利用Caspase多重检测法确定下丘脑细胞模型中的凋亡

本视频的总体目标是演示一种高通量多重检测方法，通过检测caspase-3/7来确定细胞凋亡的起始。首先，下丘脑神经元受到促凋亡的饱和脂肪酸——棕榈酸的刺激。

然后，在细胞凋亡启动后，使用基于荧光的试剂和酶标仪检测神经元的细胞活力。将化学发光底物DEVD（一种可被caspase-3切割的氨基酸序列）加入细胞中。该实验的最后一步是使用酶标仪检测发光信号，以确定caspase活性，该活性在发生凋亡的细胞中会升高。

最终，可在不到五到六小时内获得每个活细胞的半胱天冬酶活性比率。采用96孔板格式。与现有的方法（如蛋白质印迹或细胞裂解法）相比，该技术的主要优势在于，它是一种快速且成本低廉的检测方法，可直接在多孔板体系中测量半胱天冬酶-3/7的活性。

该方法有助于回答领域内的关键问题，例如确定细胞凋亡的主要调节因子。该技术的优势在于，这种多重检测可作为评估细胞毒性和细胞活力的准确方法。尽管该检测方法相对简单，但对该方法进行可视化演示至关重要，因为这将确保检测能够成功完成。

尽管该方法可为神经退行性变研究提供见解，但也可应用于其他疾病及体外模型，例如癌症研究中所使用的模型。初次使用该方法的研究人员需要对该技术进行优化，因为其终点依赖于细胞系和激动剂。Caspase-3/7 活性是瞬时的。

因此，根据细胞应激剂的效果，确定检测巨噬细胞活性的合适时间点可能需要一些摸索。为快速开始，将冻存的12个细胞在37摄氏度水浴中解冻。解冻后，将细胞轻柔地转移至一个75平方厘米的透气培养瓶中，并加入10毫升预热的DMEM（达尔伯克改良伊格尔培养基），在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育过夜。

24 小时后，吸去培养基，并更换为新鲜培养基，继续培养细胞，直至培养 2 到 3 天后达到 70% 至 80% 的融合度。为计数细胞，首先将 DMEM 和 1× 胰蛋白酶-EDTA 溶液预热至 37 摄氏度。吸去培养瓶中的培养基，并用无菌磷酸盐缓冲液洗涤两次。

加入 500 µL 的胰蛋白酶溶液，然后在 37 °C 下孵育 2 至 5 分钟。用细胞刮刀将细胞从培养瓶上刮下，并将细胞悬浮于 5 mL 培养基中。将细胞悬液经细胞滤器过滤至一个洁净的 50 mL 离心管中。

可能需要将细胞多次通过滤网，但在使用血细胞计数板计数后，重复次数不得超过三次。在96孔透明底、黑色或白色侧壁的培养板中，每孔接种6,000个细胞，每孔终体积为100 µL培养基，于含5% CO₂、37°C条件下孵育24小时。将棕榈酸转移至无菌的5 mL玻璃小瓶中，并用100% DMSO溶解。

将棕榈酸储备液用DMSO按1:10稀释后，加入预热的DMEM中，配制终浓度为0.1毫摩尔的棕榈酸工作液作为对照培养基；在不含棕榈酸的对照组培养基中，加入与含棕榈酸组等量的DMSO。吸除每孔中的原有培养基，更换为50微升含或不含棕榈酸的培养基，于5%二氧化碳、37摄氏度条件下孵育2小时。随后加入5微升树脂试剂，室温孵育10分钟。孵育结束后，将培养板放入多功能微孔板检测仪，于激发波长560纳米、发射波长590纳米条件下测定荧光信号。

为了测量细胞活力，结果以同一块板中的相对荧光单位表示。加入55 µL的DEVD显色试剂，在室温下孵育两小时。再次使用微孔板读板仪记录发光值，以测量caspase-3/7活性，结果以相对发光单位表示，其中发光值与caspase-3/7活性成正比。为将caspase-3/7活性标准化至细胞数量，用细胞活力除以caspase-3/7活性。

本方案描述了通过多重检测两种独立实验来确定细胞凋亡介导的细胞死亡机制的结果。在棕榈酸刺激下，细胞的半胱天冬酶（caspase）活性显著升高。经过两小时孵育后，棕榈酸存在条件下细胞膜完整性出现明显改变。

此处展示的是棕榈酸诱导细胞凋亡的潜在通路。了解用于诱导细胞凋亡的应激因子的作用机制，有助于确定应激因子孵育所需的时间。由于Caspase酶必须在与DEVD底物相互作用之前被激活，一旦掌握该技术，若操作得当，可在不到五到六小时内完成。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用体外下丘脑神经元细胞培养模型进行多重caspase-3/7活性检测。在实施该实验流程时，需注意孵育时间会因细胞类型以及所使用的应激因素或激动剂的不同而有所变化。该技术的建立使神经科学领域的研究人员能够采用一种可靠且节省时间的方法来开展细胞凋亡相关研究。在完成本实验步骤后，可进一步开展针对细胞凋亡过程中特定蛋白的药理学检测，以阐明引发退行性疾病的根本机制。