无细胞系统中RNA加工反应的分析：前体mRNA底物的3'端切割 体外

本实验的总体目标是成功在体外检测mRNA的三重切割。首先，从悬浮培养的细胞中制备具有转录活性的核提取物。实验的第二步是通过体外转录制备放射性标记的RNA底物。

第三步是通过凝胶纯化标记的RNA底物。最后一步是构建切割反应体系，包括加入核提取物和标记的RNA底物。最终，通过垂直放射性凝胶电泳可检测到三磷酸化mRNA、未切割的底物以及切割后的产物。

尽管该方法自20世纪80年代以来已被实施，但其操作并不容易，因为整个实验流程包含许多具有挑战性的具体步骤，因此本方法的可视化演示至关重要。确保细胞已洗涤、离心成沉淀，并准备好进行裂解。开始本实验方案时，向细胞沉淀中加入含有新鲜DTT的缓冲液。

加入五倍体积的预估CPV，用移液器吹打重悬沉淀，并将悬液置于冰上冷却。10分钟后，在4°C下使用摆桶离心机离心沉淀细胞，小心吸除上清液。

沉淀物会吸收一些溶液并膨胀变大。然后加入一倍细胞体积（CPV）的缓冲液A，用移液器吸头轻轻吹打使沉淀重悬。将悬液倒入预冷的匀浆器中，使用紧密的研杵上下研磨5到12次以裂解细胞。

取出少量等分试样，加入台盼蓝染液并检查细胞，以确定细胞裂解的完全程度。如有需要，继续匀浆细胞直至90%裂解，但避免过度操作。随后将裂解液转移至超清晰超速离心管中。

记录总体积，并按之前的方法进行离心。吸除浑浊的上清液，置于冰上保存。进行胞质分析时，注意不要扰动沉淀物。

其中含有细胞核。接下来，将沉淀物高速离心15分钟。除去残留的少量上清液，并将其与细胞质部分合并。

然后测定PACT细胞核体积。向沉淀中加入等体积的缓冲液C。接着在洁净的下冲式匀浆器中用移液器将沉淀吹打下来。

使用研杵快速研磨5到10次以重新悬浮沉淀。悬浮沉淀物。将匀浆转移至预冷的离心管中，并通过倒置混匀30分钟。

在 4°C 条件下，可使用搅拌板。如果体积足够大，将裂解液转移至 UltraClear 超速离心管中，在 4°C 下以约 25,000 ×g 离心 30 分钟，所得上清液即为核提取物。

根据文本方案，仅使用一微克模板完成透析。利用含有 SP6 或 T7 兼容启动子的试剂盒，通过体外转录制备探针。上样时，每个 RNA 底物使用三微升的标记物和全部 25 微升反应产物。

同时，通过将大小相似的转录本加样孔隔开以防止交叉污染。电泳时，使600个核苷酸的探针在约25瓦功率下运行约两小时。为标记凝胶条带的位置，使用透射灯箱照射曝光后的胶片，并将包裹好的凝胶置于其上方。

将自动放射标记与膜上的暴露标记对齐，然后用黑色标记笔标记条带位置以去除条带。打开凝胶包装，使用洁净的刀片切下凝胶中的条带部分，将每一段转移至各自的离心管中，并按照标准操作步骤洗脱RNA。

所有试剂制备完毕后，将标记的 RNA 在 80 摄氏度加热两分钟。随后将 RNA 转移至冰上涡旋，加入 10% PVA，然后高速离心数分钟以去除气泡，接着配制每个反应的预混液。每个反应中加入 5.25 µL 的预混液一。

接下来，加入6.25 µL的核提取物混合液。然后加入1 µL标记的RNA底物，总体积稀释至50 amolar。每个反应使用的标记RNA少于5 amolar。

现在，轻轻涡旋并迅速离心收集反应混合物。在30摄氏度下孵育反应体系，反应时间最长可达两小时。对反应过程进行时间进程监测可获得最佳结果。使用蛋白酶K消化反应中的蛋白质后，采用酚-氯仿法纯化反应产物，然后在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，每条泳道上样3微升标记物或5微升反应产物。

然后运行凝胶，之后小心拆卸凝胶装置。收集凝胶时，将滤纸紧压在凝胶上并翻转过来。用力按压玻璃板，确保凝胶被滤纸完全粘附。

然后缓慢地将带有凝胶的滤纸剥离。用塑料膜包裹凝胶的暴露面，并将塑料膜的另一侧用胶带固定在滤纸上。最后，将凝胶放入干燥器中，在真空侧朝向滤纸的条件下干燥15分钟。

随后，通过将凝胶暴露于胶片或磷屏成像仪来分析结果。被切割的 RNA 底物是凝胶顶部迁移最慢的条带。

由粗箭头标记的特异性切割产物在凝胶中以预期大小迁移得更快。在聚合酶序列中带有点突变的对照组中，该产物缺失。切割活性的定量通过DS指标图确定。

比较经切割的RNA与经切割的对照RNA的比值，并对经切割的RNA对照进行归一化。通过此流程，还可进行其他方法，例如多聚腺苷酸化实验，以回答更多问题，如多聚A聚合酶的活性。该实验通过改变反应条件来进行，例如添加镁离子并去除EDTA。