Name: 前体mRNA底物的3末端切割:用无细胞体系中的RNA加工反应分析在体外 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学习利用无细胞体系分析前体mRNA的3'末端切割反应。该方法通过制备转录活性核提取物和放射性标记RNA底物，结合凝胶电泳技术，为研究RNA加工机制提供可靠框架。

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S.V. 感谢美国国立卫生研究院（NIH K22AI077353）和兰登贝格基金会提供的经费支持。K.R. 感谢美国国立卫生研究院（5SC1GM083754）提供的经费支持。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在HeLa细胞核提取物中或使用从这些提取物中分离的切割因子进行的体外前体mRNA 3’端切割反应，已使得核心切割因子及其主要复合物得以鉴定16-21。近年来又发现了许多与这些因子相关的蛋白质22，而体外反应仍有望进一步揭示这些蛋白质在反应中的作用机制。可能由于该反应在体内似乎是共转录进行的23，或由于某些参与因子在提取和透析过程中可能丢失，该反应效率通常较低，很少能达到30%以上的切割率。此外，反应效率可能在不同天之间无明显原因地突然下降。因此，明确哪些步骤最为关键至关重要，尤其是在尝试将该反应体系应用于经修饰或病毒感染的HeLa细胞、其他细胞类型或新型底物时。
毫无疑问，提取物的质量和新鲜度 体外 转录的RNA至关重要，因此必须在严格无RNase的条件下操作。细胞在收获提取时的健康状态同样重要。细胞应呈现良好的生长状态，倍增时间应少于24小时，处于或接近对数生长期，且死亡细胞或其他无法解释的碎片应极少。显然，细胞不应受到支原体或其他细菌的污染。...

大多数成熟的真核生物信使RNA（mRNA）的生物合成需要多种转录后修饰，例如加帽、剪接和多聚腺苷酸化。这些修饰通常相互偶联，以确保正确的加工过程1，并显著提高mRNA的稳定性。
哺乳动物前体mRNA的3’端形成是通过内切核酸酶对新生RNA进行切割，随后由多聚腺苷酸聚合酶（PAP）在5’端切割产物上添加腺苷酸残基而实现的2-4。在哺乳动物中，切割过程由一个约800 kDa的多组分蛋白质复合物完成，该复合物在特定的前体RNA序列上组装。多聚腺苷酸信号序列是一个高度保守的经典六核苷酸序列AAUAAA，可指导切割位点位于其下游约10–30个核苷酸处。该位点被切割与多聚腺苷酸化特异性因子（CPSF）特异性识别，其中CPSF的73 kD亚基含有内切核酸酶活性。切割刺激因子（CstF）则结合于多聚腺苷酸位点下游一段更为多变的富含GU或U的序列元件。哺乳动物切割因子I（CFIm）和哺乳动物切割因子II（CFII）也是切割所必需的。CFIm结合于上游序列元件（USEs）中特定的UGUA(N)位点，这些位点已在多个基因中被鉴定，并似乎参与重要的生理过程5-8。
体外中，RNA 加工反应通常通过使用放射性标记的 RNA 底物进行分析9-12。这些底物可通过来自噬菌体 T7 或 SP6 启动子的加尾转录合成。在研究尚未表征的多聚腺苷酸化位点时，必须使用基因组 DNA 而非 cDNA 来制备 RNA 底物，因为重要的下游序列在 cDNA 中可能缺失。设计底物时应包含从成熟 mRNA 的切割位点/末端起上游至少 150 个核苷酸（nt）和下游 50 个核苷酸。切割产物的迁移速度比底物快；然而，由于非特异性核酸酶活性可能产生其他片段，因此必须通过反应对正确加工信号序列的依赖性来验证其特异性。因此，含有 AAUAAA 序列点突变（例如 AAGAAA）的 RNA 底物可作为切割反应的阴性对照。
由于切割反应中仅使用少量放射性标记的RNA，而大多数核提取物中富含核糖核酸酶（RNase），这可能会造成问题，并限制提取起始材料的选择。HeLa细胞通常内源性RNase水平较低，因此在这些检测中表现良好。
RNA底物的内切核酸酶切割 体内 和 体外 紧接着发生多聚腺苷酸化反应，因此切割产生的中间产物无法以可检测的量存在。因此，为了研究特定的RNA序列或参与切割反应的蛋白质，实验需在阻止多聚腺苷酸化发生的条件下进行。切割反应与多聚腺苷酸化之间无相互依赖关系，反之亦然，因此可以在不影响切割反应的前提下抑制多聚腺苷酸化。为此，将ATP替换为缺乏3’羟基的链终止类似物，使得在多聚(A)位点只能掺入单个核苷酸，从而仅能检测到经过切割的RNA。
鉴于此类实验的复杂性和高度特异性，我们提供了一套详细的视频实验方案，用于研究mRNA前体在切割/多聚腺苷酸化机制作用下的内切核酸酶切割过程 体外我们介绍了如何制备具有转染活性的核提取物、生成放射性标记的RNA底物、进行切割反应，以及分析和解读反应产物。 图1 显示了用于切割实验的底物RNA示例，该RNA编码HIV-1前体mRNA的3’端。HIV RNA基因组的3’端包含多个重要的调控序列，如多聚腺苷酸化位点（poly(A) site）、富含G+U的区域以及USE元件，这些序列对于病毒mRNA转录本的有效成熟均至关重要13在此示例中，预期输入的RNA底物长度为338 nt，切割后为237 nt。若发生多聚腺苷酸化，则会在237至437 nt之间观察到一条产物弥散带。

