Name: Nanopodia - 薄，易碎膜预测与细胞运动和细胞间的相互作用角色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T15:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学习利用TM4SF1免疫荧光染色技术可视化培养内皮细胞和癌细胞中的纳米足突结构。该方法通过优化固定和染色流程保留这些脆弱膜结构，助力研究细胞运动、增殖及细胞间相互作用机制。

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我们感谢 Harold Dvorak 博士提供的有益讨论，包括建议尝试在 37 °C 下使用 PFA 进行固定。本工作由美国国立卫生研究院基金项目 P01 CA92644 以及美国国家癌症研究基金会的合同资助。

1. 胶原蛋白包被玻璃圆片上的细胞培养
<ol>
	<li>将玻璃圆片（直径 12 mm）放入玻璃瓶（4 oz）中，并进行高压灭菌以消毒圆片。</li>
	<li>在 50&#160;ml Falcon 管中加入 25 ml 70% 乙醇，并将其置于细胞培养超净台中。该溶液可重复使用多次，直至液面降至 20 ml。</li>
	<li>在使用精细尖头镊子操作玻璃圆片前，先将其置于 70% 乙醇中浸泡 5 分钟。</li>
	<li>小心将镊子从管中取出并盖上管盖，然后将经乙醇处理的镊子轻轻放置在管口上方，静置晾干 2 分钟。注意镊子尖端不得接触超净台内任何物体。</li>
	<li>使用无菌镊子从玻璃瓶中取出一片无菌玻璃圆片&#160;，并将其放入 24 孔细胞培养板的一个孔中。重复此步骤，直至所需数量的孔中均放置了圆片。</li>
	<li>向每个含有玻璃圆片&#160;的孔中加入 500 μl 牛胶原蛋白溶液（50 ng/ml），然后将培养板置于 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中孵育至少 30 分钟。延长孵育时间不会产生不良影响。</li>
	<li>通过胰酶消化法收获已在 150&#160;mm 细胞培养皿中培养的 HUVEC（人脐静脉内皮细胞）或 PC3（前列腺肿瘤细胞），并用完全培养基终止胰酶活性。将细胞收集至 15&#160;ml Falcon 管中。</li>
	<li>计数细胞数量，并确保细胞活力高于 90%。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 10 分钟使细胞沉淀，弃去上清液。</li>
	<li>用培养基将细胞稀释至 105 个细胞/ml，并将细胞悬液置于冰上保存。</li>
	<li>在细胞培养超净台中吸除胶原溶液，然后轻柔地向每个预先包被胶原的玻璃圆片孔中加入 500 μl 细胞悬液。在 24 孔板中，每孔接种 5 × 104 个细胞可使 HUVEC 达到约 60% 汇合度，PC3 细胞达到约 30% 汇合度。注意：如需更高细胞密度，可增加细胞悬液接种量。</li>
	<li>将细胞置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养 1 小时、2 小时、4 小时、6 小时或 24 小时，以追踪纳米突起活动及细胞迁移行为。通常情况下，细胞在前 30 分钟内附着于玻璃圆片&#160;，随后在第一个小时内开始极化和迁移，并在接下来的数小时内进行细胞间相互作用和细胞分裂。</li>
</ol>
2. 细胞固定
<ol>
	<li>每个孔需要加入 500 μl 的 4% 多聚甲醛（PFA）以固定细胞。可使用 commercially manufactured 或新鲜配制的 4% PFA。根据所准备的孔数计算所需 PFA 的总量，并将 PFA 置于 15 ml 离心管中。注意：多聚甲醛为疑似致癌物。</li>
	<li>将离心管放入已置于 37 °C 培养箱中的泡沫塑料支架内，使管子在培养箱中预热 30 分钟，使 PFA 升温至 37 °C。</li>
