Name: DNA交联聚丙烯酰胺水凝胶的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学习制备DNA交联聚丙烯酰胺水凝胶的方法，用于研究基质刚度对细胞行为的影响。该技术通过添加单链DNA动态调节凝胶弹性，无需紫外光刺激，可应用于组织工程和细胞生物学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者谨此致谢：Frank Jiang 博士、David Lin 博士、Bernard Yurke 博士和 Uday Chippada 博士在开发 DNA 凝胶技术方面的贡献；Norell Hadzimichalis 博士、Smit Shah、Kimberly Peterman 和 Robert Arter 对本稿件提出的评论与修改意见；资助机构包括新泽西州脊髓研究委员会（资助号 #07A-019-SCR1，N.A.L.）和新泽西神经科学研究所（M.L.P.）；以及《组织工程，A 部分》（Tissue Engineering, Part A）出版社授权重印图 2和图 4，以及《生物材料》（Biomaterials）出版社授权重印图 3。

<ol><li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly+A+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+equilibrium+swelling+behaviour+of+ph-sensitive+hydrogels+containing+2-hydroxyethyl+methacrylate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate.</a> Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).</li>
<li>Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+elastomeric+biomaterials+based+on+resilin-like+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides.</a> Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).</li>
<li>Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+behavior+on+shape+memory+polymer+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates.</a> Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repositioning+of+cells+by+mechanotaxis+on+surfaces+with+micropatterned+youngs+modulus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus.</a> J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).</li>
<li>Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ions+on+the+dynamic+behavior+of+an+electrodriven+ionic+polymer+hydrogel+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane.</a> Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).</li>
<li>Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+swelling+of+polyacrylate+hydrogels+in+physiological+salt+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+on+a+DNA+crosslinked+hydrogel+with+tunable+stiffnesses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses.</a> Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dynamic+stiffness+of+the+substrates+on+neurite+outgrowth+by+using+a+DNA-crosslinked+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+fibroblast+growth+and+the+dynamic+stiffnesses+of+a+DNA+crosslinked+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel.</a> Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).</li>
<li>Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+photodegradable+hydrogels+as+dynamically+tunable+cell+culture+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).</li>
<li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+a+reversible%2C+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel.</a> J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).</li>
<li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+rigid+spherical+inclusions+in+young%27s+moduli+determination%3A+Application+to+DNA-crosslinked+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels.</a> J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).</li>
<li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+immobilization+of+biomolecules+to+agarose+hydrogels+for+controlled+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response.</a> Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).</li>
<li>Marklein, R. A., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+controlled+hydrogel+mechanics+to+modulate+stem+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions.</a> Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).</li>
<li>Pelham Jr, R. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogels+with+increasing+crosslinker+density%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density.</a> BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).</li>
<li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+and+cell+density+on+primary+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures.</a> J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).</li>
<li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendrite+arborization+by+substrate+stiffness+is+mediated+by+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors.</a> Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).</li>
<li>Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+morphology+on+dynamic+softening+of+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels.</a> Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+characterization+of+the+injured+spinal+cord+after+lateral+spinal+hemisection+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat.</a> J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+in+3d+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).</li>
<li>Wozniak, M. A., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+in+development+A+growing+role+for+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction in development A growing role for contractility.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).</li>
<li>Wuerfel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mr-elastography+reveals+degradation+of+tissue+integrity+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis.</a> Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).</li>
<li>Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photopolymerization+in+microfluidic+gradient+generators+Microscale+control+of+substrate+compliance+to+manipulate+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response.</a> Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

DNA凝胶在细胞黏附前后能够发生软化或硬化，这一特性使其成为研究动态组织刚度对细胞功能影响的理想模型。这三种设计均已用于力学和生物学研究中。然而，在不同交联百分比下，这三种设计的弹性相似，表明DNA凝胶的弹性不受交联长度的影响（表2）。相比之下，丙烯酰胺浓度会影响凝胶的弹性。这些设计在交联动力学方面可能存在差异，因为凝胶破裂倾向（即凝胶在培养基或缓冲液中溶解的趋势）随交联长度的增加而降低。然而，目前关于DNA凝胶的动力学信息仍然有限，但我们已知在L2递送至50% DNA凝胶后两天，还会额外发生约30%的交联11。尽管如此，凝胶软化和硬化分别产生扩张力和收缩力的现象不可避免，且无法分离18,21。100→70%的凝胶可产生约0.5 Pa的应力21，而50→100%的凝胶仅产生约0.04 Pa的应力，因为三条单链DNA之间形成化学键需要消耗更多能量18。因此，对实验结果的解读必须考虑凝胶硬化和软化所引起的应力与应变。
在制备DNA凝胶时可能会遇到技术挑战。最常见的技...

