利用RNA干扰技术研究小鼠巨噬细胞的先天免疫反应

本实验的总体目标是利用RNA干扰技术研究候选基因对小鼠巨噬细胞固有免疫反应的影响。为此，将小鼠巨噬细胞系经胰蛋白酶消化后，与转染溶液及目的siRNA混合，随后将混合物转移至96孔核酸转染板中，使用Maxa 96孔转染系统将siRNA转入巨噬细胞。转染完成后，加入细胞培养基，并添加LPS或其他固有免疫激活剂处理转染后的巨噬细胞以诱导免疫刺激。最后，通过ELISA检测细胞因子的产生情况，评估siRNA处理对固有免疫反应的影响。

与脂质介导转染相比，该技术的主要优势在于我们的检测方法具有高度稳健性，可适用于高通量条件下多个基因的研究。本方法的关键在于使用状态良好的细胞，在转染过程中轻柔操作，并高效完成实验步骤。正如我们将要展示的，本方案使用了 RAW 264.7 小鼠巨噬细胞系，其培养方法详见配套文档中的描述。

在准备 INA 转染板时，将细胞以 20% 融合度接种，并培养一至两天，直至细胞融合度不超过 80%。需注意使用传代次数在第 3 代至第 10 代之间的细胞。解冻后，启动用于转染的 96 孔 Shuttle 系统，并对其进行程序设置。

为此操作，请从连接到穿梭仪的计算机左上角的文件菜单中启动 96 孔穿梭软件。选择新建参数文件。在显示的 96 孔板示意图上，选中将进行转染的孔位。

绿色方框将指示选定的孔。请选择与用于原始 2 64 0.7 细胞的巨噬细胞细胞系相对应的程序。选择 DS 1 36，然后选择应用。

请注意，选择程序后，示意图中的孔位将被着色。深蓝色空心圆圈表示尚未分配程序的孔位，这些孔位将不会施加电击。接下来，通过将 SF 细胞系 96 孔核转染试剂与所附补充剂管中的全部内容物混合，制备工作用核转染试剂溶液。

将混合试剂在室温下平衡。将 D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 和 PBS 在 37 摄氏度预热。通过在冰上解冻实验用 S-I-R-N-A-P max GFP 对照质粒或荧光标记的 siRNA，以从细胞培养皿中分离贴壁的巨噬细胞。

吸去培养基，用 10 毫升 PBS 洗涤细胞两次。去除 PBS 后，每孔加入 1 毫升预热的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，孵育至细胞开始脱落，通常需要 1 至 2 分钟。

轻轻敲击培养板并在孵育过程中移动溶液，以最大限度地促进胰蛋白酶消化作用。细胞脱落后，加入9毫升含FBS的DMEM培养基，用移液器轻轻吹打混匀，然后将细胞悬液转移至无菌离心管中。使用血细胞计数板对分离得到的巨噬细胞进行计数。

每个10厘米培养皿预计可获得约1000万个巨噬细胞。计算96孔电穿孔板每孔所需的巨噬细胞总数，每孔需要200,000个细胞。将计算好的细胞数量用移液器加入离心管中。

将细胞在室温下以150 × g离心10分钟，收集至无菌的96孔圆底板中，该板有助于混合并最大限度减少试剂损失。向每个转染孔中加入2 µL的每种siRNA。注意，根据siRNA的数量，此步骤可在巨噬细胞离心过程中同时完成。

该操作中最困难的部分是电穿孔，关键在于轻柔处理细胞并迅速操作。一旦细胞进入具有毒性的转染溶液中，需吸去离心后细胞的培养基，然后用核转染试剂溶液轻轻重悬细胞，SF 中含有补充溶液。

立即使用多通道移液器将细胞转移至无菌槽中，将重悬的细胞混合物各20微升加入含有siRNA的96孔板的每个孔中，通过上下吹打轻轻混匀。接着，将20微升细胞INA混合物转移至96孔核转染板中。此步骤中必须避免产生气泡，因为气泡可能在核转染过程中引起误差。

将所有实验样品放入转染板后，盖上配套的盖子，并在硬质表面上轻轻敲击。为去除气泡，将96孔板放入96孔核转染器小室中，在程序界面右下角选择上传并启动。随后根据程序提示，在核转染过程期间成功保存各孔的结果。

转染成功的孔将在屏幕上的96孔示意图中以带加号的绿色圆圈表示。带减号的红色圆圈表示出现错误，最可能的原因是在核转染后立即因气泡或加入试剂体积不准确所致。使用多通道移液器加入80微升预热的RPMI 1640培养基。

将培养基缓慢加入到每侧。让培养基缓慢与转染后的细胞混合，因为此阶段的细胞非常脆弱。若加入培养基过快，将显著降低细胞活力。

将含有转染样品和RPMI 1640的96孔板放入37°C、含5%CO2的培养箱中孵育两分钟或更长时间。在进行后续操作前，必须让细胞恢复，这一点至关重要。从培养箱中取出板子后，使用多通道移液器小心地将每孔中的混合物转移至96孔组织培养板中。

然后，再次使用多通道移液器，向每个孔中加入 100 µL 含 FBS 的 DMEM。转染后立即孵育 24 至 36 小时，随后进行恢复并执行流式细胞术分析。为评估荧光标记的 SI siRNA 的转染效率，转染后 24 小时内应有超过 99% 的细胞被成功转染；对于 GFP 质粒的转染效率，应有 30% 至 50% 的细胞表达 GFP。在 24 至 36 小时孵育结束后，将 LPS 或其他先天免疫激活剂用新鲜培养基配制，并将 LPS 稀释至含 FBS 的 DMEM 中，终浓度为 20 纳克/毫升。

然后小心吸去96孔板中的培养基，并向细胞中加入含有LPS的新鲜培养基。将该板置于培养箱中，于刺激后不同时间点监测细胞对LPS或其他固有免疫刺激物的反应。用移液器将细胞上清液转移至96孔储存板中，用于ELISA分析。

去除上清液以检测细胞活力后，向每个孔中加入100微升1:100的荧光素二乙酸盐（fluorescein diacetate）磷酸盐缓冲液（PBS），在室温下孵育1至5分钟。使用酶标仪检测细胞中的荧光，该荧光在活细胞内的细胞酯酶作用下被切割后产生。此化合物可发出荧光，以说明该方法在监测固有免疫反应中的实用性。

将靶向已知天然免疫调控基因的siRNA转染至RAW 264.7巨噬细胞系中。随后用LPS刺激细胞，并通过ELISA检测促炎细胞因子IL-6和TNF-α的产生，结果如图所示。

抑制Toll样受体4（LPS的受体），但不抑制其他TLR。使用SIR时，LPS诱导的IL-6和TNF-α的产生显著减少。注意，用irna抑制IL-6可降低IL-6的产生，但不影响TNF-α的产生。

这些数据表明，利用siRNA介导的干扰技术敲低先天免疫候选调控因子具有良好的效果和特异性。需要注意的是，实现良好转染和细胞高效复苏的关键在于使用状态极佳的细胞，在转染和复苏过程中轻柔处理细胞，并在细胞进入核效应溶液后迅速操作。按照本方案，可进一步开展多种其他检测，包括通过定量PCR（QPCR）监测基因敲低效率，以及多种用于研究先天免疫反应的其他实验。