前体mRNA底物的3'末端切割:用无细胞体系中的RNA加工反应分析在体外
May 3rd, 2014
RNA聚合酶II合成延伸超过所述成熟mRNA的3'末端的前体RNA。的成熟RNA的末端cotranscriptionally生成的，在由RNA序列决定的一个部位，通过裂解复合物的内切核酸酶的活性。在这里，我们详细研究裂解反应在体外的方法。
该程序的总体目标是在体外成功检查三个引物 mRNA 切割。这是通过首先从悬浮液中生长的细胞中制备具有转录活性的细胞核提取物来实现的。该程序的第二步是通过体外转录制备放射性标记的 RNA 底物。
第三步是凝胶纯化标记的 RNA 底物。最后一步是组装切割反应，包括核提取物和标记的 RNA 底物。最终，结果可以通过垂直放射性凝胶电泳显示三种引物 mRNA、UNC 裂解底物和裂解产物。
这种方法的视觉演示很重要，即使它自 1980 年代以来就已经执行，但它并不容易执行，因为整个过程中有许多具有挑战性的特定步骤。洗涤细胞，沉淀，准备裂解。要开始此方案到细胞沉淀中，请添加含有新鲜 DTT 的缓冲液。
加入 5 体积的估计 CPV，用移液管打碎沉淀，让悬浮液在冰上冷却。10 分钟后，在旋转桶中将细胞在 4 摄氏度下旋转。离心小心吸出上清液。
颗粒会吸收一些溶液并膨胀。然后加入一个 CPV 的缓冲液 A，并用移液器吸头轻轻打碎沉淀。将悬浮液倒入冷却的匀浆器中，用紧杵敲击细胞 5 到 12 次。
取出一小份等分试样，涂上 trian 蓝并检查细胞以确定其裂解的完整性。如果需要，继续匀浆细胞，直到它们裂解 90%，但不要过度。现在将裂解物转移到超透明超速离心管中。
记录总音量并像以前一样旋转它。吸出浑浊的上清液并将其保存在冰上。对于胞质溶胶分析，请注意不要干扰沉淀。
它包含细胞核。接下来，将颗粒高速旋转 15 分钟。除去少量剩余的上清液，并将其与胞质溶胶集合混合。
然后确定 PACT 核体积。向沉淀中加入相当于缓冲液 C 的体积。然后在干净的均质器中使用移液管去除沉淀。
使用 5 到 10 次紧杵敲击进行复苏。悬浮沉淀。将匀浆转移到冷冻管中，倒置混合 30 分钟。
在 4 摄氏度时，可以使用搅拌板。如果体积足够大，将裂解物转移到 UltraClear 超速离心管中，并在 4 摄氏度下旋转 30 分钟。在大约 25， 000 gs 时，上清液是核提取物。
按照文本方案，仅用 1 微克模板完成透析。使用具有 SP six 或 T 7 兼容启动子的试剂盒通过体外转录制备探针。加载页面时，对每种 RNA 底物使用 3 微升标记物和所有 25 微升反应物。
还可以通过隔开相似大小的转录本的泳道来防止交叉污染。运行凝胶，使 600 个核苷酸的探针在 25 瓦特后以 25 瓦运行约两个小时。要标记凝胶条带的位置，请用灯箱照亮曝光的胶片，然后将包裹好的凝胶放在上面。
将自动辐射标记与胶片上的曝光标记对齐。然后用黑色记号笔标记条带位置以去除条带，展开凝胶。用干净的刀片切除凝胶的条带部分，将每个部分转移到自己的试管中，并按照标准程序洗脱 RNA。
准备好所有试剂后，将标记的 RNA 加热至 80 摄氏度 2 分钟。然后将 RNA 转移到冰涡旋中，即 10% PVA，然后高速旋转几分钟以去除气泡，然后继续为每个反应制备预混液。对于每个反应，分配 5.25 微升预混液 1。
接下来，加入 6.25 微升细胞核提取物混合物。然后加入一微升稀释至 50 无摩尔的标记 RNA 底物。每个反应使用少于 5 个无摩尔标记的 RNA。
现在，轻轻涡旋并快速旋转反应混合物。让反应在 30 摄氏度下发生长达两个小时。采用反应的时间进程将提供最佳结果 使用蛋白酶 K 消化反应中的蛋白质，然后纯化反应 使用苯酚氯仿方法，以 6% 的页加载量、3 微升标记物或每个泳道每个反应产物 5 微升运行产物。
然后运行凝胶，然后小心地拆卸凝胶装置。要收集凝胶，请用力按压滤纸并将其翻转过来。用力按压玻璃杯，确保凝胶完全被滤纸夹住。
然后慢慢撕下附有凝胶的滤纸。用塑料包裹凝胶的外露面，然后将包装膜粘在另一面的滤纸上。最后将凝胶放入干燥器中 15 分钟，滤纸面向真空。
然后，通过将凝胶暴露于胶片或磷酸化成像仪中来分析凝胶。劈裂者。RNA 底物是凝胶顶部迁移最慢的条带。
用粗体箭头标记的特定裂解产物在预期大小的凝胶中以更快的速度运行。该产品在对照中不存在，但 pollier 序列中有一个点突变。使用 DS 度量图确定切割活性的定量。
将 cleaved 与 cleaved、标准化 RNA 的比率与切割的 RNA 对照进行比较。按照此程序，可以执行其他方法（如聚腺苷酸化测定）来回答其他问题，例如 polyA 聚合酶的活性。该测定是通过改变反应条件（例如添加镁和去除 EDTA）来完成的。
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概述
本研究集中于检测三个主要mRNA在体外切割，这是RNA成熟过程中的关键步骤。该方法使用转录活跃的核提取物和放射性标记的RNA底物来分析切割反应。
关键研究组成部分
科学领域
- RNA生物学
- 分子生物学
- 生物化学
背景
- RNA聚合酶II合成的前体RNA超出了成熟mRNA的3'端。
- 切割复合物决定了成熟RNA生成的位点。
- 共转录过程对RNA成熟至关重要。
- 理解切割反应可以提供RNA处理机制的见解。
研究目的
- 检测三个主要mRNA在体外切割。
- 了解核提取物在RNA处理中的作用。
- 使用凝胶电泳分析切割反应产物。
使用的方法
- 从悬浮培养的细胞中制备转录活跃的核提取物。
- 通过体外转录合成放射性标记的RNA底物。
- 通过凝胶纯化标记的RNA底物。
- 使用核提取物和标记的RNA底物组装切割反应。
主要结果
- 观察到三个主要mRNA底物的成功切割。
- 通过垂直放射性凝胶电泳分析结果。
- 鉴定了UNC切割的底物和切割产物。
- 该方法为研究RNA切割反应提供了框架。
结论
- 本研究概述了一种检测体外mRNA切割的可靠方法。
- 理解切割机制可以增进对RNA处理的认知。
- 研究结果为RNA生物学的更广泛领域做出贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding RNA 3' end processing is critical for target validation in RNA-based therapeutics, where precise transcript maturation influences protein expression levels and functional outcomes. This in vitro cleavage assay enables mechanistic de-risking by isolating the biochemical requirements for accurate pre-mRNA processing, supporting predictive confidence in target engagement. The method provides a quantitative, reproducible system to evaluate how genetic or pharmacological perturbations affect RNA stability and function, informing early discovery decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of RNA processing mechanisms to validate transcript-specific targets involved in gene expression regulation.