	<li>在细胞培养超净台内放置加热垫并开启电源。</li>
	<li>从培养箱中取出 24 孔细胞培养板和预热的 PFA，并将其放置在加热垫上。</li>
	<li>用一只手吸除孔中的培养基，随后立即用另一只手沿孔壁轻轻加入 500 μl PFA。为便于吸除操作，可将培养板倾斜约 45°，倚靠在泡沫塑料支架上以保持稳定。此角度有助于在不扰动培养细胞的情况下完成吸除和添加 PFA 溶液的操作。这是保持细胞原有结构和活性状态最关键的一步。</li>
	<li>重复上述操作，直至所有含有玻璃圆片&#160;的孔均加入 PFA。注意：所有需要更换孔内原有溶液的步骤均采用相同的吸除方法。</li>
	<li>将培养板置于 37 °C 条件下孵育 5&#160;分钟。</li>
	<li>将培养板移回细胞培养超净台，并如步骤 2.5 所述倾斜倚靠在泡沫塑料支架上。用一只手轻轻将孔内的 PFA 转移至收集管中，另一只手立即向孔内加入至少 500 μl 室温&#160;PBS。待所有孔完成洗涤后，重复 PBS 洗涤一次。将收集的 PFA 废液倒入有害废物容器中。</li>
	<li>通过向 PBS 中加入 2% 胎牛血清配制免疫细胞化学封闭缓冲液。加入 0.04% 叠氮化钠（由 20% 储存液稀释而成）作为防腐剂。注意：叠氮化钠为有毒化合物。该缓冲液可在 4 °C 长期保存，不易发生细菌污染。</li>
	<li>保持培养板倚靠在支架上倾斜状态，依次对每个孔进行吸除 PBS 操作，并立即加入 500 μl 免疫细胞化学封闭缓冲液。此时细胞已准备好进行免疫荧光染色。如有需要，固定后的细胞可在 4 °C 冰箱中保存一周，TM4SF1 蛋白无明显降解。</li>
</ol>
3. 纳米突起中TM4SF1的免疫荧光染色
<ol>
	<li>在每个孔中，将500 μl ICC封闭缓冲液更换为含有0.01% Triton X-100的新封闭缓冲液，室温孵育1小时。Triton X-100浓度不得超过0.03%，否则会导致TM4SF1从细胞膜上脱落。若染色需立即开始，步骤2.10中经PBS洗涤的细胞可直接转移至含Triton的封闭缓冲液中。</li>
	<li>将一抗抗TM4SF1（或抗CD9）抗体用免疫细胞化学封闭缓冲液稀释至0.5 μg/ml。</li>
	<li>在每个孔中，移除ICC/0.01% Triton缓冲液，并加入300 μl抗TM4SF1抗体溶液。于2 hr内孵育&#160;室温或过夜放置&#160;4 °C下</li>
	<li>每孔加入不少于 500 μl 的 PBS 洗涤，重复 3 次；每次孵育时间至少 5 分钟。</li>
	<li>在ICC封闭缓冲液中配制二抗和鬼笔环肽溶液，使用Alexa 488标记的二抗按1,000倍稀释&#160;标记的驴抗小鼠二抗（终浓度 2 μg/ml）和鬼笔环肽 1000 倍稀释液（终浓度 50 ng/ml）。</li>
	<li>移除 PBS，向每孔加入 300 μl 二抗与鬼笔环肽（phalloidin）溶液，孵育 2 小时或过夜&#160;4 °C下</li>
	<li>重复 PBS 洗涤步骤，每次洗涤孵育时间至少 5 分钟。最后一次洗涤时，将每孔保留在 PBS 中 1 小时。</li>
	<li>在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭封片剂（约10 μl）。</li>
	<li>将19 G 1½英寸注射器针头的尖端在硬质表面上轻轻按压，使其弯曲90°。用一只手握住弯曲的针头，轻轻抬起玻璃圆盘&#160;从孔中&#160;用另一只手使用尖头镊子夹住圆盘。</li>
	<li>转动玻璃圆盘&#160;将细胞面朝下，使其接触载玻片上的封片介质。轻轻放置玻璃盖片&#160;过夜晾干&#160;在避光处&#160;室温</li>
	<li>继续进行免疫荧光染色的纳米突起成像，或在 -20 °C 下将载玻片存放在载玻片盒中。载玻片在 -20 °C 条件下可保存数月仍可观察。</li>
</ol>