静态和动态基底是为研究组织弹性或刚度对细胞功能影响而开发的两类生物材料。静态基底在制备完成和/或细胞接种后，无法改变其物理特性。聚丙烯酰胺（PA）凝胶是用于力学生物学研究的首批二维静态基底5,17。PA凝胶易于制备、成本低廉、用途广泛，且可制备出具有广泛弹性模量范围的材料。尽管这些技术优势使PA凝胶成为常用的基底材料，但静态基底并不能反映体内细胞外基质（ECM）及周围细胞环境的动态特性。例如，ECM会因损伤、发育或疾病而发生刚度变化。因此，在力学生物学研究中，动态基底更受青睐，被视为更接近组织特性的模拟模型22,24,25。
已开发出多种合成的、天然的、二维的、三维的、静态的和动态的生物材料，以模拟组织刚度1,3,6,16,23,26。一些动态基质需要通过热、紫外光、电流、离子或pH变化来改变其力学性能2,4,7,8,12,15,16，但这些刺激可能限制水凝胶的生物应用。DNA交联的聚丙烯酰胺水凝胶（DNA凝胶）是一种动态二维弹性基质。通过向培养基或缓冲液中添加单链DNA（ssDNA），可实现对DNA凝胶刚度的时间、空间及可逆性调控9-11,13,14,18,21。与上述需施加刺激以调节弹性的动态凝胶不同，DNA凝胶依赖于所加ssDNA的扩散来改变弹性。因此，由于弹性调节速率依赖于凝胶厚度，细胞生长的上层凝胶表面成为最先被调控的区域。
DNA 凝胶与聚丙烯酰胺（PA）凝胶类似，均具有聚丙烯酰胺骨架，但其双丙烯酰胺交联结构被由 DNA 组成的交联结构所取代（图1）。两条单链 DNA（SA1 和 SA2）与一条交联链（L2）杂交，形成凝胶中的 DNA 交联结构。SA1 和 SA2 具有不同的序列，且在 5´ 端均含有 Acrydite 修饰，以有效整合到 PA 网络中。制备凝胶时，SA1 和 SA2 分别聚合进入 PA 骨架，随后将聚合后的 SA1 和 SA2 混合。再向 SA1 与 SA2 的混合物中加入交联链 L2。L2 的碱基序列与 SA1 和 SA2 的序列互补，可与 SA1 和 SA2 杂交，从而形成 DNA 交联结构。初始状态下，DNA 凝胶的弹性由 L2 的浓度和交联程度共同决定（表1 和 表2）。当 L2、SA1 和 SA2 含有等化学计量比时，所形成的凝胶最坚硬，因为此时 SA1 和 SA2 被 L2 完全交联（定义为 100% 凝胶）。较低浓度的 L2 会导致 DNA 交联比例降低，因此形成较软的 DNA 凝胶。目前已成功构建交联度低至 50% 的凝胶（定义为 50% 凝胶）9-11。
<img alt="DNA连续编辑过程；示意图；使用SA1、SA2、R2的步骤；涉及光谱分析。" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. DNA凝胶交联与去交联示意图9-11,13,14,18,21。 步骤1：SA1（红色）和SA2（蓝色）分别聚合到聚丙烯酰胺主链（黑色）中。聚合完成后，将SA1和SA2的聚合溶液混合。步骤2：加入L2（绿色），并与SA1及SA2杂交，形成凝胶的交联结构。步骤3：R2与L2的黏性末端发生杂交。步骤4：R2的黏性末端杂交推动L2从SA1和SA2上解链。
与PA凝胶不同，DNA凝胶在合成后可发生硬化或软化。因此，生长在DNA凝胶上的细胞可经历动态的刚度变化。为了使细胞附着的凝胶硬化，可在低交联度凝胶的培养基中加入L2，以增加交联比例。为了使细胞附着的凝胶软化，可去除L2以降低交联比例10,13,21。L2在3´端具有一段额外的趾端序列，使其能够从SA1和SA2上解离（表1）。L2的去除通过加入一条称为R2的逆转链实现。R2与L2全长互补，并首先与L2的趾端序列杂交。趾端杂交促使L2从SA1和SA2上逐步解链，从而消除交联，降低凝胶刚度。
本报告及视频中提供了制备硬化和软化 DNA 凝胶的逐步操作说明。尽管文中描述了 100% 和 80% 凝胶的制备方法，但该方案可进行调整，以制备其他初始和最终交联百分比的 DNA 凝胶。通常，制备 100% 和 80% 凝胶后，将其固定在玻璃盖玻片上，进行功能化处理，并接种细胞。接种细胞 48 小时后，向 80% 凝胶的培养基中加入 L2，向 100% 凝胶的培养基中加入 R2。向培养基中添加 L2 可使 80% 凝胶硬化至 100% 交联状态，而添加 R2 则可使 100% 凝胶软化至 80% 交联状态。在文中，硬化后的凝胶记为 80→100% 凝胶，软化后的凝胶记为 100→80% 凝胶。对于对照组或静态凝胶，向另一组 100% 和 80% 凝胶中加入由 T 或 A 组成的 ssDNA。在弹性调控至少两天后，可对细胞进行处理和分析。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody align="center">
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">DNA 交联</td>
			<td rowspan="2">碱基数</td>
			<td>序列（启动区）</td>
			<td rowspan="2">修饰</td>
			<td rowspan="2">熔解温度 (Tm, °C)</td>
			<td rowspan="2">备注</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5'→3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">设计 1</td>
			<td>SA1</td>
			<td>10</td>
			<td>GCA CCT TTG C</td>
			<td>5' Acrydite</td>
			<td>34.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA2</td>
			<td>10</td>
			<td>GTC AGA ATG A</td>
			<td>5' Acrydite</td>
			<td>23.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>30</td>
			<td>TCA TTC TGA CGC AAA GGT GCG CTA CAC TTG</td>
			<td></td>