<table><tbody><tr><td>1 L Celstir 摇瓶</td><td>Wheaton</td><td>356884</td><td>提供不同规格</td></tr><tr><td>四位置低速搅拌器</td><td>VWR</td><td>12621-076</td><td></td></tr><tr><td>摆动桶式离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Allegra x-15R 配 SX4500 转子</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Optima L-100 XP Ultra 配 SW41 转子</td></tr><tr><td>台式离心机 5417R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>带制冷功能</td></tr><tr><td>Thermomixer 恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml 锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Ultraclear 超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>JOKLIK 改良 MEM 培养基</td><td>Lonza</td><td>04-719Q</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlas</td><td>F-0500-A</td><td>经热灭活处理</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺:青霉素:链霉素</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-110</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Mediatech</td><td>46-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>MP Biomedicals</td><td>194844</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Alexis Biomedicals</td><td>280-001-G-010</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>5 M 氯化钠溶液</td><td>Mediatech</td><td>46-032-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889-100ml</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Fisher</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Complete 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 透析盒套装</td><td>Thermo Scientific</td><td>66372</td><td>截留分子量 7,000，容量 0.5 ml–3 ml</td></tr><tr><td>15 ml Dounce 组织研磨器套装</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938-1SET</td><td>提供不同规格</td></tr><tr><td>Expand 高保真 PCR 试剂盒</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP 混合液</td><td>Invitrogen</td><td>Y02256</td><td>每种核苷酸浓度为 10 mM</td></tr><tr><td>MaxiScript SP6/T7 体外转录试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1322</td><td></td></tr><tr><td>m7G(5')ppp(5')G RNA 帽结构</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td></td></tr><tr><td>Century Marker Template Plus</td><td>Ambion</td><td>AM7782</td><td></td></tr><tr><td>Easytides UTP [&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] 250 &amp;mu;Ci</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU507H250UC</td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液 II</td><td>Ambion</td><td>8546G</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 处理水</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE 缓冲液</td><td>Fisher</td><td>BP13354</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE 缓冲液</td><td>Ameresco Life Sciences</td><td>0658-4L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS 缓冲液</td><td>Fisher</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Fisher</td><td>BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Fisher</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>40% 19:1 丙烯酰胺:双丙烯酰胺</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>Roche</td><td>10 901 393 001</td><td></td></tr><tr><td>100% 绝对乙醇（200 proof）</td><td>Acros</td><td>61509-0040</td><td></td></tr><tr><td>酸性酚:氯仿</td><td>Ambion</td><td>9720</td><td>适用于 RNA 提取</td></tr><tr><td>闪烁液</td><td>Fisher</td><td>SX18-4</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>Promega</td><td>N261B</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇 - PVA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dATP</td><td>Fisher</td><td>BP2560-4</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Acros</td><td>23042-5000</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Fisher</td><td>BP1700-100</td><td></td></tr><tr><td>可调节测序装置</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351881-1EA</td><td></td></tr><tr><td>文件夹夹</td><td>Office Depot</td><td>838-056</td><td></td></tr><tr><td>20 cm x 42 cm 玻璃板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352543</td><td>1 套</td></tr><tr><td>20 cm x 22 cm 玻璃板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35252-7</td><td>1 套</td></tr><tr><td>20 cm x 42 cm 铝制冷却板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352667</td><td>1 件</td></tr><tr><td>0.4 mm x 22 cm 间隔条</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35230-6</td><td>1 套</td></tr><tr><td>0.4 mm x 42 cm 间隔条</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352314-1</td><td>1 套</td></tr><tr><td>8 孔梳</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35195-4</td><td>1 件</td></tr><tr><td>16 孔梳</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351962</td><td>1 件</td></tr><tr><td>32 孔梳</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351970</td><td>1 件</td></tr><tr><td>防粘胶涂层剂</td><td>C.B.S. Scientific</td><td>SGR-0401</td><td>或 SGR-0101（单瓶装）</td></tr><tr><td>凝胶上样枪头</td><td>Rainin</td><td>GT-10-4</td><td>0.1–10 &amp;mu;l</td></tr><tr><td>Sequencing PowerPac HV 电泳电源</td><td>Bio-Rad</td><td>PowerPac HV</td><td>5,000 V/500 mA/400 W</td></tr><tr><td>Gel Dryer Model 583 凝胶干燥仪</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 583</td><td></td></tr><tr><td>凝胶干燥仪用 Hydrotech 真空泵</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glogos II 夜光标记物</td><td>Agilent</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>8 x 10 尺寸胶片</td><td>Midsci</td><td>BX810</td><td></td></tr><tr><td>14 x 17 尺寸胶片</td><td>Phenix</td><td>F-BX1417</td><td></td></tr><tr><td>放射自显影暗盒</td><td>Fisher</td><td>FBCA 1417</td><td>提供 8 x 10 尺寸</td></tr></tbody></table>