<ol><li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+actin%3A+matching+assembly+factors+with+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).</li>
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<li>Chang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD13+%28aminopeptidase+N%29+can+associate+with+tumor-associated+antigen+L6+and+enhance+the+motility+of+human+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

纳米突（Nanopodia）是通过TMED牢固附着于基质的细长细胞膜通道，可从极化移动细胞延伸超过100 μm，以感知环境并介导细胞间相互作用2,3。纳米突对基质的附着非常牢固，当细胞移动离开时，会在基质上留下残留痕迹（图1和图2）。因此，纳米突使我们能够研究细胞如何感知其周围环境、决定移动路径，以及基因表达或药物处理如何改变细胞运动。然而，由于这些膜结构极为纤细脆弱（宽度为100–300 μm），在操作过程中需格外小心以保持其完整性。
为了在不干扰纳米突起的情况下准确记录细胞活动，并研究实验条件如何影响纳米突起的活动及细胞运动路径，应在开展实验前首先验证细胞在完全培养基中能否有效生长。正常健康的原代内皮细胞（如 HUVEC）在新鲜的 EGM2-MV 完全培养基中，于培养前六代的对数生长期通常每约 18 小时分裂一次。应避免使用传代次数超过第六代的 HUVEC，因为更高的传代次数会导致培养物中衰老细胞或双核细胞数量增加7，并影响细胞极化及形成纳米突起的能力2</...

在运动极化过程中，动物细胞会从其表面延伸出多种动态的膜突起，包括丝状伪足、片状伪足、回缩纤维和皱褶1。最近新加入这一类别的还有纳米突起（nanopodia），这是一种新近被认识的膜突起类型，形态细长，直径为100-300 μm，长度可达50-100 μm，可为F-肌动蛋白结构（如丝状伪足和回缩纤维）的延伸提供膜通道，并在培养的内皮细胞和肿瘤细胞中对TM4SF1（跨膜蛋白四家族成员1）呈阳性染色2,3。
TM4SF1 是一种具有四跨膜结构域蛋白样拓扑结构的蛋白质，最初被称为肿瘤细胞抗原4，后来发现该分子是内皮细胞的生物标志物，在内皮细胞增殖和迁移中发挥关键作用2,3。免疫荧光染色显示，TM4SF1 定位于胞周囊泡和质膜，并富集于TM4SF1 enriched microdomains（TMED，TM4SF1 富集微区）。TMED 将纳米突起锚定在基质上，并以规则间隔呈带状分布，每 1–3 TMED/µm 纳米突起长度。在细胞极化运动过程中，纳米突起通常从细胞的前导边缘和尾随后端延伸而出。由于 TMED 具有牢固的黏附特性，当细胞向前移动时，纳米突起无法回缩至细胞内部，因而遗留下的纳米突起残迹可标记出细胞运动的路径。纳米突起为 F-肌动蛋白的延伸与回缩提供膜通道，同时也是细胞间相互作用与信号交流的位点2,3。这些特性表明，纳米突起为研究细胞极化过程中 F-肌动蛋白组装机制、细胞对微环境的感知、细胞运动路径与方向的确定，以及细胞间相互作用与通讯提供了独特的研究机会。
由于TMED具有高度疏水性，且纳米突起（nanopodia）具有薄而脆弱的膜状结构，因此在操作过程中需格外小心以保持TMED和纳米突起的完整性。常规实验方法可能会破坏纳米突起并去除TMED，这可能是自1986年首次发现TM4SF1以来，相关研究论文仅有63篇发表1&#160;，以及在2009年报道内皮细胞中TM4SF1的存在之前，一直完全缺乏关于其在细胞表面100–300 μm微区中富集现象认知的原因2。
传统的免疫染色方法通常使用乙醇、甲醇或丙酮等有机溶剂固定细胞，并使用0.1%或更高浓度的Triton X-100进行细胞通透5。本文所述的研究对传统方法进行了三项主要改进，以显示TMED和纳米突起：（i）使用37 °C的4%多聚甲醛（PFA）并在37 °C培养箱中固定细胞，（ii）采用温和的室温PBS洗涤，（iii）仅在加入一抗前短暂使用低于0.03%的Triton X-100进行细胞通透，因为高于0.03%的Triton X-100会抽提TM4SF1。
所有四跨膜蛋白均在细胞膜上形成微区6，其中一些在内皮细胞和肿瘤细胞中与TMED共定位2,3。由于CD9、CD81和CD151等四跨膜蛋白广泛表达，本文所述染色方案可推广至缺乏TM4SF1的多种不同细胞类型，用于纳米突起功能的研究。