			<td>56</td>
			<td>包含一个 10 bp 的启动区序列。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2</td>
			<td>30</td>
			<td>CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>R2 与 L2 互补</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">设计 2</td>
			<td>SA1</td>
			<td>14</td>
			<td>CGT GGC ATA GGA CT</td>
			<td>5' Acrydite</td>
			<td>46.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA2</td>
			<td>14</td>
			<td>GTT TCC CAA TCA GA</td>
			<td>5' Acrydite</td>
			<td>40.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>40</td>
			<td>TCT GAT TGG GAA ACA GTC CTA TGC CAC GGT TAC CTT CAT C</td>
			<td></td>
			<td>65.9</td>
			<td>包含一个 12 bp 的启动区序列。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2</td>
			<td>40</td>
			<td>GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A</td>
			<td></td>
			<td>65.9</td>
			<td>R2 与 L2 互补</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">设计 3</td>
			<td>SA1</td>
			<td>20</td>
			<td>ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC</td>
			<td>5' Acrydite</td>
			<td>55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA2</td>
			<td>20</td>
			<td>CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA</td>
			<td>5' Acrydite</td>
			<td>56.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>40</td>
			<td>TCC AGT CGT CCC TAA GCA TGG ACA TTG CAT ACA CCT CCG T</td>
			<td></td>
			<td>68.8</td>
			<td>未包含启动区。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">对照</td>
			<td rowspan="2">对照</td>
			<td rowspan="2">20-40</td>
			<td>AAA AAA (等等) 或</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTT TTT (等等)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 单链DNA的碱基序列9-11,13,14,18,21。 细胞和力学研究已采用多种不同的交联设计，以生成具有不同静态和动态力学性能的DNA凝胶。交联设计中可调节的参数包括碱基序列、序列长度或交联长度。加粗且斜体的字体分别表示SA1与L2之间以及SA2与L2之间的碱基配对。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody align="center">
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td colspan="8">设计</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">1</td>
			<td colspan="3">2</td>
			<td colspan="2">3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>丙烯酰胺浓度 (%)</td>
			<td colspan="3">10</td>
			<td colspan="3">10</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA1 与 SA2 杂交至 L2 的比例 (% 交联)</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>弹性模量 (kPa, 均值±标准误)</td>
			<td>6.6 ± 0.6</td>
			<td>17.1 ± 0.8</td>
			<td>29.8 ± 2.5</td>
			<td>5.85± 0.62</td>
			<td>12.67 ± 1.33</td>
			<td>22.88 ± 2.77</td>
			<td>25.2 ± 0.5</td>
			<td>10.4 ± 0.6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. DNA凝胶的杨氏模量（E）9-11,13,14,18,21。 DNA凝胶中的丙烯酰胺浓度、交联百分比和交联长度均可调节。设计1、2和3的交联长度分别为20、28和40个碱基对（bp）。所有设计的100%凝胶具有相似的模量，表明交联长度不影响凝胶的弹性。然而，丙烯酰胺浓度的变化会改变DNA凝胶的弹性。

