一种快速且特异的微孔板法用于测定培养细胞内外的抗坏血酸

以下实验的总体目标是测定培养细胞或分离细胞中的细胞内或细胞外抗坏血酸水平。该目标通过将细胞提取物或完整细胞与抗坏血酸氧化酶孵育，以在后续步骤中选择性地耗尽抗坏血酸来实现。在第一种方法中，细胞提取物与氰化物孵育，以依赖抗坏血酸的方式生成亚铁氰化物，从而直接反映提取物中抗坏血酸的含量。

接下来，通过加入三价铁离子将细胞提取物中生成的亚铁氰化物定量氧化为高铁氰化物，从而形成一种可显色的铁-邻菲罗啉复合物（iron two ferne S complex），该复合物可通过分光光度法进行定量测定。在第二种方法中，所有细胞直接与铁螯合剂邻菲罗啉（ferne S）及柠檬酸铁（ferric citrate）共同孵育。实验结果可根据胞外铁复合物的定量且特异性还原情况，反映出细胞内或细胞外抗坏血酸水平的差异。

通过光谱法进行检测。当前技术相较于已有的基于HBLC的检测方法的主要优势在于，这种高特异性的微孔板检测可以快速完成，并且所有样品和标准品均可并行处理，而非以串联方式进行。在开始此操作之前，需培养K562悬浮细胞，并制备含有细胞提取物的裂解液。

随后，用预冷的 PBS 配制 10 毫摩尔的抗坏血酸储备液。然后仔细配制一系列浓度在 0 至 20 微摩尔之间的抗坏血酸标准品。从每种标准品中小心吸取四份 100 微升等分试样，并将其加入横向排列的孔中。

在每孔含有25微升PBS或每毫升45.5单位L-抗坏血酸氧化酶（AO）PBS储备液的96孔平底板中，用铝箔覆盖96孔板，并在室温下以550转/分钟的速度振荡混合5分钟。

完成后，向所有孔中加入50微升含3.5毫摩尔铁氰化钾的PBS溶液，通过与之前相同的条件对96孔板进行振荡混匀，使铁氰化钾的终浓度达到1毫摩尔。立即向每孔加入25微升新鲜配制的含50%乙酸和30%三氯乙酸的溶液。接着，向每孔中加入100微升新鲜配制的普鲁士蓝显色液。

在室温下避光以 550 RPM 振荡混匀平板 30 分钟。然后在 593 纳米处读取各孔的吸光度值。开始检测。

首先，通过向三份配对孔中加入 50 微升含每毫升 120 单位 AO 或 HBSD 的溶液，氧化所选孔中的细胞外抗坏血酸，使 AO 的终浓度为每毫升 10 单位。随后，将配对孔标记为“不含 AO”和“含 AO”。在 37 摄氏度下轻轻振荡混匀 5 分钟后，向所有孔中加入 50 微升 2.4 毫摩尔的 Ferne S 溶液，使 Ferne S 的终浓度为 200 微摩尔，然后同上在 37 摄氏度下振荡混匀 5 分钟。

接下来，向所有孔中加入 50 微升新鲜配制的 120 微摩尔柠檬酸铁溶液，使铁和柠檬酸根的终浓度分别为 10 微摩尔和 50 微摩尔。在抗坏血酸 FLX 测定结束时充分混匀。迅速吸去每孔中的上清液，并转移至已做好相应标记的 24 孔板中的各孔内。

随后，取三份上清液各 3 µL 加入 96 孔板中，用于测定细胞外抗坏血酸含量。使用酶标分光光度计在 593 nm 处读取各孔的吸光度值。最后，根据所示结果计算每毫克蛋白质所含细胞外抗坏血酸的量（以 m 抗坏血酸计）。

这是一个典型的抗坏血酸标准品标准曲线，浓度范围为每孔0至20微摩尔，或每孔0至2纳摩尔抗坏血酸。尽管未在此处显示，96孔板的线性关系可维持至每孔8纳摩尔抗坏血酸，相当于样品中抗坏血酸浓度约为80微摩尔。该检测方法可成功检测每孔低于0.25纳摩尔抗坏血酸的水平。

K 5 62 细胞能够快速从细胞外的脱氢-L-抗坏血酸而非抗坏血酸本身积累细胞内抗坏血酸。在此代表性实验中，经 PBS 洗涤的 K 5 62 细胞在 37 摄氏度下，于含有以下物质的 PBS 中孵育 30 分钟：500 微摩尔的抗坏血酸、脱氢-L-抗坏血酸、脱氢-L-抗坏血酸加 50 微摩尔的细胞松弛素 B、抗坏血酸加 5 毫摩尔的氰化物，或抗坏血酸加每毫升 50 单位的抗坏血酸氧化酶（AO）。细胞内抗坏血酸含量的测定方法如前所述。

K562细胞对脱氢L-抗坏酸的摄取通过促进性葡萄糖转运蛋白GLUT介导的转运实现。为评估GLUT在脱氢L-抗坏酸摄取中的作用，在本代表性实验中，K562细胞在与脱氢L-抗坏酸孵育前，先用浓度递增的细胞松弛素B（cyto B）或二氢细胞松弛素B（dihydro cyto B）进行预孵育。需要特别指出的是，尽管细胞松弛素B和二氢细胞松弛素B在微摩尔浓度下均可抑制运动过程，但只有细胞松弛素B（与二氢细胞松弛素B的区别在于存在一个双键）在低微摩尔浓度下即可抑制GLUT依赖性转运。

因此，由于脱氢-L-抗坏血酸的摄取可被细胞松弛素B（cyto B）抑制，其IC50小于2.5微摩尔，但不受二氢细胞松弛素B（dihydro cyto B）抑制，脱氢-L-抗坏血酸的摄取可能通过GLUT介导的转运进行。

或者，将洗涤后的细胞在与脱氢-L-抗坏血酸共同孵育期间暴露于浓度递增的GLUT可转运但不可代谢的葡萄糖类似物3-O-甲基-D-葡萄糖，或非GLUT可转运的葡萄糖立体异构体L-葡萄糖。结果再次表明，GLUT参与了脱氢-L-抗坏血酸的摄取，因为仅在存在GLUT可转运葡萄糖类似物的情况下，才会出现细胞内抗坏血酸蓄积的抑制现象。在第二个检测实验中。

可以测定培养细胞中抗坏血酸外流的速率。该特定检测方法非常重要，因为细胞释放抗坏血酸似乎对细胞摄取非转铁蛋白结合铁具有关键调控作用。非转铁蛋白结合铁的摄取被认为与铁过载性疾病（如血色病）的病理生理过程相关，同时也与哺乳动物大脑中星形胶质细胞与神经元之间的铁交换及铁稳态维持密切相关。

事实上，主要的兴奋性神经递质L-谷氨酸以依赖于L-谷氨酸、通过玻璃体摄取以及可能通过GLT-1介导的细胞肿胀的方式，触发星形胶质细胞释放抗坏血酸。类似地，抗坏血酸从负载抗坏血酸的星形胶质细胞中的释放可被兴奋性氨基酸L-天冬氨酸刺激，但不能被非兴奋性氨基酸L-谷氨酰胺刺激。该效应在此处所示，图中展示了L-天冬氨酸和L-谷氨酰胺对负载抗坏血酸的小鼠原代培养星形胶质细胞释放抗坏血酸的剂量-反应曲线。

如果操作正确，该技术可在短短两小时内完成。