<table><tbody><tr><td>玻璃圆盘</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>12 mm 直径</td></tr><tr><td>玻璃罐</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-912-310</td><td>经认证洁净透明玻璃直边罐，4 盎司</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td>Fisherfinest 品牌优质普通玻璃显微镜载玻片</td></tr><tr><td>50 ml Falcon管</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>50 ml 高透明度聚丙烯圆锥形离心管，耐受 16,000 rcf。无菌。</td></tr><tr><td>15 ml Falcon管配泡沫架</td><td>康宁</td><td>430790</td><td>Corning 15 ml PP 离心管</td></tr><tr><td>尖头镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-42</td><td>解剖超细尖头镊</td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>BD Bioscience</td><td>353047</td><td>24孔细胞培养板</td></tr><tr><td>150 mm 细胞培养皿</td><td>BD Bioscience</td><td>353025</td><td>150 mm 细胞培养皿</td></tr><tr><td>19 G 1 &amp;frac12; 注射器针头</td><td>BD Bioscience</td><td>309635</td><td>19 G 1 &amp;frac12;</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2701</td><td>Decon的纯乙醇200 proof</td></tr><tr><td>胶原蛋白溶液</td><td>BD Bioscience</td><td>354249</td><td>I 型胶原蛋白，高浓度，大鼠尾部来源，100 毫克</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA 1×</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>DMEM高糖（1倍浓度），液体，含L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Affymetrix</td><td>75889 5 升</td><td>PBS，10 倍浓缩液，pH 7.4</td></tr><tr><td>PFA（多聚甲醛）</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td>PBS 中 4%</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td>胎牛血清</td></tr><tr><td>EGM2-MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM-2 BulletKit、EBM-2 基础培养基 500 ml 及 EGM-2 SingleQuot 试剂盒添加剂 &amp;生长因子</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>溶于水。储存液浓度为4%，工作浓度为0.4%。</td></tr><tr><td>小鼠抗人 TM4SF1 抗体&amp;nbsp;</td><td>默克密理博</td><td>MAB3127</td><td>表位位于胞外结构域</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD9 抗体&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>555370</td><td>表位位于胞外域</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗小鼠二抗</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td>Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG (H+L)</td></tr><tr><td>鬼笔环肽</td><td>Chemicon</td><td>90324</td><td>罗丹明偶联鬼笔环肽</td></tr><tr><td>抗荧光淬灭封片剂&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P-36931</td><td>含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂</td></tr><tr><td>70% 乙醇&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>17.5 ml 乙醇（200度）&lt;br/&gt; 7.5 ml 双重去离子水</td></tr><tr><td>10倍PBS（配制200 ml）</td><td></td><td></td><td>20 ml 10倍PBS&lt;br/&gt; 180 ml 双蒸水</td></tr><tr><td>20% Triton X-100（配制20 ml）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>4 ml Triton X-100&lt;br/&gt; 16 ml 双重去离子水</td></tr><tr><td>4% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; （配制 25 ml）</td><td></td><td></td><td>1 g NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 25 ml 双重去离子水</td></tr><tr><td>50 ng/ml 牛胶原溶液（PBS 配制，配制 5 ml）</td><td></td><td></td><td>50的储备液 &amp;mu;微克/毫升（50 毫升）&lt;br/&gt; 830 &amp;mu;I 型胶原（3 mg）的升&lt;br/&gt; 50 ml PBS</td></tr><tr><td>ICC封闭缓冲液（50 ml）</td><td></td><td></td><td>49 ml PBS&lt;br/&gt; 2% FBS（加入1 ml）&lt;br/&gt; 0.04% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; （加入100） &amp;mu;4% NaN₃ 溶液&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>ICC封闭缓冲液/0.01% Triton X-100（配制50 ml）</td><td></td><td></td><td>50 ml 免疫细胞化学封闭缓冲液&lt;br/&gt; 25 &amp;mu;20% Triton X-100 溶液</td></tr><tr><td>HUVEC&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx&quot;&gt;www.lonza.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PC3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1435</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7&quot;&gt;www.atcc.org&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>细胞培养罩</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td>NU-425（60系列）生物安全柜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 细胞培养箱&amp;nbsp;</td><td>CellStar</td><td>QWJ300DABA</td><td>Cellstar CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 水套式培养箱</td></tr><tr><td>加热垫&amp;nbsp;</td><td>K&amp;amp;H Manufacturing</td><td>1020</td><td>K&amp;amp;H Lectro Kennel 加热垫配免费绒布罩（&lt;a href=&quot;http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5x28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y&quot;&gt;www.amazon.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>离心</td><td>Sorvall</td><td>T6000B</td><td>Sorvall T6000 (B) 台式离心机</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>亮线血细胞计数板</td></tr></tbody></table>