<table><tbody><tr><td>单链DNA（ssDNA）</td><td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)&lt;br/&gt;idtdna.com</td><td></td><td>切勿涡旋混匀ssDNA。应轻柔颠倒管体和/或使用移液器轻轻吹打混匀。</td></tr><tr><td>含钙和镁的PBS</td><td></td><td></td><td>任何品牌均可。</td></tr><tr><td>100倍浓度Tris-EDTA缓冲液（TE缓冲液）</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)&lt;br/&gt;sigmaldrich.com</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>10倍浓度Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE缓冲液）</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>93290</td><td>TBE为生殖毒性物质。</td></tr><tr><td>40%丙烯酰胺溶液</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>BP14021</td><td>丙烯酰胺为有毒物质。</td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>A3678</td><td>用TE缓冲液配制2%溶液。APS为有毒且具刺激性的物质。</td></tr><tr><td>四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>T9281</td><td>用TE缓冲液配制20%溶液。TEMED易燃、具腐蚀性且为有毒物质。</td></tr><tr><td>直径12 mm圆形盖玻片</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)&lt;br/&gt;fishersci.com</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Norland光学胶72（Norland optical adhesive 72）</td><td>Norland Products (Cranbury, NJ)&lt;br/&gt;norlandprod.com</td><td>NOA72</td><td></td></tr><tr><td>24孔组织培养板</td><td></td><td></td><td>任何品牌均可。</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td></td><td></td><td>任何品牌均可。</td></tr><tr><td>磺基-SANPAH（Sulfo-SANPAH）</td><td>ProteoChem 或 Thermo Fisher (Rockland, IL)&lt;br/&gt;proteochem.com 或 thermofisher.com</td><td>C111 或 22589</td><td>使用前立即用水配制0.315 mg/ml溶液。在37 &amp;deg;C下溶解并过滤除菌。滤膜上残留未溶解的磺基-SANPAH属正常现象。磺基-SANPAH对光敏感，因此溶液在紫外照射前应避光保存。</td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸（PDL）</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>P6407</td><td>用水配制0.2 mg/ml溶液，并过滤除菌。</td></tr><tr><td>I型胶原蛋白（Collagen Type I）</td><td>Affymetrix (Santa Clara, CA)&lt;br/&gt;affymetrix.com</td><td>13813</td><td>用0.2 N乙酸配制0.2 mg/ml溶液。溶液必须始终保持低温，以防止聚合。乙酸为易燃、有毒且具腐蚀性的物质。</td></tr><tr><td>22 × 60 盖玻片</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>正向置换移液器</td><td>Gilson, Inc (Middletown, WI)&lt;br/&gt;gilson.com</td><td>F148504</td><td></td></tr><tr><td>加热金属块（Heat block）</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>紫外光源（UV light source）</td><td></td><td></td><td>将凝胶尽可能靠近紫外光源放置。紫外光可能造成皮肤或眼睛损伤。</td></tr><tr><td>温度计</td><td></td><td></td><td>任何品牌均可。</td></tr><tr><td>氮气</td><td>GTS-Welco (Flemington, NJ)&lt;br/&gt;www.praxairmidatlantic.com/</td><td>NI 5.0UH-R</td><td></td></tr></tbody></table>

