从海马CA1区片核富含分的分离，研究突触核信使蛋白质的活性依赖进口核

本实验的总体目标是使用急性海马切片研究蛋白质的活性依赖性核细胞质穿梭，其中神经元连接和功能得到很好的保留 为了实现这一目标，首先分离成年雄性大鼠的海马体，第二步准备急性横向切片。海马切片被转移到记录室，并在 CA 一层放射原子中诱导 LTP 的晚期形式。接下来，将增强切片和对照切片冷冻，并解剖受刺激的 ca one 区域，以分离富含核的部分以进行进一步的免疫 blott 分析。

基于 western blotting 分析的结果显示，诱导 LTP 后 30 分钟，增强切片和对照切片之间的核磷蛋白水平存在差异。一般来说，刚接触这种方法的人会因为两个原因而感到挣扎。首先，组织样本量低，其次，在低渗裂解缓冲液中裂解样品的关键时间框架，允许释放细胞核该方法的视觉演示至关重要，因为海马生命准备和 C one 区域的分离需要快速且非常准确的解剖，但有一些技巧。

为了更容易，需要遵循书面和可视化说明，从海马体的 C one 区域制备富含核的部分。裂解 程序演示将由 pinon 邮政实验室进行。她将展示如何准备急性海马裂解和诱导 LTP。

通过 Berra g 解剖 C 一区后，我们实验室的 g 学生将向您展示如何隔离核和破坏。通过分离大鼠大脑并将其浸入预碳酸冰冷凝视溶液中来开始此过程。接下来，切除小脑和部分肠内皮层。

用中矢状切口分离皮质半球。然后，沿每个半球的背缘切 50 到 70 度。然后将每个半球向下放在其内侧表面上，将每个半球与新切割的表面粘合在颤音的切片平台上。

随后用预碳化的冰冷凝视溶液覆盖平台。用振动器从前侧到后侧切下包含海马形成、下皮层和肠内皮层的 350 微米切片。之后，将切片转移到 U 形浸没式培养箱中，并在 32 摄氏度下与碳素 A CSF 一起孵育至少两个小时。

现在将海马切片转移到安装在显微镜下的浸没式记录室中。在 32 摄氏度下以每分钟 6 毫升的速度用碳酸 A CSF 灌注切片至少 30 分钟。30 分钟后，用 CSF 填充玻璃毛细管微电极。

在 CA 中放置一个微电极，一个 Schaefer 侧支纤维用于刺激，另一个在 ca 一层就绪原子中放置一个，用于场 EPSP 记录，距离为 300 微米。然后通过相位矩形电流脉冲向 Schafer 侧支光纤提供 3 到 4 伏特的电压来唤起场 EP SSP。通过测量输入输出关系来执行最大刺激测试，并将刺激强度定义为最大场 EPSP 斜率值的 40%。

接下来，通过在整个实验过程中每分钟测量对测试刺激的反应，记录基线至少 15 分钟。为了诱导晚期 LTP，应用高频 tein 以增加 ca one 区域的诱发野 EPSP。在 tetin 前 2 分钟通过 COE 将 5 微摩尔涂抹在 A CSF 上，并在最后一次破伤风后立即冲洗掉。

停止录制。之后，在晚期 LTP 诱导后 2 分钟或 30 分钟，取出电极并快速将切片转移到放置在干冰上的预冷金属平台上。然后将每片切片收集在 1.5 毫升的 eend 孤儿管中，并在零下 80 摄氏度下储存。

在此步骤中，将冷冻切片从零下 80 摄氏度中取出，并放在冰上。将 0.5 毫升含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的新鲜冷 TBS 缓冲液加入试管中。在转移到体视显微镜之前，将它们孵育 2 到 3 分钟。

接下来，用一根针握住切片并用另一根针切开 CA 的一个区域，解剖海马体的 CA 一层 parama dole 区域。之后，在含有 50 微升裂解缓冲液的新单点毫升管中，从每组 5 个切片中收集解剖的 ca one 区域。然后用 200 微升移液器小心地上下移液，使收集的组织匀浆。

将裂解物在冰上孵育 5 到 7 分钟，让细胞膨胀。之后，取 2 μL 裂解物，将其放在显微镜载玻片上。在明场显微镜下观察细胞的肿胀。

细胞核表现为圆形完整结构，具有适当的肿胀。现在，在新的 1.5 毫升试管中收集 20 微升样品作为匀浆馏分。加入 8 微升变性 4 个 XSDS 样品缓冲液。

然后将剩余的裂解物以 1100 RCF 离心 1 分钟。一分钟后，小心地从顶部收集上清液并将其转移到新试管中。随后，加入 20 μL 的 4 x 样品缓冲液。

然后将沉淀重悬于 60 μL 低渗缓冲液中，并加入 20 μL 的 4 x 样品缓冲液。该馏分称为核富集馏分。将匀浆、胞质和细胞核富集部分储存在负 20 摄氏度或负 80 摄氏度。

为了稍后在此程序中进行免疫印迹，将样品解冻并在 95 摄氏度下煮沸 5 分钟，然后通过 AM mito 黑色试验或 BCA 测试负载测量蛋白质浓度，从匀浆、细胞质和细胞核富集组分中获取等量的蛋白质样品。在 SDS 页面上，来自对照切片和 LTP 切片的凝胶样品应放在同一块凝胶上，以便在 Western 印迹中直接进行比较。该图显示了用胞质和细胞核标志物探测的 ca one 裂解物的匀浆、胞质和细胞核富集级分的免疫印迹。

这是在 tein 诱导后 2 分钟和 30 分钟匀浆中 PJS 180 水平的免疫印迹分析，这是对细胞核富集部分中 PJS 180 水平的免疫血液分析。化化后 2 分钟和 30 分钟，磷酸化 Jacob 水平在总 CA 1 蛋白匀浆和化化后 2 分钟的核富集部分保持不变。但在 LTP 诱导后 30 分钟发现 p Jacob， S 180 免疫反应性显着增加。

在尝试此程序时，重要的是要记住使用适当体积的低渗裂解阀。此外，需要标准化样品裂解的关键时间范围。特别是，当该方法用于从海马体以外的大鼠或小鼠脑组织样品中分离细胞核和组分时，按照此程序，其他方法（如在诱导 OTP 或激酶或磷酸酶的活性形式等信号分子后针对输入细胞核的候选蛋白的抗体进行互补免疫染色）可能有助于验证这些结果。

可以进行药物治疗以回答其他问题。例如，哪些信号级联参与突触核蛋白 meers 的易位，或者它们如何影响核功能。此外，人们可以研究突触核信使蛋白在涉及海马体的疾病中的作用。

例如，阿尔茨海默病。