纳米突起——在细胞运动和细胞间相互作用中发挥功能的纤细而脆弱的膜性突起

Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

培养中的贴壁细胞保持极化状态，以支持细胞运动和细胞间相互作用。纳米突起（nanopodia）是内皮细胞和癌细胞中细长、主要不含F-actin的膜性突起，可通过TM4SF1（跨膜-4-超家族成员1）免疫荧光染色观察到。TM4SF1在直径为100–300 μm的TMED（TM4SF1 e富集微环境d含有3至多达14个独立TM4SF1分子的结构域。TMED沿纳米突起间断排列，间距规则，每1至3个TMED为一组 μ微米并牢固地将纳米突起锚定在基质上，从而使纳米突起能够延伸超过100 μ从极化的内皮细胞或肿瘤细胞的前导前端或尾随后端延伸出的膜突起，在细胞移动后会在基质上留下膜残留物。由于TMED和纳米突起（nanopodia）具有极高的脆弱性和温度敏感性，它们长期以来被忽视。常规的洗涤和固定操作会破坏其结构。通过在37 °C下直接使用多聚甲醛（PFA）固定，随后短暂暴露于0.01% Triton X-100再进行染色，可有效保存纳米突起结构。纳米突起为细胞生物学开辟了新的研究视野：它们有望重塑我们对细胞如何感知微环境、远距离识别其他细胞、在近距离接触时启动细胞间相互作用，以及运动、增殖和细胞间通讯相关信号机制的理解。目前建立的用于研究TM4SF1来源纳米突起的方法，可能也适用于研究其他细胞类型中由经典四跨膜蛋白（尤其是广泛表达的CD9、CD81和CD151）介导形成的纳米突起。