dna交联聚丙烯酰胺凝胶的制备

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

机械生物学是一个新兴的科学领域，致力于研究物理信号在调控细胞形态和功能中的关键作用。例如，组织弹性对细胞功能的影响是机械生物学研究的一个重要方向，因为组织刚度会随着疾病、发育和损伤而发生变化。目前主要使用静态的模拟组织材料，即细胞接种后无法改变其刚度的材料，来研究组织刚度对细胞功能的影响。尽管静态研究获得的信息具有重要价值，但这些研究并不能反映细胞微环境的动态特性。 体内为了更好地研究动态刚度对细胞功能的影响，我们开发了一种DNA交联的聚丙烯酰胺水凝胶系统（DNA凝胶）。与其他动态基质不同，DNA凝胶在制备完成后无需外界刺激即可实现刚度的降低或增加。DNA凝胶由嵌入聚丙烯酰胺骨架中的DNA交联结构组成。通过递送单链DNA来添加或移除交联点，可实现对凝胶弹性在时间、空间上的可逆调控。我们先前的研究已表明，DNA凝胶弹性的动态调节可影响成纤维细胞和神经元的行为。在本报告及视频中，我们提供了描述DNA凝胶交联机制的示意图，以及制备DNA凝胶的分步操作指南。

在本研究之前，细胞-细胞外基质（ECM）相互作用通常在静态且力学性能恒定的生物材料上，或在不可逆且单向变化的动态基底上进行观察。这些基底无法准确反映细胞微环境的动态特性。我们的工作通过提供一种更接近生理条件的模型，推动了现有技术范式的转变，使细胞-ECM相互作用能够在发生软化和硬化变化的动态生物材料上进行研究。在先前的研究中，我们通过分析细胞在这些凝胶上的多种形态和表型，评估了动态基底对细胞的影响。其中一个例子中，我们通过在动态DNA凝胶上评估成纤维细胞的形态，确定了基底硬化对成纤维细胞的影响。将来源于小鼠的L929成纤维细胞接种于80%和100%交联度的凝胶上（图3）11。接种后两天，向80%凝胶的培养基中加入20%额外的L2溶液，使凝胶硬化至100%交联状态（80→100%，中图）。100%凝胶和另一组80%凝胶则加入对照单链DNA（ssDNA），以维持其静态状态（右图和左图分别对应）。在向培养基中加入DNA两天后采集明场显微图像。如图3所示，图像模糊是由于凝胶表面不平整所致，属于典型且不可避免的现象。缓冲液和L2的加入引起的凝胶溶胀与收缩<s...

本实验室开发了DNA交联的聚丙烯酰胺水凝胶，这是一种动态水凝胶系统，旨在更深入地理解调控组织刚度对细胞功能的影响。本文提供了制备此类水凝胶的示意图、说明及操作方案。

DNA交联聚丙烯酰胺凝胶的制备

力学生物学是一个新兴的科学领域，旨在研究物理信号在调控细胞形态和功能中的关键作用。例如，……

本实验的总体目标是制备一种DNA交联的聚丙烯酰胺水凝胶，当细胞接种于其表面后，通过向培养基中移液单链DNA，可使该水凝胶发生硬化或软化。该目标的实现分为两个步骤：首先，将冻干的SA1、SA2、L2、R2及对照单链DNA在缓冲液中重悬，并分别将SA1和SA2溶液聚合到聚丙烯酰胺骨架中；第二步，将SA1和SA2的聚合溶液与L2溶液混合，形成DNA水凝胶。接下来，将DNA凝胶溶液用光学胶固定在玻璃盖玻片上。最后一步是通过磺胺帕（sul sampa）和聚-D-赖氨酸（PDL）处理对凝胶进行功能化。最终，将细胞接种到DNA凝胶上，并分别通过添加R two L two或对照单链DNA来调节凝胶弹性，从而使其变软、变硬或不改变凝胶弹性。这些实验的结果表明，底层基质的动态特性可直接调控细胞行为。与CROs、lingo、球形水凝胶等其他方法相比，DNA凝胶的优势在于其弹性调节无需依赖紫外光等外部刺激。相反，DNA凝胶可通过向凝胶中分别扩散L2或R2单链DNA来实现硬化或软化。首先，将冻干的SA1单链DNA在2000 × g下离心15秒，以确保所有单链DNA均位于离心管底部。离心后，通过向管中加入107微升1×Tris、EDTA或TE缓冲液，制备3毫摩尔的SA one溶液。随后，将SA one NTE缓冲液在70摄氏度加热5分钟，或直至单链DNA沉淀完全溶解。接着，通过加入45微升40%丙烯酰胺和18微升10×Tris、EDTA或TBE缓冲液，制备SA one聚合溶液，并进行离心，以促进混合。插入一个P200枪头，连接氮气源，将氮气缓慢通入溶液中，持续两到三分钟。接着，将样品在2000 ×g条件下离心15秒，使溶液沉降至管底。完成后，向样品中加入4.5 µL的2%过硫酸铵（APS），以启动凝胶聚合反应，然后反复倒置离心管数次以混匀。再次离心样品，使溶液聚集，确保聚合均匀。随后，向样品中加入4.5 µL的20%四甲基乙二胺（TEMED），以催化聚合反应。待样品完成混合和离心后，用氮气对溶液脱气3至5分钟，以完成聚合过程，并减少未反应的单体残留。随后，将溶液在室温下孵育10分钟，以完成聚合反应，得到SA一聚合溶液。用冻干的SA二单链DNA重复前述步骤，向108微升的SA二溶液中分别加入45、18、4、0.5和4.5微升的丙烯酰胺、T-B-E-A-P-S和teed。为制备L二、R二及对照溶液，离心、冻干单链DNA，并按照前述方法向相应的冻干单链DNA中加入如下体积的TE缓冲液，加热溶液至完全溶解，用于凝胶溶液的制备。将SA1和SA2聚合溶液在70摄氏度下加热约一分钟，直至溶液黏度降低。向10微升（或10份）SA2聚合溶液中加入10微升（或10份）SA1聚合溶液。然后，将SA一和SA二的聚合溶液混合，交替进行以下操作：在70摄氏度下加热15秒，再用移液管枪头搅拌15秒，总时长为1分钟。