无细胞系统中rna加工反应的分析：前体mrna底物的3'端切割 体外

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

哺乳动物mRNA的3’端并非由RNA聚合酶II（RNPII）转录时突然终止形成。相反，RNPII会继续合成超出成熟RNA末端的前体mRNA，随后在特定位置通过内切核酸酶的活性进行切割。前体RNA的切割通常发生在保守多聚腺苷酸化位点（AAUAAA）下游10-30个核苷酸处，且紧随CA二核苷酸之后。切割复合物是一种多因子蛋白复合物，分子量约为800 kDa，其中的蛋白质负责执行这一特异性的核酸内切活性。多聚腺苷酸化位点上下游的特定RNA序列可调控切割复合物的募集。切割完成后，前体mRNA立即由多聚腺苷酸聚合酶（PAP）进行加尾，生成成熟的、稳定的RNA分子。
使用带有特异性放射性标记RNA底物的细胞核提取物，可对RNA转录本3’末端的加工过程进行研究。总之，一种长 32P标记的未切割前体RNA与核提取物孵育 体外，通过凝胶电泳和放射自显影评估切割情况。当发生正确切割时，可检测并定量较短的5’端切割产物。本文以HIV-1 mRNA的3’端加工为例，详细描述该切割实验方法。

HIV-1 RNA 多聚腺苷酸化位点（poly(A) 位点）切割实验的代表性结果（图 2）。可以看到未切割的 RNA 底物，其为凝胶中迁移最慢、位于最上方的条带。特异性切割产物为强度最高的较短片段条带，其在凝胶中的迁移速度较快，大小符合预期，并且在含有 polyA 序列点突变（mutPolyA）RNA 底物的突变对照（mutpoly(A)）切割实验中特异性缺失。有时也可观察到输入底物的降解产物。切割活性的定量可通过密度分析图确定，即以未切割 RNA 为 100% 进行归一化处理后，计算未切割与切割 RNA 条带的比值。
<img alt="RNA transcription process, T7 promoter to cleavage site, diagram with gene sequence and poly(A) signal." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51...

RNA聚合酶II合成的前体RNA会延伸至成熟mRNA的3'末端之外。成熟RNA的末端在转录过程中由RNA序列决定的位置通过切割复合物的核酸内切酶活性生成。本文详细描述了研究切割反应的方法 体外.