步骤1：
如果细胞（例如本研究中使用的 HUVEC 和 PC3 细胞）能够正常生长，则在接种后 30 分钟内会附着于胶原包被的圆片上，随后迅速极化并获得移动能力，并在其移动路径前方伸出纳米突起。图 1A 和 图 1B 分别显示极化且正在增殖的 HUVEC 细胞。图 2A 显示处于可移动状态的极化 PC3 细胞。
步骤 2：
将4% PFA预热至37 °C，于37 °C条件下固定细胞20分钟，并用室温PBS轻柔洗涤，可良好保存细胞状态。通常情况下，分离的单个HUVEC（图1A，1）或PC3（图2A）细胞会呈现极化形态，除非细胞正处于分裂状态（图1B，1）。细胞间相互作用导致细胞连接形成（图1C，1）也常可观察到。纳米突起应出现在细胞周边，F-actin...

纳米突起是从细胞的前导前端或尾随后端延伸出的纤细而脆弱的膜通道，可延伸长达100 μm，用于感知细胞环境。要观察这些细胞结构，必须在37 °C下直接固定，轻柔洗涤，并避免使用乙醇、甲醇或丙酮等有机溶剂以及高浓度的Triton X-100。

培养中的贴壁细胞保持极化状态，以支持细胞运动和细胞间相互作用。纳米突起是细长的、主要的……

本实验的总体目标是通过免疫荧光染色在体外培养的细胞中观察纳米突起结构。首先将目标细胞培养在胶原蛋白包被的玻璃圆片上，以实现该目的。第二步，用温热的PFA将细胞固定在玻片上，随后洗涤细胞，并在室温下用封闭缓冲液孵育一小时。最后一步，用针对TM四、SF一的抗体对细胞进行染色，然后将细胞封片于载玻片上。最终，可通过免疫荧光显微镜观察移动、增殖或相互作用细胞中纳米突起结构的存在。 该技术的意义在于其可应用于人类癌症的治疗与诊断，因为内皮细胞和肿瘤细胞的增殖运动以及细胞间相互作用是血管生成及肿瘤细胞生长过程中的关键环节。示范该实验操作的将有两位研究人员，其中一位是来自实验室的博士后。首先，在细胞培养罩外，将12毫米的玻璃盖玻片放入一个四盎司的玻璃瓶中，并进行高压灭菌；在盖玻片灭菌的同时，将一个含有25毫升70%乙醇的50毫升锥形管放入细胞培养罩内。将一把尖头精细的镊子放入乙醇中浸泡5分钟，然后小心取出镊子并盖上管盖，将镊子置于管口上方静置干燥2分钟。镊子干燥后，用镊子将一个无菌玻璃圆片放入24孔细胞培养板中每个目标孔内。随后，向每个圆片加入500 µL牛胶原蛋白溶液，并将培养板置于37°C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育至少30分钟。在培养皿孵育的同时，滴加完全培养基至细胞中，终止反应，并观察目标细胞。当细胞脱落后，将悬浮细胞收集至15毫升Falcon离心管中，在确认细胞活力高于90%后进行计数。在200 ×g、4°C条件下离心10分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，然后用细胞培养基将细胞重悬并稀释至每毫升含1×10⁵个细胞，置于冰上保存。现在在细胞培养超净台中吸出每孔中的胶原溶液，然后轻轻将500微升细胞悬液滴加到每个包被胶原的圆盘培养基上。根据所需时间培养细胞，以追踪纳米突起活性和细胞迁移。通常情况下，细胞在前30分钟内会附着于玻璃圆盘，1小时内开始极化并迁移，并在随后的数小时内进行细胞间相互作用和细胞分裂。首先，将足量的预温PFA放入37摄氏度培养箱中，孵育30分钟，以固定所有圆盘上的细胞。然后将加热垫放入培养罩内，打开加热垫，并将预热的PFA放在加热垫上。向玻片上添加PFA是保存细胞原有结构最关键的步骤，有助于在不扰动培养细胞的前提下更换培养基并加入PFA。