利用Caspase多重检测法确定下丘脑细胞模型中的凋亡

本视频的总体目标是展示一种高通量多重检测方法，用于通过检测caspase-3/7来确定细胞凋亡的起始。首先，下丘脑神经元受到促凋亡的饱和脂肪酸——棕榈酸的刺激。

然后，在凋亡发生后，使用基于荧光的试剂和酶标仪检测神经元的细胞活力。将化学发光底物DEVD（一种可被caspase-3切割的氨基酸序列）加入细胞中。该实验的最后一步是使用酶标仪检测发光信号，以确定caspase活性，该活性在发生凋亡的细胞中会升高。

最终，可在不到五到六小时内获得每个活细胞的半胱天冬酶活性比率。采用96孔板格式。与现有的方法（如蛋白质印迹或细胞裂解法）相比，该技术的主要优势在于，它是一种快速、经济的检测方法，可直接在多孔板体系中测量caspase-3/7的活性。

该方法有助于回答领域内的关键问题，例如确定细胞凋亡的主要调节因子。该技术的优势在于，这种多重检测可作为评估细胞毒性和细胞活力的准确方法。尽管该检测方法相对简单，但对该方法进行可视化演示至关重要，因为它可确保检测成功完成。

尽管该方法可为神经退行性变提供研究思路，但也可应用于其他疾病及体外模型，例如癌症研究中所使用的模型。初次使用该方法的研究人员需要对该技术进行优化，因为其检测终点依赖于细胞系和激动剂。Caspase 3/7 活性是瞬时的。

因此，根据细胞应激剂的效果，确定检测微核基础活性的合适时间点可能需要进行一些摸索。首先快速操作：在37°C水浴中解冻冻存的12细胞。解冻后，轻柔地将细胞转移至一个75 cm²透气培养瓶中，并加入10 mL预温的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。将培养瓶置于37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育过夜。

24小时后，吸去培养基，更换新鲜培养基，继续培养细胞，直至培养2至3天后达到70%至80%的融合度。为计数细胞，首先将DMEM和1×胰蛋白酶-EDTA溶液预热至37摄氏度。吸去培养瓶中的培养基，并用无菌磷酸盐缓冲液洗涤两次。

加入 500 µL 胰蛋白酶溶液，于 37 °C 孵育 2 至 5 分钟。使用细胞刮刀将细胞从培养瓶上刮下，并将细胞悬浮于 5 mL 培养基中。将细胞悬液通过细胞滤网转移至一个干净的 50 mL 离心管中。

可能需要将细胞多次过筛，但在使用血细胞计数板计数后，不得超过三次。以每孔6,000个细胞接种于96孔透明底、黑色或白色侧壁的培养板中，每孔培养液体积为100 µL，将培养板置于含5% CO₂、37°C的培养箱中孵育24小时。将棕榈酸转移至无菌的5 mL玻璃小瓶中，并用100% DMSO溶解。

将棕榈酸储备液用DMSO按1:10稀释后，加入预热的DMEM中，使棕榈酸在对照培养基中的终工作浓度为0.1毫摩尔；在不含棕榈酸的培养基中加入与含棕榈酸培养基等量的DMSO。吸去每孔中的培养基，更换为50微升含或不含棕榈酸的培养基，于5%二氧化碳、37摄氏度条件下孵育2小时。随后加入5微升树脂试剂，在室温下继续孵育10分钟。孵育结束后，将培养板置于多功能酶标仪中，于激发波长560纳米、发射波长590纳米条件下测定荧光信号。

为了测量细胞存活力，结果以相对于同一块板的相对荧光单位表示。加入55微升DEVD显色试剂，在室温下孵育两小时。再次使用酶标仪记录发光信号，以测量caspase-3/7活性，结果以相对发光单位表示，其中发光信号与caspase-3/7活性成正比。为了将caspase-3/7活性标准化为细胞数量，需将细胞存活力除以caspase-3/7活性。

本方案描述了通过多重检测两种独立实验来确定细胞凋亡死亡机制的结果。在棕榈酸刺激下，细胞的Caspase活性显著升高。经过两小时孵育后，棕榈酸存在条件下细胞膜完整性出现明显改变。

此处展示的是棕榈酸诱导细胞凋亡的潜在通路。了解用于诱导细胞凋亡的应激因子的作用机制，有助于确定应激因子孵育时间的长短。由于胱天蛋白酶（caspase）必须在与DEVD底物相互作用之前被激活，因此一旦掌握该技术，若操作得当，可在不到五到六小时内完成。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用体外下丘脑神经元细胞培养模型进行多重caspase-3/7活性检测。在实施该实验操作时，需注意孵育时间会因所使用的细胞类型以及施加的应激因素或激动剂而有所不同。该技术的建立使神经科学领域的研究人员能够采用一种可靠且节省时间的方法开展细胞凋亡相关研究。在完成本实验流程后，还可进一步开展针对细胞凋亡过程中特定蛋白的药理学检测，以阐明引发退行性疾病的相关分子机制。