- Operational Value: Provides a controlled system to assess how mutations in polyadenylation signals affect cleavage efficiency and RNA stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of cleavage products to support assay standardization for screening modulators of RNA processing factors.
- Operational Value: Uses gel-based detection to ensure reproducibility and scalability across multiple RNA substrates and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by linking RNA processing defects to aberrant transcript isoforms observed in pathological states.
- Operational Value: Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation by defining biochemical thresholds for functional RNA maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, where RNA target validation precedes lead identification and preclinical evaluation by clarifying the functional impact of transcript processing on protein output.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of RNA regulatory elements and mechanistic de-risking of targets involved in mRNA maturation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized substrate preparation and quantitative product detection via gel electrophoresis.
- Analytics: Enables comparison of cleavage efficiency across conditions using normalized product-to-substrate ratios for data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical work by defining processing competence as a biomarker for RNA-based therapeutic suitability.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating RNA-targeting modalities across multiple programs and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in RNA target validation by reducing ambiguity in transcript processing mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized nuclear extract preparation and labeled substrate quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking RNA processing fidelity to expected protein expression and functional outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying targets with robust, regulatable RNA maturation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA biochemistry, and radioactive labeling techniques.
- Dependent on ultracentrifugation, gel electrophoresis, and autoradiography infrastructure for nuclear extract preparation and product detection.
- Necessitates cross-team standardization of substrate design, reaction conditions, and quantification methods to ensure comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to diverse RNA substrates or disease-relevant systems.
- Limited by the technical complexity of nuclear extract isolation and the need for careful optimization to avoid nonspecific degradation.
