基于原子力显微镜的细胞壁弹性特性图谱：组织、细胞及亚细胞分辨率

本实验的总体目标是利用原子力显微镜绘制植物组织的机械特性图谱。首先，通过移液将一滴低熔点琼脂糖滴加到载玻片的蚀刻区域，形成一层薄的琼脂糖膜，以制备玻璃载片。第二步是解剖并安装样品。

从茎上移除花芽，将马里斯茎从主茎上切下，并立即将其切面嵌入玻璃上的薄层琼脂糖膜中。接下来，加入足量融化的包埋用琼脂糖，以填充马里斯茎嵌入琼脂糖膜时产生的缝隙。最后一步是设置原子力显微镜以进行数据采集。

最终，数据分析和细胞壁表观杨氏模量的测量能够同时在亚细胞分辨率和整个组织区域范围内生成细胞壁特性的力学图谱。该技术相较于现有方法的主要优势在于，能够同时在亚细胞分辨率和整个组织区域范围内测量细胞壁的力学特性。用于包埋样品的Aros培养基由0.7%低熔点Aros、10%甘露醇溶于水中配制而成。

使用一种坚固的金属工具（如钻头尖端），在显微镜玻片中央刻出一个 0.5 × 0.5 厘米的区域。该操作可使表面粗糙化，以促进琼脂的黏附，确保包埋琼脂介质能够牢固地附着在玻片上。用移液器将约 20 µL 的包埋琼脂介质滴加到玻片的刻蚀区域。

这将形成一层薄薄的琼脂膜。将玻片置于湿润盒中，等待Agros培养基使拟南芥样品凝固。随后将使用原子力显微镜对分生组织样品进行制备。

用超细镊子将花蕾从茎上逐一向下拉取摘除。必须将所有花蕾彻底去除，直至去除到不表现出后续结构的花蕾，即P1期原基。使用剃刀刀片或镊子尖端，将分生组织从茎上切割分离。

切口应与拟用原子力显微镜或荧光显微镜测量的分生组织表面区域平行。所获得的顶端组织高度应在300微米至600微米之间，以确保在实验过程中不会碎裂。立即将其顶端压入先前制备好的aros培养基薄膜中。在载玻片或aros上选择一个合适的位置，轻轻按压，使分生组织既与载玻片直接接触，又从aros中突出。

施加压力后，agros 会在受力处断裂，因此 mari 茎现在将立于裂缝中。在从茎上切下后的数秒内，必须将 marit 茎准确地插入 aros 中，这一步骤至关重要。此举可防止 MA 茎失水干燥。

只要微阵列茎的高度相同且彼此间距小于500微米，即可通过此方法制备多个微阵列茎用于批量成像。在载玻片上，将已制备的微阵列茎置于湿盒中，同时继续解剖其他样品。在进行下一步操作前，使用滤纸轻轻去除分生组织与花芽交界处的多余水分。

这是为了防止融化的琼脂因毛细作用而淹没样品。随后，使用20微升移液器，加入足量融化的封片琼脂，以填充先前产生的裂隙，并包围每个分生组织，琼脂应达到已去除花芽或原基疤痕的水平。为达到此目的，可能需要在裂隙的两端均添加琼脂。

加入琼脂后，它会迅速渗入裂隙中。用移液器吸取部分融化的封片琼脂，确保胚胎茎尖成为载玻片上的最高点。这样可固定胚胎茎尖，使其在根部和下胚轴成像过程中不会移动。

在琼脂薄膜中无需进行解剖。在制备好的载玻片上，使用微型镊子在玻璃蚀刻处正上方或沿玻璃薄片位置刻出一条凹槽，将根或下胚轴放入此凹槽中，确保其全长与玻璃表面接触。以与展示的茎尖样品相同的方式，在样品周围加入熔化的封片琼脂。

一位JP PK纳米专家。本演示中使用了FM。开始此操作时，将带有圆形压痕的悬臂安装到FM上。该半径将决定X、Y、Z方向的分辨率以及可实现精确测量的压痕深度。

为了在表皮表面进行介观至纳米尺度的测量，使用半径为50纳米的圆形压头；进行介观尺度测量时，使用半径为0.5微米的圆形压头；在跨越两到三个细胞的微米尺度范围内进行测量时，使用半径为2.5微米的圆形压头，并将激光定位在悬臂末端。通过调节反射镜，将激光对准传感器的中心位置。

将洁净的玻璃片置于原子力显微镜（AFM）探针下方，设定目标设定点为1伏，并选择进行光谱分析。通过将最大相对设定点设为2伏、伸出速度设为40微米每秒、Z轴长度设为5微米，执行一次压痕操作。在校准管理器菜单中，选择前向曲线的线性部分以拟合灵敏度。

使用选择拟合范围按钮，应在10%甘露醇溶液200微升时将相对设定点从电压（vol）转换为位移（meter）。在悬臂梁尖端下方，通过反射镜将激光重新对准检测器中心，并通过移动调节器，从校准管理器菜单中重新校准灵敏度。点击未知按钮，选择四次光谱测量，并按照之前所示方式进行压痕操作。

选择前向曲线的线性部分，点击“选择拟合范围”按钮以开始此程序，将固定好的样品置于原子力显微镜（AFM）探针下方，并在样品上加入500 µL的10%甘露醇溶液。甘露醇溶液会在数分钟内使细胞发生质壁分离。以20 nN为目标设定点，相对设定点为200 nN，延伸速度为40 µm/s，Z轴长度为5 µm，进行压痕操作。调整相对设定点，使使用200 nm悬臂时获得100 nm的压痕深度，或使用1 µm悬臂时获得0.5 µm的压痕深度。

五微米固定悬臂梁力映射模式。选择扫描区域，对低渗克氏杆菌茎部扫描70乘70微米，分辨率为64乘64；对根部扫描100乘100微米，分辨率为64乘64。按下扫描以启动实验，并保存输出结果。

首先在数据分析软件中打开数据文件，然后选择批量处理，以将相同的分析应用于单个图谱中的所有曲线。

选择正确的悬臂梁弯曲高度以提取压痕深度。选择杨氏模量拟合函数，该函数假设力与压痕面积成正比。

将针尖形状设置为抛物线形，以假设压痕形状为抛物线。输入针尖的半径。接着，选择用于分析的 retract 曲线。

与延伸曲线相比，回缩曲线对表面形貌的敏感性较低，因此更受青睐。将 poso 比例设为 0.5。最后，点击“分析”并保存输出结果。

本实验展示了典型的花状火星茎年轻与老化组织以及根部MA茎的原子力显微镜（AFM）年轻模块化图谱。压痕探针为半球形，但其半径不同，以实现不同的空间分辨率。这些图谱展示了采用50纳米半径探针、进行50纳米深度压痕时，介观至纳米尺度压痕的典型结果。

心电图显示了下表皮细胞表面细胞壁的微尺度异质性。图中还展示了花分生组织、下表皮和根部在使用500纳米半径压头进行500纳米深度压痕时的典型中尺度压痕结果。该微尺度压痕的心电图采用2.5微米半径压头和500纳米深度压痕，揭示了器官起始过程中在任何可见生长之前发生的组织软化现象。

然而，由于样品高度范围超出了原子力显微镜（AFM）的最大Z轴范围，该扫描被中止。实验过程中因样品固定不当而导致的移动，可能产生模糊的扫描图像，如此处所示。被颗粒物覆盖的区域也无法进行准确测量，如本示例所示。若操作得当，掌握该技术后可在一小时内完成。