孵育10分钟。孵育结束后，将培养板放入多功能微孔板检测仪，于激发波长560纳米、发射波长590纳米条件下测定荧光信号。为了测量细胞活力，结果以同一块板中的相对荧光单位表示。加入55 µL的DEVD显色试剂，在室温下孵育两小时。再次使用微孔板读板仪记录发光值，以测量caspase-3/7活性，结果以相对发光单位表示，其中发光值与caspase-3/7活性成正比。为将caspase-3/7活性标准化至细胞数量，用细胞活力除以caspase-3/7活性。本方案描述了通过多重检测两种独立实验来确定细胞凋亡介导的细胞死亡机制的结果。在棕榈酸刺激下，细胞的半胱天冬酶（caspase）活性显著升高。经过两小时孵育后，棕榈酸存在条件下细胞膜完整性出现明显改变。此处展示的是棕榈酸诱导细胞凋亡的潜在通路。了解用于诱导细胞凋亡的应激因子的作用机制，有助于确定应激因子孵育所需的时间。由于Caspase酶必须在与DEVD底物相互作用之前被激活，一旦掌握该技术，若操作得当，可在不到五到六小时内完成。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用体外下丘脑神经元细胞培养模型进行多重caspase-3/7活性检测。在实施该实验流程时，需注意孵育时间会因细胞类型以及所使用的应激因素或激动剂的不同而有所变化。该技术的建立使神经科学领域的研究人员能够采用一种可靠且节省时间的方法来开展细胞凋亡相关研究。在完成本实验步骤后，可进一步开展针对细胞凋亡过程中特定蛋白的药理学检测，以阐明引发退行性疾病的根本机制。

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神经科学

使用胱天蛋白酶复分析，以确定细胞凋亡的下丘脑细胞模型

利用 NucView 488 caspase-3 底物对永生化 N19-少突胶质细胞培养物中 caspase-3...

通过活细胞成像和可裂解荧光染料底物监测永生化少突胶质细胞在钾离子诱导膜去极化后的活化半胱天冬酶-3活性及细胞凋亡

活化半胱天冬酶-3, 细胞凋亡, 永生化少突胶质细胞, 活细胞成像, 可裂解荧光底物, 膜去极化

本视频介绍了一种 体外 用于定量细胞死亡或凋亡的 Caspase-3/7 发光检测试剂盒。该检测通过 Caspase-3/7 对发光型 DEVD 底物的切割作用产生发光信号，所生成的发光强度与 Caspase-3/7...

Caspase-3/7 检测：一种基于发光法的检测技术，通过测定青蛙皮肤外植体中 Caspase-3/7 活性来定量凋亡

“anastasis”一词指的是濒死细胞在细胞自杀过程的晚期逆转该过程，自我修复并最终存活下来的现象。本文中，我们展示了检测和追踪经历anastasis细胞的实验方案。...

追踪复生现象的策略：一种逆转细胞凋亡的细胞存活现象

为了在整体动物中检测含有低水平半胱天冬酶（caspase）活性的健康细胞，研究人员为黑腹果蝇（Drosophila）开发了高灵敏度的生物传感器，命名为CaspaseTracker。在无死亡刺激条件下、经优化培养的成年动物体内各内脏器官的长寿健康细胞中，均可检测到依赖半胱天冬酶的生物传感器活性。...

体内 生物传感器追踪非凋亡性半胱天冬酶活性 果蝇

检测细胞回生现象在技术上具有挑战性 体内 因为经历细胞死亡逆转过程的细胞在形态上可能与正常的健康细胞难以区分。本文介绍了利用我们新开发的方法在活体动物中检测和追踪发生anastasis细胞的实验方案。 体内 CaspaseTracker...

检测细胞复苏 在体 内 通过CaspaseTracker生物传感器

本方案描述了半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）技术；这是一种基于成像的方法，可用于可视化诱导起始半胱天冬酶的邻近效应，这是其激活的第一步。...

利用双分子荧光互补技术揭示半胱天冬酶激活通路

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测量CD95死亡诱导信号复合物的组成及其复合物中前体caspase-8的加工过程

本文介绍了一种详细的免疫组织化学实验方案，用于在复杂组织中识别、验证和靶向具有功能相关性的半胱天冬酶（caspases）。...

视网膜组织中免疫染色Caspase-9的定量分析

本方案描述了一种全面的方法，用于检测在两种刺激条件下caspase激活（caspase-1、caspase-3、caspase-7、caspase-8、caspase-9 和 caspase-11）的反应 体外 和 体内...

评估半胱天冬酶激活以检测天然免疫细胞死亡

本实验方案描述了两种通过荧光底物结合流式细胞术或荧光分光光度计来检测caspase活性的方法。...

使用荧光定量法或流式细胞术检测Caspase活性

学习使用多重胱天蛋白酶-3/7活性检测法评估下丘脑神经元的细胞凋亡。该方法结合荧光与化学发光技术，可在五至六小时内快速测定细胞活力与凋亡水平，为神经退行性疾病研究提供高效可靠的技术手段。

利用Caspase多重检测法确定下丘脑细胞模型中的凋亡

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