DNA交联聚丙烯酰胺凝胶的制备
2014年8月27日
本实验室开发了DNA交联的聚丙烯酰胺水凝胶，这是一种动态水凝胶系统，旨在更深入地理解调控组织刚度对细胞功能的影响。本文提供了制备此类水凝胶的示意图、说明及操作方案。
本实验的总体目标是制备一种DNA交联的聚丙烯酰胺水凝胶，当细胞接种于其表面后，通过向培养基中移液单链DNA，可使该水凝胶发生硬化或软化。该目标的实现首先需要将冻干的SA1、SA2、L2、R2以及对照单链DNA在缓冲液中重悬，并分别将SA1和SA2溶液聚合到聚丙烯酰胺骨架中。第二步是将SA1和SA2的聚合溶液与L2溶液混合，从而形成DNA水凝胶。
接下来，将DNA凝胶溶液用光学胶固定在玻璃盖玻片上。最后一步是通过磺胺帕（sul sampa）和聚-D-赖氨酸（PDL）处理对凝胶进行功能化。最终，将细胞接种到DNA凝胶上，并分别通过添加R two L two或对照单链DNA来调节凝胶弹性，以实现软化、硬化或不改变凝胶弹性。
这些实验的结果表明，底层基质的动态特性可直接调控细胞行为。与CROs、lingo、球形水凝胶等其他方法相比，DNA凝胶的优势在于其弹性调节无需依赖紫外光等外部刺激。相反，DNA凝胶可通过向凝胶中分别扩散L2或R2单链DNA来实现硬化或软化。首先，将冻干的SA1单链DNA在2000 × g下离心15秒，以确保所有单链DNA均位于离心管底部。
离心后，通过向管中加入107微升1×三羟甲基氨基甲烷-EDTA（TE）缓冲液，配制3毫摩尔的SA一溶液。随后将SA一NTE缓冲液在70摄氏度加热5分钟，或直至单链DNA沉淀完全溶解。接着，通过加入45微升40%丙烯酰胺和18微升10×三羟甲基氨基甲烷-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液配制SA一聚合溶液，并进行离心，以促进混合。
插入一个P200枪头，连接氮气源，将氮气缓慢通入溶液中，持续两到三分钟。接着，将样品在2000 ×g下离心15秒，使溶液沉降至管底。随后，向样品中加入4.5 µL的2%过硫酸铵（APS），以启动凝胶聚合反应，再反复倒置离心管数次以混匀。在离心使溶液聚集以确保均匀聚合后，向样品中加入4.5 µL的20%四甲基乙二胺（TEMED），以催化聚合反应。待样品完成混合和离心后，再用氮气对溶液脱气3至5分钟，以完成聚合过程并减少未反应的单体。
随后，将溶液在室温下孵育10分钟，以完成聚合反应，得到SA一聚合溶液。用冻干的SA二单链DNA重复前述步骤，向108微升的SA二溶液中分别加入45、18、4、0.5和4.5微升的丙烯酰胺、T-B-E-A-P-S和teed。为制备L二、R二及对照溶液，离心、冻干单链DNA，并按照前述方法向相应的冻干单链DNA中加入如下体积的TE缓冲液，加热溶液至完全溶解，用于凝胶溶液的制备。
将SA1和SA2聚合溶液在70摄氏度下加热约一分钟，直至溶液黏度降低。取10微升（或10份）SA1聚合溶液加入到10微升（或10份）SA2聚合溶液中。
然后，将SA一和SA二聚合溶液混合，交替进行以下操作：在70摄氏度下加热15秒，再用移液枪头搅拌15秒，总时长为1分钟。混合时加入六微升或六份100% L二溶液，以形成100%凝胶。样品按上述方法混合后，用移液枪将100%凝胶转移至60毫米的培养皿中，并在最佳退火温度下加热1小时。
接下来，将凝胶在室温下孵育4小时，使DNA交联继续复性。孵育结束后，在室温下用含有钙和镁的PBS覆盖凝胶过夜，从培养皿中移除剩余缓冲液，并将凝胶转移至微量离心管中。此时，将100%的凝胶在70摄氏度加热约30秒，或加热至凝胶黏度降低为止。
移液操作时，将玻璃盖玻片放置于70摄氏度的加热块上，加热1至2分钟。在每片玻璃盖玻片上加入一滴光学胶。然后在每片玻璃盖玻片上加入20 µL的100%凝胶，使其融化并均匀铺展。
从热块中取出每个含有凝胶的玻璃容器，并将其放入24孔组织培养板中。用365纳米的紫外光照射凝胶15分钟。在最佳肛温下加热凝胶1小时，并让DNA交联复性4小时后，向其中加入PBS。
然后在 4 摄氏度下将凝胶孵育过夜。孵育结束后，用移液器小心吸出孔道中的缓冲液，注意不要吸走凝胶。随后加入磺胺萨帕溶液，使每块凝胶完全被覆盖。
将凝胶在365纳米紫外光下照射15分钟后，移除磺胺SAMP。用PBS冲洗凝胶一次，以去除多余的磺胺SAMP；重复前述步骤后，将凝胶在约300微升、浓度为0.2毫克/毫升的多聚赖氨酸溶液中，4摄氏度下孵育过夜。孵育结束后，用PBS洗涤凝胶两次，每次5分钟，以去除多余的多聚赖氨酸，然后加入培养基。凝胶在培养基中孵育30分钟后，在进行细胞接种用于细胞培养和成像之前，立即移除培养基。