用一只手将培养板倾斜约45度，并将其靠在泡沫支架上，使其在该角度保持稳定。接下来，吸出每个孔中的培养基，然后立即用另一只手将500 µL的PFA沿孔壁加入每个孔中，将膜片继续孵育5分钟。随后，像之前处理细胞培养基一样移除PFA，并用一只手将用过的PFA排入收集管中，同时用另一只手立即向每个孔中加入500 µL室温的PBS。在用PBS洗涤两次后，按前述方法移除最后一次PBS洗涤液，并向每个膜片中加入500 µL免疫化学封闭缓冲液。为了通过荧光显微镜观察纳米突起，首先将每个孔中的免疫细胞化学封闭缓冲液替换为含0.01% Triton X-100的封闭缓冲液，在室温下孵育1小时。然后，在室温下用 300 微升新鲜稀释的抗 TM4SF1 抗体溶液替换 Triton 封闭缓冲液，孵育两小时。接着，按照刚刚演示的方法，用 PBS 洗涤每个圆片三次，每次洗涤时将 PBS 留在圆片上五分钟；最后一次洗涤后，向每孔加入 300 微升新鲜稀释的二抗与 Phin 溶液，并在室温下继续孵育圆片两小时。现在将圆片再次洗涤三次，最后一次用PBS洗涤后，将PBS留在孔中孵育一小时。然后，为每个圆片在一张载玻片上滴加一滴10 µL的Antifa封片介质。接下来，将一支19号、1.5英寸长的注射针头的尖端在硬质表面上轻轻弯曲90度。然后用一只手握住针头，另一只手用尖头镊子轻轻逐个提起玻璃圆片。将每个玻璃圆片正面朝下放置在载玻片的封片介质上，然后小心地将载玻片置于室温下的避光处，过夜干燥。染色后的纳米突起可随后进行成像，或存放在 −20 °C 的载玻片盒中。 正常生长的细胞在接种后30分钟内会附着于包被胶原的圆片上，随后发生极化，并在伸出运动前方的纳米突起后很快变得具有移动性。如图中所示，分离的单个人脐静脉内皮细胞（H-U-V-E-C）通常表现出明显的极化形态，其细胞周边可见嵌入纳米突起内的F-肌动蛋白（F actin）突出结构；PC三细胞则呈现极化形态，其纳米突起指示了PC三细胞的移动路径。当细胞处于分裂状态时（如此处所见的分裂中的人脐静脉内皮细胞），纳米突起通过TME牢固地附着于基质上，并允许F-肌动蛋白在纳米突起内部伸长或回缩。通过纳米突起观察到的导致细胞连接形成的细胞间相互作用，在低温条件下也常被观察到。如本示例所示，使用4°C的PFA固定和冷PBS洗涤会干扰并破坏极化细胞中的纳米突起结构。在冷PFA和冷PBS条件下，增殖细胞将缺乏突起，因而会在纳米突起内观察到F-肌动蛋白回缩现象。同时，由于纳米突起是通过整合素附着于细胞外基质的细长膜突起结构，细胞间连接处会出现人为产生的间隙。可能需要通过图像处理软件中的亮度和对比度功能来增强联合强度，以揭示细胞通过纳米突起残迹的移动路径。本图插图所示即为此类处理结果：人脐静脉内皮细胞（H-U-V-E-C）在胶原包被的玻璃圆片上接种后培养六小时，汇合度达到60%，随后如前所述在37摄氏度下用4% PFA固定，本图显示了该条件下细胞的形态。使用抗CD9抗体揭示纳米突起结构，并用Phalloidin对F-肌动蛋白进行染色，结果表明CD9也定位于纳米突起中。按照该实验步骤操作。还可采用其他方法，如外周血流式细胞术，以回答更多问题，例如，特定治疗如何影响TM四SF一的表达水平，从而影响细胞运动、增殖及细胞内相互作用。观看本视频后，您应能够充分掌握如何进行免疫冷冻切片，以研究微绒毛状结构（nano podia）在细胞运动及细胞间相互作用中的作用。

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