内皮细胞管形成实验用于 体外 血管生成研究

本实验的总体目标是通过一种快速且定量的体外方法，确定参与血管生成的基因或信号通路。首先在检测前一天对原代或永生化内皮细胞进行无血清饥饿处理。第二步是将内皮细胞与钙调蛋白磷酸酶抑制剂（calcine）孵育30分钟，随后用PBS洗涤细胞。

接下来，将内皮细胞进行胰蛋白酶消化处理，并通过滤网去除细胞团块，然后进行计数。最后一步是将内皮细胞与含有潜在促血管生成因子的条件培养基混合，接种至已固化的基底膜提取物表面。最终，通过光学显微镜或荧光显微镜观察形成的管状结构网络，并可利用专业的计算机程序对其进行定量分析。

该技术相较于其他检测血管生成的方法主要优势在于操作简便、成本相对较低、可在数小时内形成管状结构，并且结果可量化，从而有效展示该技术。Erica Bullwinkle 是美国大学生物学系的一名研究生吗？为获得最佳结果，在开始实验前两天，使用适当的培养基将三份 B11 细胞转移至新的培养瓶中，所用细胞应处于第二至第六代之间。

接下来，在添加补充物的 dmm 培养基中培养细胞 24 小时。当细胞准备就绪后，进行血清饥饿处理。通过更换为低血清培养基，继续培养血清饥饿的细胞额外 24 小时。

为了获得最佳结果，重要的是需与生产商确认BME储存液的浓度为每毫升10毫克。将去除了生长因子的BME在冰箱中解冻。由于BME在温度较高时会凝固，因此使用前需保持低温。

接下来，将检测所需的培养基解冻，用于荧光或共聚焦显微镜观察。向培养基中加入钙黄素 AM（calcein AM），使其终浓度为每毫升 2 微克，将标记了钙黄素 AM 的细胞置于避光环境中孵育约 30 至 45 分钟。孵育结束后，移除培养基，并用 DPBS 洗涤三遍 B11 细胞。随后进行胰酶消化，加入 1 毫升含 EDTA 的胰酶溶液。待胰酶消化完成后。

用补充的 dmm 将细胞重悬至终体积为 10 毫升。通过 100 微米细胞滤网过滤细胞，去除任何团块。计数细胞后，将其重悬至正确的终浓度，以开始管形成实验的冷启动步骤。

在接种前，将24孔板和1毫升枪头放置20至30分钟。这可以防止基底膜提取物（BME）在准备开始移液时过早凝固。向24孔板的每孔中加入250微升低生长因子BME。移液时避免将移液器按压至最后一档，以防产生气泡。

加样时，待各孔加样完成后，需检查孔中心是否留有足够的BME。当液面形成弯月面时，若基质过薄，细胞将仅形成单层。随后，将培养板置于37°C孵育30分钟，以使BME凝固。

待BME凝固后，将约300微升的条件培养基与10微升重悬的三B 11细胞混合，并将细胞悬液分装至培养板的各孔中。将培养板放入培养箱后，管状结构将在2至4小时内开始形成；根据条件培养基中血管生成因子的浓度不同，管状结构形成的高峰可能出现在3至12小时之间。该实验的孵育时间需根据具体研究条件进行优化。

通常在18小时后，管状结构便开始退化，内皮细胞将在管形成达到峰值时发生凋亡。吸取培养基时需小心操作，避免破坏管状网络。随后，用1毫升DPBS清洗每孔，以便立即观察。

向每个孔中加入一毫升新鲜的 DPBS，并在共聚焦显微镜下对管状网络进行成像，以固定管状结构以便后续观察。从每个吸除液体的孔中加入 4% 多聚甲醛，在室温下孵育 15 分钟。去除多聚甲醛后，用 DPBS 洗涤两次，然后向每个孔中加入一毫升新鲜的 DPBS。这些图像表明，由小鼠角质形成细胞或成纤维细胞分泌的血管生成因子均能够诱导管状结构的形成。

随着时间推移，内皮细胞迁移，并在接种后一至两小时内开始形成细小的分支。四至六小时后达到管状结构形成的峰值。24小时后，部分分支仍然存在，但许多细胞发生凋亡，管状结构开始断裂解体。

细胞数量对成管形成具有显著影响。当接种的细胞数量不足时，形成的管状结构较少，网络结构也较为稀疏；随着接种细胞数量的增加，管状网络逐渐变得更为复杂和广泛。然而，当细胞密度过高时，细胞开始发生聚集成团或形成单层细胞，导致不同处理组之间的差异被掩盖。为确保充分的成管能力，细胞应至少经过两次传代。

三种B11的生长速度极快，一天后传代25%的细胞即可在次日形成汇合的培养瓶。此处，使用带有血管生成插件的ImageJ对钙黄绿素AM染色的管状网络进行分析，以检测总节点数、管段数、网格数及其组合，并对网络进行合并分析。此外，该程序还可用于单独检测节点、管段或网格，并进行定量分析。

观看本视频后，您应能充分掌握如何快速、可靠地进行体外血管生成实验，并避免常见错误。