preparation-of-dna-crosslinked-polyacrylamide-hydrogels

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

DNA交联聚丙烯酰胺水凝胶的制备

我们介绍了将细胞包封于合成水凝胶中的三维（3D）技术方案。文中概述了两种常用的交联方法（迈克尔加成反应和光引发自由基反应）的包封步骤，以及多种用于评估包封后细胞行为的技术。...

用于组织工程的三维水凝胶细胞包封

基底硬度对细胞功能的影响可被模拟 体外...

利用基于丙烯酰胺的水凝胶研究基质刚度对细胞功能的影响

在本视频中，我们演示了用于制备适用于细胞培养的柔性、细胞外基质（ECM）包被基底的实验技术，这些基底可用于牵引力显微镜检测，并可用于观察细胞外基质刚度对细胞行为的影响。...

用于量化细胞收缩的投诉基质的制备

我们介绍一种新型聚丙烯酰胺水凝胶，称为羟基-PAAm，可实现细胞外基质蛋白的直接结合，且成本低廉、操作简便。将羟基-PAAm水凝胶与微接触印刷技术结合，可独立调控天然细胞微环境中的多种信号，从而用于研究细胞力学转导。...

用于解耦机械转导信号影响的羟基-PAAm水凝胶的制备

肿瘤微环境中的机械刚度通过增强侵袭伪足活性和肌动球蛋白收缩力，在驱动恶性行为中起着关键作用。利用聚丙烯酰胺凝胶（PAAs），可通过侵袭伪足和牵引力测定方法研究癌细胞对基质刚度响应的侵袭性和收缩性特征。...

用于癌细胞侵袭足和牵引力测定的聚丙烯酰胺凝胶

本文介绍了一种可在多孔板中快速、高效且低成本制备聚丙烯酰胺凝胶的方法。该方法无需任何专用设备，任何研究实验室均可轻松采用。该方法在致力于研究刚度依赖性细胞反应的研究中尤为有用。...

基于聚丙烯酰胺的简易多孔硬度检测法用于研究细胞对基质硬度的依赖性反应

细胞分化受到多种微环境因素的调控，包括基质成分和基底材料特性。本文介绍一种技术，该技术结合细胞微阵列与牵引力显微镜，用于评估在不同微环境背景下细胞的分化状态以及细胞与基底之间的生物力学相互作用。...

一种用于细胞分化与牵引力相关性分析的高通量细胞微阵列平台

本方案通过凝胶电泳和凝胶成像观察近红外荧光标记DNA的变化，描述了DNA聚合酶合成修饰DNA的表征方法。丙烯酰胺凝胶可用于高分辨率成像短核酸片段的分离，这些片段根据大小不同而以不同速率迁移。...

利用近红外荧光标记DNA并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可视化的DNA聚合酶活性检测

尽管细胞外基质（ECM）硬度是调控细胞行为的关键因素，但其潜在的感知与信号转导机制仍不明确。为解决这一问题，我们提供了可调节硬度的聚丙烯酰胺和硅胶基底的制备方案，以促进对细胞-ECM相互作用机制的理解。...

用于细胞生物学研究的具有确定刚度的聚丙烯酰胺和硅胶细胞外基质基底的制备

传统上，视网膜的垂直切片和整体装片制备方法被用于研究视网膜神经环路的功能。本文中，我们描述了一种新型切片方法，可完整保存视网膜神经元的树突形态。...

视网膜水平切片制备

学习制备DNA交联聚丙烯酰胺水凝胶的方法，用于研究基质刚度对细胞行为的影响。该技术通过添加单链DNA动态调节凝胶弹性，无需紫外光刺激，可应用于组织工程和细胞生物学研究。

DNA交联聚丙烯酰胺凝胶的制备

探索更多视频