在硬化凝胶上培养的成纤维细胞，其长宽比未发生改变，但投影面积大于在100%凝胶上培养的成纤维细胞。在100%凝胶上培养的成纤维细胞比在80%凝胶上培养的成纤维细胞具有更小的投影面积和更大的长宽比。这些结果表明，成纤维细胞的行为依赖于微环境的动态特性。
在软化凝胶上培养的神经元，其初级树突数量和轴突长度没有差异，但初级树突长度短于在50%凝胶上培养的神经元。与成纤维细胞研究类似，在静态凝胶上的神经表型不同于在动态凝胶上的神经表型。在50%凝胶上培养的神经元比在100%凝胶上培养的神经元具有更少的初级树突和更长的轴突。
在尝试本实验步骤时，必须牢记准确移取黏稠凝胶的重要性，因为凝胶浓度对于避免凝胶破裂至关重要；准确移液可能需要多次尝试，本方案的讨论部分提供了其他几种可选方法。
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概述
本文介绍了DNA交联聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法，该水凝胶可用于调节组织刚度，以研究其对细胞功能的影响。文中提供了详细的操作步骤和示意图，供研究人员重复该实验过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物材料
- 细胞生物学
- 组织工程
背景
- 理解组织刚度对于细胞功能至关重要。
- 水凝胶可模拟天然组织的力学特性。
- DNA交联提供了一种动态调节水凝胶性能的方法。
- 以往研究已表明刚度对细胞行为的影响。
研究目的
- 开发一种易于修饰的水凝胶体系。
- 研究刚度变化如何影响细胞行为。
- 提供详细的实验方法以重复水凝胶的制备过程。
使用的方法
- 将冻干组分在缓冲液中重悬。
- 聚合溶液以形成聚丙烯酰胺骨架。
- 通过混合聚合溶液制备DNA凝胶。
- 对凝胶进行功能化处理，用于细胞接种及弹性调控。
主要结果
- 成功制备了DNA交联水凝胶。
- 展示了调控凝胶刚度的能力。
- 提供了可用于进一步研究的实验方案。
- 阐明了刚度与细胞功能之间的关系。
结论
- 所开发的水凝胶可用于研究细胞行为，具有多种用途。
- 调节刚度可为细胞响应提供深入见解。
- 该方法可应用于多种生物学研究领域。
常见问题
行业应用价值
细胞外基质刚度的动态调控是早期发现和临床前研究中的一个关键变量，直接影响基于细胞检测的预测可信度。DNA交联的聚丙烯酰胺水凝胶可实现对基底弹性可逆且无需外部刺激的控制，支持在与疾病相关的系统中进行机制性风险排除和靶点验证。该技术能力提高了体外模型在项目组合决策中的转化保真度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 通过在细胞接种后动态改变基质刚度，可验证力学生物学假设。
- 通过将细胞表型变化与可控的力学刺激相关联，支持功能靶点的验证。
- 通过区分静态与动态微环境效应，有助于降低生物学风险。
筛选与检测方法开发
- 制备经过验证且可调节的基底，用于可重复的基于细胞的检测。
- 标准化机械微环境，以提高检测的可比性和可扩展性。
- 实现对细胞形态和行为在定义的刚度变化下的定量读取。
转化与临床前研究
- 通过将体外模型与疾病相关的组织力学特性相匹配，提高转化研究的连续性。
- 通过模拟发育和病理过程中动态的组织环境，支持基于风险评估的推进策略。
- 为评估力敏感性生物标志物和表型提供平台。
流程与工作流整合
该水凝胶系统整合了从早期发现到临床前验证的全过程，架起了静态与动态力学生物学研究之间的桥梁。
- 发现生物学： 可在细胞功能和疾病建模中对基质弹性作用进行假设验证。
- 筛选： 提供可调式、即用型检测底物，适用于化合物或基因扰动研究。
- 分析： 在可控力学条件下，提供细胞形态和行为的定量测量。
- 转化研究： 促进体外研究结果与体内组织力学的对接，用于生物标志物和表型验证。
- 企业级复用： 提供可重复使用的平台，可适配多种细胞类型和力学生物学问题。
运营与企业影响
- 科学价值：提高基于细胞模型的预测置信度，并减少机制上的模糊性。
- 操作价值：增强力生物学检测的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过提供动态且与疾病相关的检测条件，改善决策中的“推进/终止”判断。
- 项目影响：支持基于风险调整的力敏感靶点优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备水凝胶化学方面的专业知识，以及对粘稠材料进行精确移液的操作技能。
- 需要具备标准聚合反应和细胞培养仪器的使用条件。
- 要求跨团队对凝胶制备和功能化方案进行标准化。
- 可适用于多种细胞类型，但可能需要针对特定模型进行优化。
- 精确的浓度控制至关重要，以避免凝胶破裂并确保实验可重复性。
