一种快速且特异的微孔板法用于测定培养细胞内外的抗坏血酸

以下实验的总体目标是测定培养细胞或分离细胞中的细胞内或细胞外抗坏血酸水平。该目标通过将细胞提取物或完整细胞与抗坏血酸氧化酶共同孵育，以在后续步骤中选择性地耗尽抗坏血酸来实现。在第一种方法中，细胞提取物与氰化物共同孵育，以依赖抗坏血酸的方式生成亚铁氰化物，从而直接反映提取物中抗坏血酸的含量。

接下来，通过加入三价铁离子将细胞提取物中生成的亚铁氰化物定量氧化为高铁氰化物，从而形成一种可显色的铁-邻菲罗啉复合物（iron two ferne S complex），该复合物可通过分光光度法进行定量测定。在第二种方法中，所有细胞直接与铁螯合剂邻菲罗啉（ferne S）及柠檬酸铁（ferric citrate）共同孵育。实验结果可根据胞外铁复合物的定量且特异性还原情况，反映出细胞内或细胞外抗坏血酸水平的差异。

分光光度法。当前技术相较于已有的方法（如基于HBLC的检测）主要优势在于，这种高特异性的微孔板检测可以非常快速地进行，并且所有样品和标准品均可并行处理，而非串行处理。在开始此操作之前，培养K562悬浮细胞，并在含有细胞提取物的评分BA中制备。

随后，用预冷的 PBS 配制 10 毫摩尔的抗坏血酸储备液。然后仔细配制一系列浓度在 0 至 20 微摩尔之间的抗坏血酸标准品。从每种标准品中小心吸取四份 100 微升等分试样，并将其加入到一排连续的孔中。

在每孔含有 25 微升 PBS 或每毫升 45.5 单位 L-抗坏血酸氧化酶（L-ascorbate oxidase 或 AO）PBS 储备液的 96 孔平底板中，用铝箔覆盖 96 孔板，并在室温下以 550 转/分钟的速度进行圆周振荡混合，持续 5 分钟。

完成后，向所有孔中加入50微升含3.5毫摩尔铁氰化钾的PBS溶液，通过与之前相同的条件对96孔板进行轨道振荡混合，使铁氰化钾的终浓度达到1毫摩尔。立即向每孔加入25微升新鲜配制的含50%乙酸和30%三氯乙酸的溶液。接着，向每孔轨道中加入100微升新鲜配制的普鲁士蓝氰化物测定溶液。

在室温下避光以550 RPM的速度混匀平板30分钟，然后在593纳米波长下读取各孔的吸光度值。开始检测。

首先，通过向三份配对孔中加入 50 微升含每毫升 120 单位 AO 或 HBSD 的溶液，氧化所选孔中的细胞外抗坏血酸，使 AO 的终浓度为每毫升 10 单位。随后，将配对孔标记为“未加 AO”和“加 AO”。在 37 摄氏度下轻轻振荡混匀 5 分钟后，向所有孔中加入 50 微升 2.4 毫摩尔的 Ferne S 溶液，使 Ferne S 的终浓度为 200 微摩尔，然后同上在 37 摄氏度下振荡混匀 5 分钟。

接下来，向所有孔中加入 50 微升新配制的 120 微摩尔柠檬酸铁溶液，使铁和柠檬酸根的终浓度分别为 10 微摩尔和 50 微摩尔。抗坏血酸 FLX 检测结束后充分混匀。迅速吸去每孔上清液，并转移至已做好相应标记的 24 孔板中的各孔内。

随后，取三份各含数微升的上清液加入96孔板中，以测定细胞外抗坏血酸含量。使用微量板分光光度计在593纳米处读取各孔的吸光度值。最后，计算细胞外抗坏血酸含量，结果以每毫克蛋白质含多少毫摩尔抗坏血酸表示。

以下是一组抗坏血酸标准品的典型标准曲线，浓度范围为每孔0至20微摩尔，或每孔0至2纳摩尔抗坏血酸。尽管此处未显示，96孔板在每孔抗坏血酸含量达8纳摩尔时仍保持线性关系，对应样品中抗坏血酸浓度约为80微摩尔。该检测方法可成功检测每孔低于0.25纳摩尔的抗坏血酸水平。

K562 细胞可快速从细胞外的脱氢L-抗坏血酸摄取并积累细胞内抗坏血酸，但不能从抗坏血酸本身摄取。在本代表性实验中，用 PBS 洗涤的 K562 细胞在 PBS 中分别与以下物质于 37 摄氏度孵育 30 分钟：500 微摩尔的抗坏血酸、脱氢L-抗坏血酸、脱氢L-抗坏血酸加 50 微摩尔的细胞松弛素 B、抗坏血酸加 5 毫摩尔的氰化物，或抗坏血酸加 50 单位/毫升的抗坏血酸氧化酶（AO）。细胞内抗坏血酸含量的测定方法如前所述。

K562细胞对脱氢L-抗坏血酸的摄取通过易化性葡萄糖转运蛋白GLUT介导的转运实现，以评估GLUT在脱氢L-抗坏血酸摄取中的作用。在此代表性实验中，K562细胞在与脱氢L-抗坏血酸孵育前，先用不同浓度的细胞松弛素B（cyto B）或二氢细胞松弛素B（dihydro cyto B）进行预处理。需要特别注意的是，尽管细胞松弛素B和二氢细胞松弛素B在微摩尔浓度下均可抑制运动过程，但只有细胞松弛素B（与二氢细胞松弛素B的区别在于存在一个双键）在低微摩尔浓度下即可抑制GLUT依赖性转运。

因此，由于脱氢-L-抗坏血酸的摄取被细胞松弛素B（cyto B）抑制，其IC50小于2.5微摩尔，但不受二氢细胞松弛素B（dihydro cyto B）抑制，脱氢-L-抗坏血酸的摄取可能通过GLUT介导的转运进行。

或者，将洗涤后的细胞在与脱氢-L-抗坏血酸共同孵育时，暴露于浓度递增的GLUT可转运但不可代谢的葡萄糖类似物3-O-甲基-D-葡萄糖，或非GLUT可转运的葡萄糖立体异构体L-葡萄糖中。结果再次表明，GLUT参与了脱氢-L-抗坏血酸的摄取，因为仅在存在GLUT可转运的葡萄糖类似物时，才会出现细胞内抗坏血酸蓄积的抑制现象。在第二个检测中。

可以测定培养细胞中抗坏血酸外流的速率。该特定检测方法非常重要，因为细胞释放抗坏血酸似乎对细胞摄取非转铁蛋白结合铁具有关键调控作用。非转铁蛋白结合铁的摄取被认为与铁过载疾病（如血色病）的病理生理过程相关，同时也与哺乳动物脑内星形胶质细胞与神经元之间的铁交换及铁稳态维持密切相关。

事实上，主要的兴奋性神经递质L-谷氨酸以依赖于L-谷氨酸、通过玻璃体摄取以及可能通过GLT-1介导的细胞肿胀的方式，触发星形胶质细胞释放抗坏血酸。类似地，抗坏血酸从负载抗坏血酸的星形胶质细胞中的释放可被兴奋性氨基酸L-天冬氨酸刺激，但不能被非兴奋性氨基酸L-谷氨酰胺刺激。该效应在此处所示，图中显示了L-天冬氨酸和L-谷氨酰胺对负载抗坏血酸的小鼠原代培养星形胶质细胞释放抗坏血酸的剂量-反应曲线。

如果操作正确，该技术可在短短两小时内完成。