无细胞系统中RNA加工反应的分析：前体mRNA底物的3'端切割 体外

哺乳动物mRNA的3'端并非由RNA聚合酶II（RNPII）转录时突然终止形成。相反，RNPII会继续合成……

本实验的总体目标是成功在体外检测mRNA的三重切割。首先，从悬浮培养的细胞中制备具有转录活性的核提取物。实验的第二步是通过体外转录制备放射性标记的RNA底物。第三步是通过凝胶纯化标记的 RNA 底物。最后一步是构建切割反应体系，包括加入核提取物和标记的 RNA 底物。最终，通过垂直放射性凝胶电泳可检测到三磷酸化 mRNA、未切割的底物以及切割产物。尽管该方法自20世纪80年代以来已被实施，但其操作并不容易，因为整个实验流程包含许多具有挑战性的特定步骤，因此对该方法进行可视化演示非常重要。确保细胞已洗涤、离心成沉淀，并准备好进行裂解。开始本实验方案时，向细胞沉淀中加入含有新鲜DTT的缓冲液。加入五倍预估CPV体积的溶液，用移液器吹打重悬沉淀，并将悬液置于冰上冷却。10分钟后，在4°C条件下使用摆桶转子离心沉淀细胞，然后小心地吸除上清液。沉淀物会吸收部分溶液并膨胀增大。然后加入一倍细胞体积（CPV）的缓冲液A，用移液器吸头轻轻吹打使沉淀重悬。将悬液倒入预冷的匀浆器中，使用紧密的研杵上下研磨5至12次以裂解细胞。取出少量等分试样，加入台盼蓝染液并检查细胞，以确定细胞裂解的完全程度。如有需要，继续匀浆细胞直至90%裂解，但避免过度操作。随后将裂解液转移至超清晰超速离心管中。记录总体积，并按之前的方法进行离心。吸除浑浊的上清液，置于冰上保存。进行胞质分析时，注意不要扰动沉淀物。其中含有细胞核。接下来，将沉淀物高速离心15分钟。除去残留的少量上清液，并将其与细胞溶质收集液合并。然后测定PACT细胞核体积。向沉淀中加入等体积的缓冲液C。接着使用移液器在洁净的下冲式匀浆器中将沉淀悬浮分散。使用研杵快速研磨5到10次以重新悬浮沉淀。充分悬浮沉淀物。将匀浆转移至预冷的离心管中，并通过倒置混匀30分钟。在 4 摄氏度下，可使用搅拌板。如果体积足够大，将裂解液转移至 UltraClear 超速离心管中，在 4 摄氏度下以约 25,000 ×g 离心 30 分钟。上清液即为核提取物。按照文本方案，仅使用一微克模板完成透析。使用含有SP6或T7兼容启动子的试剂盒，通过体外转录制备探针。上样时，每种RNA底物使用3 µL的标记物和全部25 µL的反应产物。同时，通过将大小相似的转录本加样孔隔开，以防止交叉污染。电泳时，使600个核苷酸的探针在约2小时后以25瓦的功率运行。为标记凝胶条带的位置，使用透射灯箱照射曝光后的胶片，并将包裹好的凝胶置于其上方。将自动放射标记与膜上的暴露标记对齐，然后用黑色标记笔标出条带位置，以去除条带。打开凝胶，用洁净的刀片切下凝胶中的条带部分，将每一段转移至各自的离心管中，并按照标准操作步骤洗脱RNA。所有试剂制备完成后，将标记的 RNA 在 80 摄氏度加热两分钟。随后将 RNA 转移至冰上涡旋，加入 10% PVA，然后高速离心数分钟以去除气泡，接着配制每种反应的预混液。每种反应中加入 5.25 µL 的预混液一。接下来，加入6.25 µL的核提取物混合液。然后加入1 µL标记的RNA底物，总体积稀释至50 amolar。每个反应使用的标记RNA少于5 amolar。现在，轻轻涡旋并迅速离心收集反应混合物。在30摄氏度条件下孵育反应体系，时间最长可达两小时。对反应过程进行时间进程监测可获得最佳结果。使用蛋白酶K消化反应中的蛋白质后，采用酚-氯仿法纯化反应产物，并将产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，每条泳道上样3微升Marker或每反应产物5微升。然后运行凝胶，之后小心拆卸凝胶装置。收集凝胶时，将滤纸紧压在凝胶上并翻转。用力按压玻璃板，确保凝胶被滤纸完全粘附。然后缓慢地将带有凝胶的滤纸剥离。用塑料膜包裹凝胶的暴露面，并将塑料膜的另一侧用胶带固定在滤纸上。最后，将凝胶放入干燥仪中，滤纸面向真空端，干燥15分钟。随后，通过将凝胶暴露于胶片或磷屏成像仪来分析结果。被切割的 RNA 底物是凝胶顶部迁移最慢的条带。由粗箭头标记的特异性切割产物在凝胶中以预期大小迁移得更快。在聚合酶序列中带有点突变的对照组中，该产物缺失。切割活性的定量通过DS指标图确定。将切割后的RNA与经切割RNA对照归一化的RNA进行比例比较。通过此方法，还可进行其他实验，例如多聚腺苷酸化检测，以回答更多问题，如多聚A聚合酶的活性。该检测通过改变反应条件来进行，例如添加镁离子并去除EDTA。

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生物学

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无细胞系统中RNA加工反应的分析：前体mRNA底物的3'端切割体外

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